一种编码木糖转运蛋白的核酸分子及其编码的木糖转运蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种编码木糖转运蛋白的核酸分子及其编码的木糖转运蛋白，以及表达该木糖专一性转运蛋白的宿主细胞。实验证明本发明提供的木糖转运蛋白对木糖的运输能力和酿酒酵母高效內源转运蛋白Gal2p的水平相当。该蛋白专一性的向酿酒酵母中运输木糖而不运输葡萄糖，并且其对木糖的运输不受葡萄糖的抑制。提示表达该转运蛋白将有利于在葡萄糖木糖共发酵时提高木糖运输的能力，为木糖转运蛋白在酶工程、基因工程、代谢工程以及合成生物学【技术领域】的应用开拓了空间。
【专利说明】-种编码木糖转运蛋白的核酸分子及其编码的木糖转运蛋 白
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种编码木糖转运蛋白的核酸分子及其编码的木糖转运蛋白，以及所 述木糖转运蛋白在酶工程、基因工程、代谢工程以及合成生物学【技术领域】的应用。本发明还 涉及表达该木糖转运蛋白的宿主细胞以及该宿主细胞在生产中的应用。
【背景技术】
[0002] 种类繁多的木质纤维素资源年产量巨大，其中包括大量农林加工剩余物，其综合 利用既可带来经济效益，又能够减少因焚烧等不当处理引起的环境污染。在木质纤维素 原料中木糖组分含量高达30%左右，仅次于葡萄糖组分，对其进行综合利用可以显著提 高原料利用率。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)是广泛用于食品和工业生产的 微生物，其具有鲁棒性强、代谢旺盛以及食品级安全等特性。野生型酿酒酵母不能利用木 糖，但能利用其异构体--木酮糖。通过基因工程手段，在酿酒酵母中同时表达木糖还原 酶和木糖醇脱氢酶，或者单独表达木糖异构酶可以赋予酿酒酵母将木糖转化为木酮糖的能 力，进而通过相关代谢途径涉及的酶的优化表达，可以获得能够将木糖转化为各种目标产 品的细胞工厂（Van Vleet J H and Jeffries T ff. Yeast metabolic engineering for hemicellulosic ethanol production. Curr Opin Biotech,2009,20:300-306.)〇
[0003] 木糖向酿酒酵母细胞内的运输是木糖被利用的第一步。高水平表达糖转运蛋 白可以促进酿酒酵母对木糖的吸收。酿酒酵母没有专门的木糖转运蛋白，其对木糖的吸 收依赖于己糖转运蛋白，但是这些非特异性的转运蛋白对木糖的运输受到葡萄糖强烈的 竞争性抑制，从而影响了菌株在有葡萄糖环境下的木糖利用效率（Subtil T and Boles E. Competition between pentoses and glucose during uptake and catabolism in recombinant Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Biofuels，2012, 5:14) 〇 虽然近期 Farwick等设计了基于生长现象的筛选系统，筛选多个免除葡萄糖抑制的木糖运输蛋白，利 用该系统，虽然筛选获得了只运输木糖而不运输葡萄糖，并且木糖运输不受葡萄糖存在抑 制的酿酒酵母内源糖转运蛋白Gal2p突变子Gal2p-N376F，但是该突变子的木糖运输能力 仅为野生型Gal2p木糖运输能力的一半左右（Farwick A，et al. Engineering of yeast hexose transporters to transport D-xylose without inhibition by D-glucose. P Natl Acad Sci USA，2014,111:5159-5164.)。而另一方面，自然界中存在多种天然可 利用木糖的微生物，从这些微生物中克隆木糖转运蛋白也是科研工作者努力的一个方向。 