一种耐盐碱微生物菌群及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种耐盐碱复配微生物活性菌群，该菌群用于处理高盐碱含量的废弃钻井泥浆和含油污泥。本发明的耐盐碱复配微生物活性菌群，包含有异希瓦氏菌，假单胞菌和盐单胞菌；其中菌群中异希瓦氏菌，假单胞菌和盐单胞菌的数量比优选为4：3：1。本发明中的菌群对pH、盐分具有很强的耐受能力，具有对钻井废弃泥浆和石油污染土壤环境广泛的适应能力。废弃泥浆中的添加剂和有毒有害物质对活性微生物菌群没有明显的抑制作用，菌群生长速率较快，活性稳定，适应性强，生产成本低廉，可以应用于钻井废弃泥浆的生物降解以及修复石油环境污染及化工行业，这对提高我国油田废弃钻井泥浆的生物降解效率和完善处理工艺方面都具有较强的开发潜力。
【专利说明】—种耐盐碱微生物菌群及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于功能微生物菌群复配和筛选【技术领域】，具体涉及一种耐盐碱微生物菌群及其应用。
【背景技术】
[0002]废弃钻井泥浆是在油气田钻井过程中产生的油、水、泥的混合废弃物，主要包括废弃钻井液、废液、钻屑和石油烃等。添加钻井液是为达到安全、快速钻井的目的，随着钻井深度增加和难度加大，添加剂及有毒有害成分也增多，组成也越来越复杂，主要含重金属(Cr、Hg、Cd、Pb等)、石油烃类、膨润土、碱性化合物等都是对人、畜和环境有害的物质。废弃钻井泥浆中的废液产生于油田勘探和开发过程中，润滑钻头的同时也把钻屑携带到地面，半流体形态加大了污染面积，过高的PH值(8-12)、过量的盐(3%以上)和石油类物质极易造成土壤板结，肥力下降，使植物从土壤中吸收水分困难，作物大幅减产。废弃钻井泥浆流入河流、海洋或渗入地层，严重影响水生生物生长，污染地表水和地下水资源，造成污染物大范围迁移，给环境带来巨大的潜在危害，同时也进一步增加了环境修复的难度和成本。
[0003]我国将含油钻井废弃物列为《危险废物名录》，要求农用污泥中石油类含量控制在3000mg/kg以内。国内对于废弃钻井泥浆的处理通常采用固化密封的方式，少数油气田采取焚烧、回注、生物降解方式，但目前都处于边探索、边应用，边实验阶段，相关技术和工艺不够成熟。更为先进环保的生物降解技术处理废弃泥浆，但由于技术瓶颈，还没有大规模应用先例。由于废弃钻井泥浆中的主要污染物是石油烃类物质，而微生物作为生物圈中最大的分解者，能利用大部分石油烃作为分解代谢的底物，对污染物进行彻底分解，不产生二次污染。因此，利用微生物处理技术对废弃钻井泥浆中的石油烃类污染物进行处理一直是研究的重点。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种耐盐碱复配微生物活性菌群，及其在处理高盐碱含量的废弃钻井泥浆和含油污泥中的应用，从而弥补现有技术的不足。
[0005]本发明的耐盐碱复配微生物活性菌群，包含有异希瓦氏菌，假单胞菌和盐单胞菌。
[0006]菌群中异希瓦氏菌，假单胞菌和盐单胞菌的数量比优选为4:3:1。
[0007]作为实施例的优选，所述的异希瓦氏菌包含有胎儿异希瓦氏菌Alishewanellafetalis 和土壤异希瓦氏菌 Alishewanella agri:
[0008]作为实施例的优选，假单胞菌为厦门假单胞菌Pseudomonas xiamenensis ；
[0009]盐单胞菌为先河盐单胞菌Halomonas xianhensis、攀式盐单胞菌Halomonasventosae。
[0010]上述的复配微生物菌群用于处理钻井废弃泥浆或石油污染土壤。
