一种分离可代谢粗榧生物碱菌株的方法
【专利摘要】本发明属于植物内生菌分离与微生物发酵工程领域，具体涉及一种分离可代谢粗榧生物碱菌株的方法。通过选取多年生粗榧的根、茎、叶作为外植体，经切条、灭菌后放入培养基中培养使其长出粗榧共生菌，然后对粗榧共生菌按照菌种不同进行分离并分别培养发酵，将发酵液浓缩后进行检测以确定其是否为可代谢粗榧生物碱菌株。本发明在发酵液的制备过程中待菌种产生代谢生物后再接入第二批菌种，利用前批菌种产生的代谢产物为第二批菌种提供营养物质，大大促进了第二批菌种的生长，同时提高了其生物活性，从而产生大量发酵液，在便于菌种筛选的同时提高其准确性。
【专利说明】一种分离可代谢粗榧生物碱菌株的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物内生菌分离与微生物发酵工程领域，具体涉及一种分离可代谢粗榧生物碱菌株的方法。
【背景技术】
[0002]粗榧是我国特有的一种植物，具有很高的营养价值和经济价值，粗榧生物碱是粗榧的重要有效成分之一，具有防癌等功效，常用于药物中。目前粗榧资源稀少，且该树种生长缓慢，粗榧生物碱产量低下，难以满足人们的生活需求，同时也造成了涉及粗榧生物碱类药物的价格昂贵。因此提高粗榧生物碱的产量成为人们长久以来的渴望。
[0003]生物发酵工程是20世纪70年代初开始兴起的一门新兴的综合性应用学科，通过利用微生物发酵可以实现代谢产物的大规模生产。因此找到一种快速、准确分离可代谢粗榧生物碱的菌株，再通过生物发酵获得大量粗榧生物碱成为研究的热点。
【发明内容】
[0004]本发明目的的是提供一种分离可代谢粗榧生物碱菌株的方法，能够快速、准确的分离出可代谢粗榧生物碱的菌株。
[0005]本发明所采取的技术方案是，一种分离可代谢粗榧生物碱菌株的方法，选取多年生粗榧的根、茎、叶作为外植体，经切条、灭菌后放入培养基中培养使其长出粗榧共生菌，然后对粗榧共生菌按照菌种不同进行分离并分别培养发酵，将发酵液浓缩后进行检测以确定其是否为可代谢粗榧生物碱菌株，所述培养发酵的具体操作方法为将粗榧共生菌活化后放入温度为26°C的环境中培养48h，根据不同菌种的菌落特征鉴定出各菌种，再将各菌种分别接种到装有PDA培养基的培养皿上培养，待菌种产生代谢生物1-2天后接入第二批菌种，以促进第二批菌种的生长，第二批接种的菌种长出后接种到装有发酵培养基的摇瓶内，然后把摇瓶放入转速为200r/min、温度为28°C的摇床上培养5d,收集各菌种的发酵液即可；
所述发酵液浓缩的具体操作方法为将各菌种的发酵液分别放入转速为10000r/min的冷冻高速离心机中离心，收集上清液，把上清液放入转速为10000r/min的冷冻高速离心机中再次离心，然后把再次离心后的上清液放入温度为40-50°C、压强为0.05Mpa的旋转蒸发仪中浓缩至原体积的十分之一，再将各菌种的浓缩液分别放入温度为4°C的冰箱内即可。
[0006]所述摇瓶内发酵培养基由土豆汁、葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、MgS04、KH2P04和水制成，且各组分的质量百分比为土豆汁2%，葡萄糖2%，蛋白胨0.12%，可溶性淀粉1%，MgS040.05%，KH2P04 0.15%，余量为水，培养基的pH=7 ；
所述土豆汁由组分A和组分B按照10:1的重量比混合后放入旋转蒸发仪中浓缩至原体积的三分之一后制得，所述组分A是将土豆切碎后放入温度为95-100°C的锅中蒸煮20-30min，取出后过100-200目筛，收集滤液制得；所述组分B是将土豆切碎后放入榨汁机中压榨，再把榨汁过80-100目筛，收集滤液制得。