例如，表达Candida intermedia的Gxflp提高了酿酒酵母菌株在低浓度木糖条件下提 高菌株的木糖代谢能力（Leandro M J，et al. Two glucose/xylose transporter genes from the yeast Candida intermedia:first molecular characterization of a yeast xylose-H+symporter. Biochem J，2006,395:543-549 ;Runquist D，et al. Expression of the Gxfl transporter from Candida intermedia improves fermentation performance in recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae.Appl Microbiol Biot, 2009, 82:123-130.);表达 SchefTersomyces (Pichia) stipitis 的 Sutlp 提高了菌 株在葡萄糖和木糖共发酵阶段的乙醇产量（Katahira S，et al. Improvement of ethanol productivity during xylose and glucose co-fermentation by xylose-assimilating S.cerevisiae via expression of glucose transporter Sutl.Enzyme Microb Tech, 2008, 43:115-119.);表达 Arabidopsis thaliana 的 At5g59250p 和 At5gl7010p 使 菌株木糖的转运速率和消耗速率分别提高46%和40% (Hector R E，et al. Expression of a heterologous xylose transporter in a Saccharomyces cerevisiae strain engineered to utilize xylose improves aerobic xylose consumption. Appl Microbiol Biot，2008, 80:675-684.)。但是，这些蛋白都能够同时运输葡萄糖，木糖运输仍然受到影 口向。此夕卜，有石开究显不，Trichosporon cutaneum(Hu C, et al. Simultaneous utilization of glucose and xylose for lipid production by Trichosporon cutaneum. Biotechnol Biofuels, 2011, 4:25.)和Meyerozyma guilliermondii菌株在发酵过程中呈现出较好的 葡萄糖木糖同步利用特性，有望成为高效木糖转运蛋白来源。
【发明内容】
[0004] 针对上述现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种编码木糖转运蛋白的 核酸分子及其编码的木糖转运蛋白，以及表达该木糖专一性转运蛋白的宿主细胞。
[0005] 本发明所述编码木糖转运蛋白的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列为以下序 列之一：
[0006] (I) SEQ ID NO. 1所不的核苷酸序列，该序列为Genebank中GeneID: 5124182的突 变体，其1078-1080位核苷酸由AAT突变为TTC ;
[0007] (2)由于遗传密码子的简并性区别于⑴的核苷酸序列的核苷酸序列；
[0008] (3)与⑴所示的核苷酸序列至少80%同源的序列，并且其相应于（1) 1078-1080 位的核苷酸为TTC ;
[0009] (4)由于遗传密码子的简并性区别于（3)所述的核苷酸序列的核苷酸序列。
[0010] 上述编码木糖转运蛋白的核酸分子，其核苷酸序列优选SEQ ID NO. 1所示的核苷 酸序列，该核酸分子命名为MGT05196 (N360F)。
[0011] 本发明所述的木糖转运蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为以下序列之一：
[0012] (I) SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，该序列为Genebank中蛋白protein_id = 1卩_001482176· Γ的点突变体，其360位的氨基酸残基由protein_id = 〃ΧΡ_001482176· Γ 的谷氨酰胺（N)突变为苯丙氨酸（F)。
[0013] ⑵与⑴所示的氨基酸序列至少有80%的同源性，并且其与SEQ ID Ν0.2所示 的氨基酸序列360位相应的氨基酸残基为苯丙氨酸残基。