[0011]本发明中的活性微生物菌群对pH，盐分具有很强的耐受能力，具有对钻井废弃泥浆和石油污染土壤环境广泛的适应能力。废弃泥浆中的添加剂和有毒有害物质对活性微生物菌群没有明显的抑制作用，菌群生长速率较快，活性稳定，适应性强，生产成本低廉，可以应用于钻井废弃泥浆的生物降解以及修复石油环境污染及化工行业，这对提高我国油田废弃钻井泥浆的生物降解效率和完善处理工艺方面都具有较强的开发潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1:群落处理14d后石油烃中各组分降解率；
[0013]图2:菌群传代过程中对原油的降解率。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实施例对本发明的活性菌群进行详细描述。
[0015]实施例1:废弃钻井泥浆本源微生物群落结构鉴定及污染物分析
[0016]利用16S rDNA克隆文库的方法，对取自中国天津大港油田港356井场附近堆放的废弃钻井泥浆中的本源微生物群落结构进行分析，用于筛选耐盐碱活性微生物功能菌群及优化培养条件。结果显示假单胞菌(Pseudomonas sp.)在废弃钻井泥衆中所占的比例最高，达27.44%;根瘤菌属(Rhizobium sp.)、红细菌属(Rhodobacter sp.)占比例也较高,分别% 20.73%>8.54% ο Deth1bacter alkaliphilus 在群落中所占的比例为 7.93%,这与废弃钻井泥楽■中硫含量闻有直接关系。
[0017]分析了废弃钻井泥浆中的基本理化性质，发现废弃钻井泥浆pH为8.2-8.5，石油烃含量为12.4g/kg，有机质含量为4.4g/kg，含水率60%，含盐量25g/kg。原油族组分分析发现废弃钻井泥浆中烃类污染物含量最高的是芳香烃，达42.01% (w/w)，脂肪烃类含量最少，为18.76% (w/w)，浙青质和胶质的含量则分别为20.31% (w/w)和18.92% (w/w) 0通常，原油中组分含量最高的是脂肪烃，与本实验样品中石油的组分有所不同，原因是废弃钻井泥浆长期被堆置在泥浆池中，烷烃类由于其生物可利用性最高优先被本源微生物所降解，导致其含量最低，芳香烃类由于其较难被微生物所利用，所以含量很高。芳香烃是一类广泛分布于环境中的含有苯环的有毒有害污染物，其具有潜在毒性、致癌性及致畸和诱变作用，可通过生物累积及食物链的传递，给生态环境和人体健康造成极大危害。进一步说明了利用耐盐碱的高活性微生物功能菌群处理废弃钻井泥浆的必要性和保护环境的意义。
[0018]实施例2:耐盐碱活性菌群筛选及群落结构分析
[0019]耐盐碱活性微生物菌群的活性特征取决于其生长环境的特殊性以及长期驯化得到的环境耐受能力，按照如下方法筛选耐盐碱性微生物群落。
[0020]1、培养液制备:按照100g/L的比例，称取废弃钻井泥浆接种于预先制备好的200ml含2% (w/v)原油无机盐培养基的500mL三角瓶中混匀，180rpm，30°C振荡培养，培养基组成如下(w/v):磷酸二氢钾0.005%，磷酸氢二钾0.005%，硝酸铵0.005%，硫酸镁0.0025%，氯化钙0.005%，硫酸亚铁0.0005%，有固相助剂5%，无固相助剂5%, pH 7.5，废弃钻井泥浆中有机碳源含量低，添加2%原油有助于强化群落乳化和降解石油烃类的活性。
[0021]2、活性群落传代驯化:活性群落的培养体系在摇床30°C，ISOrpm振荡培养，将发酵液按照10% (v/v)的接种量转接到新鲜的含2% (w/v)原油无机盐培养基中，每培养7d传代一次，连续转接20代以上，得到一个活性稳定，对原油乳化效果好的微生物复合菌群(如下所述)。培养体系在30°C，摇床180rpm震荡培养3d条件下，活菌数量超过101°个/ml，原油综合降解率达到60%以上。废弃钻井泥浆中微生物多样性高，群落结构复杂，表明微生物经过长期进化后已适应废弃钻井泥浆环境。因此，利用本源微生物对其中的污染物进行降解是切实可行的。