[0007]有益效果一、本发明在发酵液的制备过程中待菌种产生代谢生物后再接入第二批菌种，利用前批菌种产生的代谢产物为第二批菌种提供营养物质，大大促进了第二批菌种的生长，同时提高了其生物活性，从而产生大量发酵液，在便于菌种筛选的同时提高其准确性。
[0008]二、本发明通过将发酵液离心，取出上清液后再次离心，然后进行浓缩，消除了筛选过程中的不利因素，使得筛选结果高效、准确。
[0009]三、通过将第二批菌种接种到本发明的发酵培养基上进行培养，使得菌种生长迅速，代谢旺盛，缩短了筛选所需的时间，且大大提高了发酵液的产量，便于菌种的筛选。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为本发明筛选过程中培养的没有分生孢子的菌丝；
图2为本发明筛选过程中培养的有分生孢子的菌丝。
【具体实施方式】
[0011]一种分离可代谢粗榧生物碱菌株的方法，选取多年生粗榧的根、茎、叶作为外植体，经切条、灭菌后放入培养基中培养使其长出粗榧共生菌，然后对粗榧共生菌按照菌种不同进行分离并分别培养发酵，将发酵液浓缩后进行检测以确定其是否为可代谢粗榧生物碱菌株，所述培养发酵的具体操作方法为将粗榧共生菌活化后放入温度为26°C的环境中培养48h，根据不同菌种的菌落特征鉴定出各菌种，再将各菌种分别接种到装有PDA培养基的培养皿上培养，待菌种产生代谢生物1-2天后接入第二批菌种，以促进第二批菌种的生长，第二批接种的菌种长出后接种到装有发酵培养基的摇瓶内，然后把摇瓶放入转速为200r/min、温度为28°C的摇床上培养5d，收集各菌种的发酵液即可；
所述发酵液浓缩的具体操作方法为将各菌种的发酵液分别放入转速为10000r/min的冷冻高速离心机中离心，收集上清液，把上清液放入转速为10000r/min的冷冻高速离心机中再次离心，然后把再次离心后的上清液放入温度为40-50°C、压强为0.05Mpa的旋转蒸发仪中浓缩至原体积的十分之一，再将各菌种的浓缩液分别放入温度为4°C的冰箱内即可。
[0012]所述摇瓶内发酵培养基由土豆汁、葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、MgS04、KH2P04和水制成，且各组分的质量百分比为土豆汁2%，葡萄糖2%，蛋白胨0.12%，可溶性淀粉1%，MgS040.05%，ΚΗ2Ρ04 0.15%，余量为水，培养基的pH=7 ；
所述土豆汁由组分A和组分B按照10:1的重量比混合后放入旋转蒸发仪中浓缩至原体积的三分之一后制得，所述组分A是将土豆切碎后放入温度为95-100°C的锅中蒸煮20-30min，取出后过100-200目筛，收集滤液制得；所述组分B是将土豆切碎后放入榨汁机中压榨，再把榨汁过80-100目筛，收集滤液制得。
[0013]实施例1
一种分离可代谢粗榧生物碱菌株的方法，包括以下步骤:
步骤一、外植体的选择和处理
选取多年生粗榧的根、茎、叶作为外植体，用流水将外植体清洗干净，再将根切成长为5-6cm的长块，除去茎上的老皮和枝叶，备用；
步骤二、外植体的灭菌
将处理好的外植体放入超净工作台内，先用体积浓度为75%的酒精灭菌5min，再用质量浓度为0.1%的升汞灭菌12min，无菌水洗4遍后，把处理好的外植体放入无菌水中，备用；
步骤三、粗榧菌种的纯化分离