[0014] 本发明所述编码木糖转运蛋白的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列，其序列不包 括已公开的编码protein_id = 〃ΧΡ_001482176· Γ的序列，也不包括编码和SEQ ID NO. 2 所示的氨基酸序列具有至少80%的同源性但相当于SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的360 位不是苯丙氨酸（F)的序列。
[0015] 上述木糖转运蛋白，其氨基酸序列优选SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，该氨基酸 序列命名为 Mgt05196p(N360F)。
[0016] 一种重组载体，其含有上述编码木糖转运蛋白的核酸分子的完整编码阅读框序 列。
[0017] 其中：所述重组载体优选是重组质粒pJFE3-MGT05196 (N360F)。
[0018] 一种表达木糖转运蛋白的宿主细胞，其为细菌、酵母或丝状真菌，该宿主细胞内含 有上述编码木糖转运蛋白的核酸分子的完整编码阅读框序列或重组载体。
[0019] 其中：所述宿主细胞优选酿酒酵母BSW4M51X(N360F)。
[0020] 本发明所述的木糖转运蛋白在利用含有木糖的原料生产木糖醇、乙醇、多元醇、有 机酸、烃类或萜类化合物中的应用。
[0021] 本发明公开了一种编码木糖转运蛋白的核酸分子及其编码的木糖转运蛋白，以及 表达该木糖专一性转运蛋白的宿主细胞。实验证明本发明提供的木糖转运蛋白对木糖的运 输能力和酿酒酵母高效内源转运蛋白Gal2p的水平相当。该蛋白专一性的向酿酒酵母中运 输木糖而不运输葡萄糖，并且其对木糖的运输不受葡萄糖的抑制。提示表达该转运蛋白将 有利于在葡萄糖木糖共发酵时提高木糖运输的能力，为木糖转运蛋白在酶工程、基因工程、 代谢工程以及合成生物学【技术领域】的应用开拓了空间。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1 :重组质粒pJFE3-MGT05196 (N360F)物理图谱。该重组质粒为酿酒酵母2 μ质 粒，MGT05196(N360)基因在酿酒酵母组成型启动子TEFl启动子控制下表达。
[0023] 图2 :表达不同转运蛋白的菌株在木糖中孵育体内木糖积累量分析。
[0024] 图3 :重组菌株在麦芽糖和葡萄糖上的生长。
[0025] 图4 :菌株BSW4M51X(N360F)在不同碳源上的生长特征分析。菌株 BSW4M51X(N360F)在添加不同碳源的SC-URA营养缺陷型培养基中的生长特征。
[0026] 其中，?为添加了 20g/L木糖，?为添加了 20g/L葡萄糖，为添加了 20g/L木糖 加10g/L葡萄糖，▲为添加了 20g/L木糖加20g/L葡萄糖。
【具体实施方式】
[0027] 酿酒酵母菌株 EBY. VW4000(MATa leu2-3, 112 ura3_52 trpl-289 his3_A 1 Mal2-8c SUC2hxtl7 Δ hxtl3 Δ ：：IoxP hxtl5 Δ ：：IoxP hxtl6 Δ ：：IoxP hxtl4 Δ ：：IoxP hxt12 Δ ：：IoxP hxt9 Δ ： ：IoxP hxt11Δ ： ：IoxP hxt10 Δ ： ：IoxP hxt8 Δ ：：IoxP hxt514::loxP hxt2A：：l〇xP hxt367Δ ：：IoxP gal2ΔstIIΔ ：：IoxP agtlA：：l〇xP ydl247w Δ ：：IoxP yjrl60cA ：:loxP)(Wieczorke R，et al.Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters，1999,464:123_128.)是一株缺失了所有内源 己糖转运蛋白的菌株（hxt null)，其因缺乏向胞内运输己糖的能力不能在葡萄糖上生长， 而只能在麦芽糖这种具有自身特异性运输蛋白的碳源底物上生长。在该菌株中表达糖转运 蛋白可以使菌株重新在葡萄糖上生长，其生长能力可以反映出所表达转运蛋白的葡萄糖运 输能力。将表达糖转运蛋白的EBY.VW4000在木糖中孵育一定时间，进而测定细胞内木糖和 木糖醇的总积累量，可以反映所表达转运蛋白对木糖的运输能力。当在EBY.VW4000中引入 木糖利用途径之后，菌株在木糖为唯一碳源上的生长能力可以反映转运蛋白对木糖的运输 能力。
[0028] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0029] 实施例1转运蛋白编码基因的克隆
