一株新型黑曲霉和其生产糖化酶的方法【专利摘要】本发明属于食品领域，公开了一种以黑曲霉(Aspergillusniger)为原始菌株，通过诱变与筛选获得的产耐热糖化酶的生产菌株的其制备方法与其产糖化酶方面的应用，并按此方法成功得到产耐热糖化酶生产菌株黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCCNo.8641，该菌株经发酵产得的糖化酶与原始菌株产得的糖化酶相比，催化底物的最适温度可提高至少10℃，即可达71℃，同时比酶活最高可达4219U/mL，高于黑曲霉(Aspergillusniger)原始菌种，在很大程度上降低了生产成本，具有一定的创新性，有较强的应用前景与开发意义。CGMCCNo.86412013.12.27【专利说明】一株新型黑曲霉和其生产糖化酶的方法【
技术领域：
】[0001]本发明属于食品领域,具体涉及一种以黑曲霉(Aspergillusniger)为原始菌株，通过紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)单独或协同诱变并经过筛选获得的产耐高温糖化酶的生产菌株-黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641,同时还涉及该菌株的制备方法以及利用该菌株生产耐高温糖化酶方面的应用。该菌株产得的糖化酶与原始菌株产得的糖化酶相比，在比酶活基本不变的情况下，催化底物淀粉的最适温度可提高至71°C，在很大程度上降低了生产成本，有较强的应用前景。【
背景技术：
】[0002]糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶[Glucoamylase，系统命名为淀粉α-1.4_葡聚糖葡萄糖水解酶，ct-1.4-Glucanglucohydrolase(EC.3.2.1.3)],是一种具有外切活性的酶,它能把淀粉、糊精、糖原等从非还原性末端水解α-1.4-葡萄糖苷键，而得到终产物β-D-葡萄糖，也能缓慢水解α-1.6-葡萄糖苷键，转化为葡萄糖，是淀粉转化为葡萄糖过程中的关键酶之一[1_2]。糖化酶具有重要商业价值，凡对淀粉、糊精、低聚糖进行酶水解的工业上，都可适用。糖化酶分布很广，植物、动物、微生物中都存在，在工业中应用的糖化酶主要从曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)等丝状真菌和酵母属(Saccharmyces)中获得，已报道的产糖化酶真菌微生物有23个属35个种。但目前工业化生产的酶制剂多来自于曲霉和根霉，这些酶被食品和药物管理中心(FDA)认定为是安全的[3]。[0003]我国的这种酶制剂市场主要被国外著名酶制剂公司丹麦诺维信和美国杰能科公司的产品占领，导致使用该酶制剂的企业主要依赖进口，不但形成了国外公司技术垄断的局面，而且由于进口酶制剂价格高导致生产成本大幅度上升。因此，开发具有自主知识产权的、低成本高效能的糖化酶已成为我国玉米深加工产业的当务之急。现阶段国内外使用的糖化酶不仅被国际大公司垄断，从技术角度来讲还都存在一定不足，即其耐热温度不高，致使其生产过程造成能源巨大浪费。在所有的玉米深加工过程中，其液化工艺中使用的第一步催化温度为90°C_95°C，进一步糖化过程将利用上步所得淀粉与糖化酶催化反应，得到还原性糖等产物，然而目前糖化酶的催化温度均在58-60°C，因而需要将第一步进行降温调节，这种反复的升温降温不仅浪费能源、损害设备，而且给生产带来了诸多难题。生产中糖化一般温度超过60°C，国产糖化酶活力会急剧下降，造成生产成本的显著升高，[4_5]。当前在实验室条件中，黑曲霉产糖化酶的催化活力一般为1000-2500U/mL，产糖化酶最适催化温度为58-60°C，本专利涉及诱变菌株黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641催化活力最高可达4219U/mL，产糖化酶最适催化温度为71°C，即在糖化酶催化比活力增高的情况下，使催化最适温度提高了至少10°C，一旦应用于实际生产，可在很大程度上节约了能源，降低了成本，提闻了生广效率。[0004]因此，为了尽快开发我国具有自用知识产权的专用酶制剂，推动我国玉米深加工产业的快速发展，拟进行耐高温糖化酶酶制剂的生产关键技术改造及产业化示范具有重大意义。又因为我国北方玉米种植广泛，因而采用现代高新技术开发化工等系列产品产业化高效生产技术是发展北方地区经济的可行之路。