把灭菌后的外植体分别接入装有PDA培养基的培养瓶内，把接有外植体的培养瓶放置到温度为25°C的培养架上进行培养，待培养瓶中长出菌种后，从中分离出粗榧共生菌，备用；
步骤四、培养发酵
将粗榧共生菌活化后放入温度为26°C的环境中培养48h，根据不同菌种的菌落特征鉴定出各菌种，再将各菌种分别接种到装有PDA培养基的培养皿上培养，待菌种产生代谢生物1天后接入第二批菌种，以促进第二批菌种的生长，第二批接种的菌种长出后接种到装有发酵培养基的摇瓶内，然后把摇瓶放入转速为200r/min、温度为28°C的摇床上培养5d，收集各菌种的发酵液，备用；
步骤五、发酵液的浓缩
将各菌种的发酵液分别放入转速为10000r/min的冷冻高速离心机中离心，收集上清液，把上清液放入转速为10000r/min的冷冻高速离心机中再次离心，把再次离心后的上清液放入温度为40V、压强为0.05Mpa的旋转蒸发仪中浓缩至原体积的十分之一，再将各菌种的浓缩液分别放入温度为4°C的冰箱内，备用；
步骤六、筛选
向各菌种的浓缩液中分别加入NaOH溶液直至pH=8，析出混合物，用高效色谱分析仪检测混合物中是否有粗榧生物碱生成；若有粗榧生物碱生成，则该菌种可代谢粗榧生物碱，采用普通琼脂斜面保存法保存或温度为-20°C的甘油管内保存即可；若没有粗榧生物碱生成，则该菌种不可代谢粗榧生物碱。
[0014]步骤四所述摇瓶内发酵培养基由土豆汁、葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、MgS04、ΚΗ2Ρ04和水制成，且各组分的质量百分比为土豆汁2%，葡萄糖2%，蛋白胨0.12%，可溶性淀粉1%，MgS04 0.05%, MgS04、KH2P04 0.15%，余量为水，培养基的 pH=7 ；
所述土豆汁由组分A和组分B按照10:1的重量比混合后放入旋转蒸发仪中浓缩至原体积的三分之一后制得，所述组分A是将土豆切碎后放入温度为95°C的锅中蒸煮20min，取出后过100目筛，收集滤液制得；所述组分B是将土豆切碎后放入榨汁机中压榨，再把榨汁过80目筛，收集滤液制得。
[0015]实施例2
一种分离可代谢粗榧生物碱菌株的方法，包括以下步骤:
步骤一、外植体的选择和处理
选取多年生粗榧的根、茎、叶作为外植体，用流水将外植体清洗干净，再将根切成长为5-6cm的长块，除去茎上的老皮和枝叶，备用；
步骤二、外植体的灭菌
将处理好的外植体放入超净工作台内，先用体积浓度为75%的酒精灭菌5min，再用质量浓度为0.1%的升汞灭菌12min，无菌水洗5遍后，把处理好的外植体放入无菌水中，备用；
步骤三、粗榧菌种的纯化分离把灭菌后的外植体分别接入装有PDA培养基的培养瓶内，把接有外植体的培养瓶放置到温度为25°C的培养架上进行培养，待培养瓶中长出菌种后，从中分离出粗榧共生菌，备用；
步骤四、培养发酵
将粗榧共生菌活化后放入温度为26°C的环境中培养48h，根据不同菌种的菌落特征鉴定出各菌种，再将各菌种分别接种到装有PDA培养基的培养皿上培养，待菌种产生代谢生物2天后接入第二批菌种，以促进第二批菌种的生长，第二批接种的菌种长出后接种到装有发酵培养基的摇瓶内，然后把摇瓶放入转速为200r/min、温度为28°C的摇床上培养5d，收集各菌种的发酵液，备用；
步骤五、发酵液的浓缩
将各菌种的发酵液分别放入转速为10000r/min的冷冻高速离心机中离心，收集上清液，把上清液放入转速为10000r/min的冷冻高速离心机中再次离心，把再次离心后的上清液放入温度为50°C、压强为0.05Mpa的旋转蒸发仪中浓缩至原体积的十分之一，再将各菌种的浓缩液分别放入温度为4°C的冰箱内，备用；