[0030] 提取M. guilliermondii ATCC 6260染色体DNA作为模板，用全式金公司生产 的Fast Pfu聚合酶进行PCR扩增，采用重叠延伸法引入定点突变（Urban A，et al.A rapid and efficient method for site-directed mutagenesis using one-step overlap extension PCR. Nucleic acids research, 1997,25:2227-2228·)。用引物MGT05196-F 和MGT05196-N360F-R为引物，PCR扩增DNA片段MGT05196-up，其PCR扩增时选择的退火 温度优选为56 °C ;用引物MGT05196p-N360F-F和MGT05196-R为引物PCR扩增DNA片段 MGT05196-down，其PCR扩增时选择的退火温度优选为55°C。然后，以DNA片段MGT05196-up 和MGT05196-down互为引物和模板，进行无引物的重叠延伸，其退火温度优选为56°C。获得 的最终产物经DNA测序，证实为两端带有额外接头的SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，即基 因 MGT05196(N360F)。其 5' 端带有的额外接头序列为 5' -GCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAA AGGATCC-3'，其 3' 端带有的额外接头序列为 5' -CTCGAGGTCGACCTGCAGGATTGAATTGAATTGAAA T-3，。
[0031] 以M. guilliermondii ATCC 6260染色体DNA作为模板，MGT05196-F和MGT05196-R 为引物，PCR扩增带有额外接头的具体序列为Genebank中GeneID: 5124182所示的核苷酸 序列，即Mgt05196p编码基因 MGT05196,其PCR扩增时选择的退火温度优选为55°C。其5' 端带有的额外接头序列为5' -GCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAAAGGATCC-3'，其3'端带有的 额外接头序列为 5' -CTCGAGGTCGACCTGCAGGATTGAATTGAATTGAAAT-3'。
[0032] 其中，上述引物 MGT05196-F、MGT05196-R、MGT05196-N360F-R 和 MGT05196p-N360F-F 引物序列为：
[0033] MGT05196-F: 5 ' -GCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAAAGGATCCATGTCGTCGAATGAGCAGGTT ACTC-3，
[0034] MGT05196-R: 5J -ATTTCAATTCAATTCAATCCTGCAGGTCGACCTCGAGTCAAACCCTTTCGGCTTC GTCC-3'
[0035] MGT05196p-N360F-F:5, -GTTCTTGGTATAGTGTTCTTTGCATCCACTTTTG-3'
[0036] MGT05196-N360F-R: 5 ' -CAAAAGTGGATGCAAAGAACACTATACCAAGAAC-3 '
[0037] 实施例2构建Mgt05196p (N360F)表达质粒
[0038] 用BamH I和Xho I双酶切实施例1中获得的带有额外接头的MGT05196 (N360F) 基因 DNA片段，并将其连接到经BamH I和Sal I酶切的酿酒酵母2 μ质粒载体pJFE3 (Shen Υ, et al. An efficient xylose-fermenting recombinant Saccharomyces cerevisiae strain obtained through adaptive evolution and its global transcription profile. Appl Microbiol Biot, 2012, 96:1079-1091.)上。其中，连接体系中 BamH I 和 Xho I 双 酶切的带有额外接头的MGT05196 (N360F)基因 DNA片段和BamH I和Sal I酶切的质粒载 体PJFE3的浓度比为10:1?3:1。其优选浓度比为5:1。使用T4连接酶催化连接反应， 反应条件为16?25°C，1?4小时。其优选反应条件为16°C，4小时。