[0005]本项目采用紫外(UV)诱变和硫酸二乙酯(DES)协同或单独进行多轮诱变并筛选获得产耐高温糖化酶的黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641;采用生物统计优化技术建立以玉米淀粉为主要原料的黑曲霉发酵生产耐高温糖化酶的生产工艺。降低糖化酶的生产成本，降低玉米精深加工过程中对设备的损害，减少能源浪费，节约成本。本专利成果可以充分利用丰富的玉米资源，促进可再生资源产业的高效、优质、快速发展，能够满足玉米深加工生产企业需求，创造良好的经济效益和社会效益，具有较强的产业化优势和广阔的市场发展前景。【
发明内容】[0006]本发明的目的之一是以黑曲霉(Aspergillusniger)为原始菌株,通过紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)协同或单独诱变和筛选，获得产耐高温糖化酶的生产菌株，获得的菌株其分类命名为:黑曲霉(Aspergillusniger)UD9，已于2013年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为:CGMCC8641,故以下简称黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641。[0007]黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641,属于子囊菌亚门，丝孢目，丛梗孢科，黑曲霉种。黑曲霉壁厚而光滑，顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长有成串褐黑色的球状，直径2.5?4.0μm。分生孢子头球状，直径700?800μm,褐黑色。蔓延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色。分生孢子头褐黑色放射状，分生孢子梗长短不一。顶囊球形，双层小梗。是重要的发酵工业菌种。黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641在含淀粉培养基中生长良好，培养基pH4.0?6.5之间，培养温度28-35°C，最低相对湿度为88%，能引致水分较高的粮食霉变和其他工业器材霉变。其发酵产物之一糖化酶广泛用于食品化工等行业。[0008]本发明的目的之二是提供一种上述产耐高温糖化酶的生产菌株CGMCC8641的制备方法；该制备方法通过紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)协同或单独诱变和筛选，易于实施、简洁、高效。又通过黑曲霉液体培养基与黑曲霉种子培养基逐级培养，黑曲霉长势良好，易于发酵。[0009]本发明的目的之三是提供一种利用本发明获得的菌株一黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641，以玉米淀粉为碳源发酵生产耐高温糖化酶的方法。[0010]为了说明上述三项发明方法，本发明采取以下技术方案:[0011]I)原始菌株的培养与孢子悬浮液的制备；[0012]2)菌种诱变与筛选；[0013]3)黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641的培养；[0014]4)菌株发酵；[0015]5)产物纯化与浓缩；[0016]6)糖化酶理化性质分析。[0017]对于以上技术方案，具体步骤如下:[0018]步骤I)原始菌株的培养与孢子悬浮液的制备具体步骤为:从原始黑曲霉(Aspergillusniger)斜面培养基上挑取一接种环原始菌株,接种于黑曲霉液体培养基,在28-35°C条件下摇床培养35-60h，反复活化两次然后向三角瓶中加入玻璃珠，充分振荡，使孢子脱落并过滤，再将所得全部孢子转移到黑曲霉液体培养基，使孢子活化萌发，得到孢子浓度为107CFU/mL的孢子悬浮液。将所得孢子转移到相同液体培养基，在28_35°C条件下摇床培养20-35h。黑曲霉液体培养基的质量配比为:蔗糖3%、硝酸钠0.2%等，培养基的pH为4.0-6.5,高压灭菌。