[0022]3、活性微生物群落结构分析:利用16S rDNA克隆文库的方法，对传代20代的活性微生物群落结构进行分析，发现菌群中主要存在三个成员:假单胞菌(Pseudomonas)、异希瓦氏菌(Alishewanella)和盐单胞菌(Halomonas)三个数量达92.72% ο 其中 Alishewanella 比例最高，达 49.09 %，其次是 Pseudomonas (27.28 % )和Halomonas (16.37% )。
[0023]实施例3:单菌复配验证活性菌群功能
[0024]按照实施例2中筛选到的活性功能菌群比例，分别选用分离自泥样的胎儿异希瓦氏菌Alishewanella fetalis, CGMCCC N0.1.8064,分离自土壤样品的土壤异希瓦氏菌Alishewanella agri, CGMCCC N0.1.10668,分离自活性污泥样品的厦门假单胞菌Pseudomonas xiamenensis, CGMCCC N0.1.6446,分离自石油污染土壤样品的先河盐单胞菌Halomonas xianhensis, CGMCCC N0.1.6848以及分离自高盐土壤样品的攀式盐单胞菌，Halomonas ventosae,CGMCCC N0.1.6331，在LB培养基中培养至对数生长期，之后调节细胞浓度，按照异希瓦氏菌Alishewanella:假单胞菌Pseudomonas:盐单胞菌Halomonas = 4:3:1的比例复配组成微生物菌群。其中异希瓦氏菌Alishewanella和盐单胞菌Halomonas中的不同种的添加比例可以是任意的。
[0025]按照实施例2所述活性检测方法，分析群落对原油降解效率，培养体系在30°C，摇床180rpm震荡培养14d条件下,活菌数量超过111个/ml,原油综合降解率超过60%,结果验证了本发明的功能菌群的活性功能。
[0026]实施例4:复配菌群活性和功能稳定性分析
[0027]1、复配微生物群落活性分析:比较复配菌群处理14d前后的石油烃族组分变化。石油烃组分分析参照《中华人民共和国石油天然气行业标准一岩石中可溶有机物及原油族组分分析(SY/T 5119-2008)》:用等体积氯仿将废弃钻井泥浆降解体系中的石油萃取出来，浓缩除去溶剂，用正己烷沉淀其中的浙青质，滤液部分浓缩至3-4mL，通过硅胶氧化铝层析柱，采用不同极性的溶剂，依次用正己烧，二氯甲烷:正己烷=2:l(v/v)和氯仿将其中的饱和烃、芳香烃和胶质分别淋洗出，挥发除去溶剂，恒重后称量，得样品中各族组分的含量。结果显示，经14d处理后，大部分的脂肪烃烃被降解，降解率达92.04%,芳香烃降解率次之，为79.5%，胶质和浙青质的降解率分别10.27%和16.46%。残余的石油烃中芳香烃、胶质、浙青质这三种难以降解的组分高达96.74%，说明相对于芳香烃、胶质和浙青质，微生物更优先利用脂肪烃，原油综合降解率60%以上(图1)，对比筛选菌群，原油综合降解率在55%左右，说明复配菌群在活性上优于筛选的微生物群落。
[0028]2、复配菌群功能稳定性分析:
[0029]分别测定复配菌群在传代过程中第6、12、16、18、22代菌群对总石油烃的降解率来监测群落功能的变化。取1mL培养体系中培养液接种到含有90mL无机盐培养基的三角瓶中，添加2% (w/v)原油为唯一碳源，于30°C, 180rpm的摇床中培养14d,萃取体系中剩余的总石油烃，利用实施例3-1中的方法测定不同代数的群落对总烃降解率，反映群落降解石油烃功能的稳定性，以不添加复配菌群组作对照。第O代处理组对原油降解率为16.32%，活性较弱，细胞数量较少，随着驯化代数增加，活性微生物得以富集，原油降解能力越来越强，从第6代至第22代菌群对原油的降解率均在60%以上(图2)。同时，设置了培养体系中不同含盐量0-15% (w/v)和不同pH 5-10，结果显示，单菌复配后的菌群对原油降解率都在60%以上，含油量在10% (w/v)内的培养体系中功能菌群活性没有任何下降，说明菌群活性稳定，耐受能力较高，在含盐量超过20%和ρΗ>11的条件下，菌群活性受到了一定抑制，原油降解率在50%左右，保持了较强的活性。