连接反应液直接 转化大肠杆菌Trans5a Chemically Competent Cell (购自北京全式金生物技术有限公 司），在含有50 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中筛选转化子，未被转化的细胞不能在该平 板上生长。挑取单个克隆的转化子，用质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit I (购自Omega Bio-tek公司）提取转化子细胞中的质粒，电泳检测从各个转化子中提取的质粒，其中大小 为7765bp的质粒为正确的重组质粒，该重组质粒命名为pJFE3-MGT05196(N360F)，在该质 粒上，MGT05196(N360)基因在酿酒酵母组成型启动子TEFl启动子控制下表达（图1)。
[0039] 其中大肠杆菌转化按照Trans5 a Chemically Competent Cell (购自北京全式金 生物技术有限公司）说明书操作。
[0040] 其中，质粒提取按照质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit I (购自Omega Bio-tek 公司）说明书操作。
[0041] 用同样的方法，带有额外接头的MGT05196基因 DNA片段也用BamH I和Xho I双酶 切，并连接到经BamH I和Sal I酶切的质粒pJFE3上。正确的重组质粒大小也为7765bp， 该质粒命名为PJFE3-MGT05196。
[0042] 实施例3在酿酒酵母中表达转运蛋白
[0043] 用空载体质粒pJFE3转化酿酒酵母菌株EBY. VW4000，在添加20g/L麦芽糖的 SC-URA营养缺陷型培养基平板上筛选转化子，未被转化的细胞不能在该平板上生长。获得 的转化子命名为BSW4PP。
[0044] 将重组质粒 pJFE3_GAL2(Wang C, et al. Improvement of L-arabinose fermentation by modifying the metabolic pathway and transport in Saccharomyces cerevisiae. BioMed Research International, 2〇l3, 46l2〇4·)转化菌株EBY. VMOOO,在添 加20g/L麦芽糖的SC-URA营养缺陷型培养基平板上筛选转化子，未被转化的细胞不能在该 平板上生长。获得的转化子命名为BSW4PG。
[0045] 将重组质粒PJFE3-MGT05196转化菌株EBY. VW4000,在添加20g/L麦芽糖的 SC-URA营养缺陷型培养基平板上筛选转化子，未被转化的细胞不能在该平板上生长。获得 的转化子命名为BSW4M51。
[0046] 将重组质粒pJFE3-MGT05196 (N360F)转化菌株EBY. VW4000,在添加20g/L麦芽糖 的SC-URA营养缺陷型培养基平板上筛选转化子，未被转化的细胞不能在该平板上生长。获 得的转化子命名为BSW4M51 (N360F)。
[0047] 其中，酿酒酵母转化使用PEG/LiAc诱导的化学转化方法（房志家，等。酿酒酵母 转化方法的新探索。《实验室研究与探索》2012年04期）。
[0048] 其中，SC-URA营养缺陷培养基中含有I. 7g/L YNB (酵母基础氮源，购自上海生工 生物工程股份有限公司），5g/L硫酸铵，0.77g/L SC-URA(购自MP Biomedicals);固体培养 基另外添加20g/L琼脂粉，pH调为6. 0?7. 0 ;灭菌条件：115°C，30min ;使用时添加终浓度 为20g/L的麦芽糖作为碳源。
[0049] 实施例4木糖积累量法比较运输蛋白的木糖运输能力
[0050] 在添加20g/L麦芽糖的SC-URA营养缺陷型培养基中于30°C下培养菌株BSWPP、 BSW4PG、BSW4M51和BSW4M51 (N360F)，12小时后转接培养物到新鲜的添加20g/L麦芽糖的 SC-URA营养缺陷型培养基中，转接量为10%。于30°C下继续培养10小时后，8000转离心3 分钟收集菌体。然后将细胞重悬于添加20g/L木糖的SC-URA营养缺陷型培养基中。调节菌 株 BSWPP、BSW4PG、BSW4M51 和 BSW4M51 (N360F)的菌悬液 OD6tltl -致，优选 OD6tltl 均等于 5,至 于30°C孵育。在孵育30min, 60min和120min时，分别取各菌株IOmL菌悬液，8000转离心 3分钟，弃上清。用IOmL温度为4°C的无菌水洗菌泥两次。