[0019]步骤2)菌种诱变与筛选的具体步骤为:原始菌株经上一步处理后，分别采用紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)单独诱变或协同诱变方法对原始菌种进行诱变，其中硫酸二乙酯(DES)诱变方法为取孢子悬浮2%的硫代硫酸钠溶液10-20ul终止反应。用无菌水做梯度稀释，按不同梯度稀释菌液，然后涂布培养皿平板，每个梯度各涂布至少10个培养皿平板，然后预热紫外灯和磁力搅拌器30min，取5-10mL孢子悬浮液放置于直径9cm的培养皿中，放入灭菌的磁力搅拌珠，打开磁力搅拌器，菌液均匀接受紫外线照射，诱变组分别梯度照射5-60min，之后在红光下做梯度稀释，每组分别取不同梯度的菌液涂布培养皿平板，每组每个梯度各涂布至少10个培养皿平板，另外，取原始菌株的菌液做空白对照组，稀释浓度，涂布方法同诱变组，所有培养皿平板28-35°C避光培养2-4天。每次用DNS法筛选得到发酵产糖化酶催化最适温度与最适温度下酶活力同时最高的菌株最为下一轮诱变的出发菌株，再次诱变筛选，反复多轮，直至诱变筛选出酶活力与最适温度同时最高的-黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641。[0020]步骤3)黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641的培养的具体步骤为:选择菌落出现较早、菌落直径较大的诱变菌落挑取于黑曲霉液体培养基中，28-35°C条件下摇床培养35-60h，反复两次，转移至黑曲霉种子培养基28-35°C条件下摇床培养35-60h，其中黑曲霉种子培养基质量比:葡萄糖2%，淀粉4%，酵母提取物2%等，调节PH值至4.0-6.5，高压灭菌。[0021]步骤4)菌株发酵的具体步骤为:取上述种子培养基接种于黑曲霉发酵培养基，28-35°C条件下摇床培养3-7昼夜，过滤、离心取上清，即得粗酶液，其中发酵培养基质量比:玉米淀粉6%，豆柏粉1.8%，玉米糖浆1.8%，硫酸锌0.18%等，调节PH值至4.0-6.5，闻压灭菌。[0022]步骤5)产物纯化与浓缩的具体步骤为:50%-80%饱和度的硫酸铵对粗酶液进行沉淀，再用PH为4.0-6.5的柠檬酸缓冲液重悬，于截留量为10KD-40KD的透析袋内透析，4°C过夜，次日取出。此盐析-透析过程反复两次，用反透析法进行纯化后酶液的浓缩。[0023]步骤6)糖化酶理化性质分析的具体步骤为:取粗酶液与纯化后酶液分别进行了蛋白含量、酶催化最适温度及酶活力的测定。其中糖化酶最适温度的测定:取待测酶液，稀释合适的倍数。设定50°C-80°C，间隔1°C为温度梯度。在每一温度梯度下采用DNS法测定糖化酶的酶活力，选择酶活力最高的温度作为最适催化温度。每个样做3个平行；蛋白含量的测定:取待测液，稀释合适的倍数。采用Bradford法测定蛋白含量，用酶标仪在595nm下，测得A595nm,并计算蛋白质含量，每个样做3个平行；粗酶液酶活力的测定:取5mL2%可溶性淀粉溶液和5mL稀释酶液，在最适温度条件下保温1min后，用一次性滴管吸取I?2滴反应液于比色板上，用0.lmol/L碘液检测，保证有淀粉残余，沸水浴中5min终止酶促反应。取冷却后的反应液ImL于刻度试管(20mL)中，加入ImLDNS显色剂，沸水浴充分反应8min，取出迅速冷却后，用蒸馏水定容至1mL刻度线处，摇匀，酶标仪测定540nm处吸光度值。用加热灭活的酶液做空白，且每个样做3个平行。[0024]本发明的有益效果描述有以下三点:[0025]一、由于原始菌株一黑曲霉(Aspergillusniger)发酵生产糖化酶过程中会分泌出糖化酶，这种糖化酶的最适催化温度一般为58-60°C，比酶活一般为1000-4000U/mL在玉米精深加工中会造成巨大的能源浪费和设备损伤。所以，选育产耐高温糖化酶的菌株是从根本上解决以上问题的方法以黑曲霉(Aspergillusniger)为原始菌株,通过诱变和筛选，获得产耐高温糖化酶的生产菌株-黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641:该菌株最适酶活可达71°C，同时比酶活最高可达4219U/mL，极大程度地节约了发酵成本，可广泛用于食品化工等行业，前景广阔，市场潜力巨大。[0026]二、提供一种产耐高温糖化酶的生产菌株CGMCC8641的制备方法；该制备方法通过紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)协同或单独诱变和筛选，遗传稳定性好，易于实施、简洁、高效。