步骤六、筛选
向各菌种的浓缩液中分别加入NaOH溶液直至pH=9，析出混合物，用高效色谱分析仪检测混合物中是否有粗榧生物碱生成；若有粗榧生物碱生成，则该菌种可代谢粗榧生物碱，采用普通琼脂斜面保存法保存或温度为-80°C的甘油管内保存即可；若没有粗榧生物碱生成，则该菌种不可代谢粗榧生物碱。
[0016]步骤四所述摇瓶内发酵培养基由土豆汁、葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、MgS04、ΚΗ2Ρ04和水制成，且各组分的质量百分比为土豆汁2%，葡萄糖2%，蛋白胨0.12%，可溶性淀粉1%，MgS04 0.05%, MgS04、KH2P04 0.15%，余量为水，培养基的 pH=7。
[0017]所述土豆汁由组分A和组分B按照10:1的重量比混合后放入旋转蒸发仪中浓缩至原体积的三分之一后制得，所述组分A是将土豆切碎后放入温度为100°C的锅中蒸煮30min，取出后过200目筛，收集滤液制得；所述组分B是将土豆切碎后放入榨汁机中压榨，再把榨汁过100目筛，收集滤液制得。
【权利要求】
1.一种分离可代谢粗榧生物碱菌株的方法，选取多年生粗榧的根、茎、叶作为外植体，经切条、灭菌后放入培养基中培养使其长出粗榧共生菌，然后对粗榧共生菌按照菌种不同进行分离并分别培养发酵，将发酵液浓缩后进行检测以确定其是否为可代谢粗榧生物碱菌株，其特征在于:所述培养发酵的具体操作方法为将粗榧共生菌活化后放入温度为26°c的环境中培养48h，根据不同菌种的菌落特征鉴定出各菌种，再将各菌种分别接种到装有PDA培养基的培养皿上培养，待菌种产生代谢生物1-2天后接入第二批菌种，以促进第二批菌种的生长，第二批接种的菌种长出后接种到装有发酵培养基的摇瓶内，然后把摇瓶放入转速为200r/min、温度为28°C的摇床上培养5d，收集各菌种的发酵液即可； 所述发酵液浓缩的具体操作方法为将各菌种的发酵液分别放入转速为10000r/min的冷冻高速离心机中离心，收集上清液，把上清液放入转速为10000r/min的冷冻高速离心机中再次离心，然后把再次离心后的上清液放入温度为40-50°C、压强为0.05Mpa的旋转蒸发仪中浓缩至原体积的十分之一，再将各菌种的浓缩液分别放入温度为4°C的冰箱内即可。
2.根据权利要求1所述的一种分离可代谢粗榧生物碱菌株的方法，其特征在于:所述摇瓶内发酵培养基由土豆汁、葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、MgSO4, KH2PO4和水制成，且各组分的质量百分比为土豆汁2%，葡萄糖2%，蛋白胨0.12%，可溶性淀粉1%，MgSO4 0.05%,KH2PO4 0.15%，余量为水，培养基的pH=7 ； 所述土豆汁由组分A和组分B按照10:1的重量比混合后放入旋转蒸发仪中浓缩至原体积的三分之一后制得，所述组分A是将土豆切碎后放入温度为95-100°C的锅中蒸煮20-30min，取出后过100-200目筛，收集滤液制得；所述组分B是将土豆切碎后放入榨汁机中压榨，再把榨汁过80-100目筛，收集滤液制得。
【文档编号】C12N1/00GK104357325SQ201410543328
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月15日 优先权日:2014年10月15日
【发明者】王祖华, 王安亭, 李永程, 杨瑞先, 黄向东, 王佳伟 申请人:洛阳理工学院