洗的方法是用IOmL温度为4°C 的无菌水重悬细胞，然后8000转离心3分钟,弃上清。洗过的细胞重悬于3mL去离子水中， 于37°C培养箱中过夜放置后离心，用HPLC测定上清液中的木糖和木糖醇含量，根据其中木 糖和木糖醇总含量的摩尔数，计算菌体细胞吸收的木糖总量（Du J，et al. Discovery and characterization of novel D-xylose-specific transporters from Neurospora crassa and Pichia stipitis. Mol Biosyst，2010, 6:2150-2156.) ?用分光光度计 BioPhotometer plus(购自Eppendorf，德国）测定菌悬液的0D6。。，并根据公式：细胞干重（mg/mL)= 0. 2365X0D600+0. 1149 (Wang C，et al. Improvement of L-arabinose fermentation by modifying the metabolic pathway and transport in Saccharomyces cerevisiae. BioMed Research International, 2013, 461204·)，将细胞量换算为菌体干重。糖的转运能 力用单位菌体细胞吸收的木糖总量来表示，其计量单位为mg/g DCW。结果显示，菌株BSWPP 样品仅测到极少量的木糖吸收，而菌株BSW4PG、BSW4M51和BSW4M51 (N360F)吸收的木糖量 没有明显差异（图2)。该结果表明，转运蛋白Mgt05196p及Mgt05196p (N360F)具有和Gal2p 相当的木糖运输能力。
[0051] 实施例5生长法比较转运蛋白运输葡萄糖的能力
[0052] 在添加20g/L麦芽糖的SC-URA营养缺陷型培养基中于30°C下培养菌株BSWPP、 BSW4PG、BSW4M51和BSW4M51 (N360F)，12小时后转接培养物到新鲜的添加20g/L麦芽糖 的SC-URA营养缺陷型培养基中，转接量为10%。于30°C下继续培养12小时后8000转离 心3分钟收集菌体。然后用无菌双蒸水洗涤2次后重悬于无菌双蒸水中，30°C培养9小时 以消耗体内残留的碳源。之后，重新收集菌体并重悬与双蒸水中，调节菌悬液〇D_为1， 并对该菌悬液进行十倍梯度稀释。将稀释的细胞点滴在分别添加20g/L麦芽糖和葡萄糖 的SC-URA营养缺陷型培养基平板上，每个点为4μ 1菌悬液，30°C下培养5天后观察。结 果显示,菌株BSW4PG和BSW4M51可以在葡萄糖上生长而菌株BSWPP和BSW4M51 (N360F)不 能在葡萄糖上生长（图3)。该结果表明转运蛋白Gal2p和Mgt05196p能够运输葡萄糖，而 Mgt05196p(N360F)不能运输葡萄糖。
[0053] 实施例6在表达转运蛋白的酿酒酵母中构建木糖代谢途径
[0054] 利用前期工作构建的带有木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶基因的 整合型质粒 pYMIK_xyl27(Wang Y，et al. Establishment of a xylose metabolic pathway in an industrial strain of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology letters，2004, 26, 885-890.)，在酿酒酵母中构建木糖代谢途径。用限制性内切酶ApaI酶 切质粒pYMIK-xyl27,获得线性化的pYMIK-xyl27。用线性化的pYMIK-xyl27转化转化菌株 BSW4M51 (N360F)。在含有200mg/L抗生素 G418 (购自Promega)的添加终浓度为20g/L麦芽 糖的SC-URA营养缺陷型培养基平板上筛选转化子，未被转化的细胞不能在该平板上生长。 获得的重组菌株带有木糖代谢途径，该菌株命名为BSW4M51X(N360F)。
[0055] 其中，酿酒酵母转化使用PEG/LiAc诱导的化学转化方法（房志家，等。酿酒酵母 转化方法的新探索。《实验室研究与探索》2012年04期）。
[0056] 其中，SC-URA营养缺陷培养基中含有I. 7g/L YNB (酵母基础氮源，购自上海生工 生物工程股份有限公司），5g/L硫酸铵，0.77g/L SC-URA(购自MP Biomedicals);固体培养 基另外添加 20g/L琼脂粉，pH调为6. 0?7. 0 ;灭菌条件：115°C，30min ;使用时添加终浓度 为20g/L的麦芽糖作为碳源，添加终浓度为200mg/L的抗生素 G418作为筛选压力。