又通过两轮黑曲霉液体培养基与黑曲霉扩大培养基逐级培养，黑曲霉长势良好，易于发酵。[0027]三、利用本发明获得的菌株一黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641,以玉米淀粉为碳源发酵生产耐高温糖化酶，确定该菌株发酵产糖化酶最适条件，产生稳定的糖化酶，在玉米精深加工方面取得突破性进展。[0028]应用实例1:一级扩大发酵[0029](I)菌种:黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641[0030](2)培养基的配制:[0031]液体培养基质量比:[0032]蔗糖3%，硝酸钠0.2%，磷酸氢二钾0.1%等，pH=4.7-5.0。[0033]扩大培养基质量比:[0034]葡萄糖2%，淀粉4%，酵母提取物2%等，调节PH值至4.7-5.0。[0035]发酵培养基质量比:[0036]玉米淀粉6%，豆柏粉1.8%，玉米糖浆1.8%，硫酸锌0.18%等，调节PH值至4.7-5.0。[0037](3)活化培养:挑取诱变菌株-黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641接种于20mL黑曲霉液体培养基，在28°C条件下摇床培养24h，使孢子活化萌发。[0038](4)种子培养:取上述液体培养液按10%接种于200mL种子培养基，28°C条件下摇床培养48h。[0039](5)发酵产糖化酶:取上述种子培养液20mL接种于200mL发酵培养基，28°C条件下摇床培养120h，取发酵液无菌纱布过滤并离心30min，得上清液即为糖化酶粗酶液。[0040](6)发酵后处理:取粗酶液经过80%硫酸铵盐析沉淀，以PH4.6柠檬酸缓冲液重悬并透析、浓缩得纯化后糖化酶液，经DNS法测定糖化酶最适催化温度为71°C，该温度下的比酶活为4219U/mL。[0041]应用实例2:二级扩大发酵[0042](I)发酵产糖化酶:取一级发酵液50mL接种于500mL发酵培养基，作为二级发酵液，28°C条件下摇床培养120h，取发酵液无菌纱布过滤并离心30min，得上清液即为糖化酶粗酶液。[0043](2)发酵后处理:取粗酶液经过80%硫酸铵盐析沉淀，以PH4.6柠檬酸缓冲液重悬并透析、浓缩得纯化后糖化酶液，经DNS法测定糖化酶最适催化温度为71°C，该温度下的比酶活为3974U/mL。[0044]应用实例3:三级扩大发酵[0045](I)发酵产糖化酶:取二级酵液150mL接种于1500mL发酵培养基，作为三级发酵液，28°C条件下摇床培养120h，取发酵液无菌纱布过滤并离心30min，得上清液即为糖化酶粗酶液。[0046](2)发酵后处理:取粗酶液经过80%硫酸铵盐析沉淀，以PH4.6柠檬酸缓冲液重悬并透析、浓缩得纯化后糖化酶液，经DNS法测定糖化酶最适催化温度为71°C，该温度下的比酶活为3277U/mL。[0047]参考文献[0048][l]NorouzianD,AkbarzadehA,ScharerJM,etal.Fungalglucoamylases[J].B1technolAdv.,2006,24:80-85.[0049][2]CardonaF,GotiA,BrandiA,etal.Moleculardynamicssimulat1nofthecomplexesofglucoamylaseIIfromAspergillusawamorivar.XlOOwithdeoxynojiromycinandlentiginosine[J].JMolModel,1997,3(1):249.[0050][3]PavezziFC,CarneiroAAJ,MartinsDA,etal.1nfluenceofdifferentsubstatesontheproduct1nofamutantthermostableglucoamylaseinsubmergedfermentat1n[J].ApplBicohemB1technol,2011,163:14-24.[0051][4]G1RDANORL,TROVATIJ,SCHMIDELLff.Continuousproduct1nofethanolfromstarchusingglucoamylaseandyeastco-1mmobiIizedinpectingel[J].ApplB1chemB1technol,2008,147(1-3):47-61.