[0030]实施例5:菌群处理前后泥浆有机质含量及污泥脱油效果验证
[0031]参照土壤有机质含量的测定方法(NY/T 1121.6-2006)，在加热的条件下，用过量的重铬酸钾-硫酸溶液氧化土壤中的有机碳，多余的重铬酸钾由硫酸亚铁标准溶液进行滴定，检测了处理前后泥浆中的有机质含量。配制培养基时所加物质总有机质含量为183.71g/kg，20代群落培养体系中总有机质含量121.904g/kg，总体系降解率为38.91%。
[0032]取适量土样，65°C烘干，碾碎，加入过量原油饱和，烘干碾碎。取第20代单菌复配的微生物群落，处理含油土壤，摇床震荡培养14d，取泥烘干，碾碎。分析作用前后泥土中的原油含量变化情况。含油污泥含油量261g/kg，微生物群落处理后泥土中含油305mg/kg，可以看出，复配菌群对泥土中原油的去除率达到了 99%以上，效率很高，筛选菌群对含油污泥脱除率在90%，说明单菌复配菌群效果优于筛选的活性菌群。降解后土壤的颜色明显浅于加油后，甚至颜色浅于未加油时的颜色，说明驯化的活性菌群有很好的脱油活性，适用于废弃钻井泥浆和油污土壤中的原油降解和乳化去除。
[0033]实施例6:连续曝气装置的设计与试用
[0034]分析活性微生物群落对废弃钻井泥浆的处理效果，经过研究和数据分析发现，由于废弃钻井泥浆中存在较大的颗粒物，所以上翻型的搅拌桨对含泥沙量较大的发酵体系的搅动效果最好，有理于泥浆颗粒均匀搅动，对气体分散也有促进作用。进一步分析了不同径高比的容器对连续曝气装置中通气和搅拌的影响，发现径高比在0.4-0.6之间的容器，搅拌效率较好，同时发现在发酵体系4L以内搅拌效率较高，大的体系，溶氧和泥沙搅拌效率都比较低，不利于微生物在好氧条件下对石油污染物的分解利用。气泵调节通气量为6L/min，搅拌转速为300rpm，培养温度为室温，发酵体系装液量为4L，折合通气量为1.5vvm，发酵容器径高比为1:2，复合菌液投加量在10%-20%之间，经过连续培养30d，计算发酵体系中的石油烃类污染物去除效率为70%以上，达到了预期的效果。
【权利要求】
1.一种耐盐碱复配微生物活性菌群，其特征在于，所述的耐盐碱复配微生物活性菌群包含有异希瓦氏菌，假单胞菌和盐单胞菌。
2.如权利要求1所述的耐盐碱复配微生物活性菌群，其特征在于，所述的菌群中异希瓦氏菌，假单胞菌和盐单胞菌的数量比为4:3:1。
3.如权利要求1或2所述的耐盐碱复配微生物活性菌群，其特征在于，所述的异希瓦氏囷为胎儿异希瓦氏囷和/或土壤异希瓦氏囷。
4.如权利要求1或2所述的耐盐碱复配微生物活性菌群，其特征在于，所述的假单胞菌为厦门假单胞菌。
5.如权利要求1或2所述的耐盐碱复配微生物活性菌群，其特征在于，所述的盐单胞菌为先河盐单胞菌和/或攀式盐单胞菌。
6.权利要求1所述的耐盐碱复配微生物活性菌群在处理钻井废弃泥浆或石油污染土壤中的应用。
【文档编号】C12N1/20GK104403967SQ201410623410
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月6日 优先权日:2014年11月6日
【发明者】王兴彪, 黄志勇, 董大媛, 常允康 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所