[0057] 实施例7表达转运蛋白Mgt05196p (N360F)和木糖代谢途径的重组菌株在不同碳 源上的生长特征分析
[0058] 在添加20g/L麦芽糖的SC-URA营养缺陷型培养基中30°C下培养12小时的菌 株BSW4M51(N360F)细胞，转接到20g/L麦芽糖的SC-URA营养缺陷型培养基中，转接量为 10%。转接后的BSW4M51(N360F)细胞，于30°C下再培养12小时后，8000转离心3分钟 收集菌体作为种子。将该种子分别接种到添加了 20g/L木糖、20g/L葡萄糖、20g/L木糖 加10g/L葡萄糖，以及20g/L木糖加20g/L葡萄糖的SC-URA营养缺陷型培养基中，初始 接种量为〇D_等于1。30°C下培养并定时测定培养物0D_的增长。结果显示（图4)，表 达Mgt05196p(N360F)的重组菌株BSW4M51X(N360F)可以利用木糖上生长，但不能利用葡 萄糖上生长，并且，该菌株在木糖上的生长不受葡萄糖存在的抑制。该结果表明，转运蛋白 Mgt05196p (N360F)只转运木糖不转运葡萄糖，并且其对木糖的转运不受葡萄糖的抑制。
【权利要求】
1. 一种编码木糖转运蛋白的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列为以下序列之一： (1) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，该序列为Genebank中GeneID:5124182的突变体， 其1078-1080位核苷酸由AAT突变为TTC ; (2) 由于遗传密码子的简并性区别于（1)的核苷酸序列的核苷酸序列； ⑶与⑴所示的核苷酸序列至少80%同源的序列，并且其相应于（1) 1078-1080位的 核苷酸为TTC ; (4)由于遗传密码子的简并性区别于（3)所述的核苷酸序列的核苷酸序列。
2. 如权利要求1所述的编码木糖转运蛋白的核酸分子，其特征在于，所述编码 木糖转运蛋白的核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，该核酸分子命名为 MGT05196(N360F)。
3. -种木糖转运蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为以下序列之一： (1) SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，该序列为Genebank中蛋白protein_id = 1卩_001482176· Γ的点突变体，其360位的氨基酸残基由protein_id = 〃ΧΡ_001482176· Γ 的谷氨酰胺（Ν)突变为苯丙氨酸（F)。 (2) 与（1)所示的氨基酸序列至少有80%的同源性，并且其与SEQ ID N0.2所示的氨 基酸序列360位相应的氨基酸残基为苯丙氨酸残基。
4. 如权利要求3所述的木糖转运蛋白，其特征在于，所述木糖转运蛋白的氨基酸序列 为SEQ ID勵.2所示的氨基酸序列，该氨基酸序列命名为1%切5196?(吧6(^)。
5. -种重组载体，其特征在于：所述重组载体含有权利要求1或2所述的编码木糖转 运蛋白的核酸分子的完整编码阅读框序列。
6. 如权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是重组质粒 PJFE3-MGT05196(N360F)。
7. -种表达木糖转运蛋白的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为细菌、酵母或丝 状真菌，该宿主细胞内含有权利要求1所述的核苷酸序列或权利要求5所述的重组载体。
8. 如权利要求7所述的表达木糖转运蛋白的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为 酿酒酵母 BSW4M51X(N360F)。
9. 权利要求3或4所述的木糖转运蛋白在利用含有木糖的原料生产木糖醇、乙醇、多元 醇、有机酸、烃类或萜类化合物中的应用。
【文档编号】C12N15/63GK104263739SQ201410526356
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月8日 优先权日:2014年10月8日
【发明者】沈煜, 鲍晓明, 侯进, 汪城墙 申请人:山东大学