[0052][5]李旺军，方华，谢广发，等.RSM法优化AspergillusoryzaeA0-01产糖化酶条件的研究[J].食品科学，2007,28(11):322-327.【权利要求】1.一株新型黑曲霉和其生产糖化酶的方法:一种黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641，于2013年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641的诱变筛选、制备过程与耐高温糖化酶的生产这一过程的特征如下:步骤:1)原始菌株的培养与孢子悬浮液的制备；2)菌种诱变与筛选；3)黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641的培养；4)菌株发酵；5)产物纯化与浓缩；6)糖化酶理化性质分析。2.根据权利要求所述:黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641诱变筛选、制备过程与耐高温糖化酶的生产过程，其特征在于，步骤I)原始菌株的培养与孢子悬浮液的制备的具体步骤为:挑取原始菌株-黑曲霉(Aspergillusniger)接种于黑曲霉液体培养基，在28-35°C条件下摇床培养35-60h，反复活化两次，将所得孢子转移到相同液体培养基，在28-35°C条件下摇床培养20-35h，使孢子活化萌发，其中液体培养基的质量配比为:蔗糖3%、硝酸钠0.2%等；培养基的pH为4.0-6.5，高压灭菌。3.根据权利要求所述:黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641诱变筛选、制备过程与耐高温糖化酶的生产过程，其特征在于，步骤2)菌种诱变与筛选的具体步骤为:原始菌株经上一步处理后，分别采用紫外线和硫酸二乙酯单独诱变或协同诱变方法对原始菌种进行反复诱变，筛选得到产糖化酶催化最适温度与最适温度下酶活力同时最高的菌株-黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641。4.根据权利要求所述:黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641诱变筛选、制备过程与耐高温糖化酶的生产过程，其特征在于，步骤3)黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641的培养的具体步骤为:选择菌落出现较早、菌落直径较大的诱变菌落挑取于黑曲霉液体培养基中，28-35°C条件下摇床培养35-60h，反复两次，转移至黑曲霉种子培养基28_35°C条件下摇床培养35-60h，其中黑曲霉种子培养基质量比:葡萄糖2%，淀粉4%，酵母提取物2%等，调节PH值至4.0-6.5，高压灭菌。5.根据权利要求所述:黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641诱变筛选、制备过程与耐高温糖化酶的生产过程，其特征在于，步骤4)菌株发酵的具体步骤为:取上述种子培养基接种于黑曲霉发酵培养基，28-35°C条件下摇床培养3-7天，过滤、离心取上清，即得粗酶液，其中发酵培养基质量比:玉米淀粉6%，豆柏粉1.8%，玉米糖浆1.8%，硫酸锌0.18%等，调节PH值至4.0-6.5，高压灭菌。6.根据权利要求所述:黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641诱变筛选、制备过程与耐高温糖化酶的生产过程，其特征在于，步骤5)产物纯化与浓缩的具体步骤为:50%-80%饱和度的硫酸铵对粗酶液进行沉淀，再用PH为4.0-6.5的柠檬酸缓冲液重悬，透析袋内透析，盐析-透析过程反复两次，用反透析法进行酶液的浓缩。7.根据权利要求所述:黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641诱变筛选、制备过程与耐高温糖化酶的生产过程，其特征在于，步骤6)糖化酶理化性质分析的具体步骤为:取粗酶液与纯化后酶液分别进行了蛋白含量、酶催化最适温度及酶活力的测定。【文档编号】C12N1/14GK104357335SQ201410613332【公开日】2015年2月18日申请日期:2014年10月31日优先权日:2014年10月31日【发明者】胡鑫,李悦,梁冬雪,王玉华,于寒松,郭艺迪申请人:吉林大学