Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的nasba-elisa检测引物、探针及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒NASBA-ELISA检测引物、探针及试剂盒。所述引物及探针的核苷酸序列如SEQIDNO.1～4所示。所述试剂盒中含有引物、探针、NASBA扩增缓冲液，酶混合液，扩增产物检测试剂，阴性对照和阳性对照。本发明的Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒NASBA-ELISA检测试剂盒检测时间周期短、检测效率高；检测病毒特异性高，准确率高；在进行病毒定性分析的同时还能进行病毒定量分析；检测灵敏度比普通PCR高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好。
【专利说明】II型草鱼呼肠孤病毒的NASBA-ELISA检测引物、探针及试 剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒分子生物学领域，涉及一种草鱼呼肠孤病毒体外检测方法，特别 是一种II型草鱼呼肠孤病毒NASBA-ELISA检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV)隶属水生呼肠孤病毒属，为呼肠孤 病毒科一新成员，是中国大陆分离的第一株鱼类病毒。该病毒主要引起中国、越南、缅甸等 亚洲国家淡水养殖中的草鱼品种在鱼种阶段发生出血病，死亡率可高达60%以上。该病毒 流行广、危害大、死亡率高、发病季节长，严重威胁渔业生产。草鱼呼肠孤病毒具双层衣壳， 病毒粒子平均直径为60 nm-70nm，二十面体对称，无囊膜，基因组由11条分节段的双链RNA 组成。目前己经报道了 30多个分离株，包括GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、 GCRV991、GCRV H962、ZV-8802、GCRV-854、GCRV HZ08、GCRV JX09-01、GCRV JX09-02、GCRV ⑶10、GCRV GCRV104株等，不同分离株在基因组序列、基因组带型、细胞病变、对草鱼的致 病力等方面差异较大。到目前为止，已完成全基因组序列分析的毒株有GCRV 873株、GCRV HZ08、GCRV⑶10、GCRV 104等，也有比较多的毒株只完成了部分节段或者部分序列的测序 工作。草鱼呼肠孤病毒比较复杂，不同分离株的各基因节段存在重配和抗原漂移现象，使 得目前还没在血清学或者基因型上对其进行亚型分类。但是通过现有的分离株序列信息来 看，至少应该有三类，各类的代表株分别是：第一类为873株和JX09-01株，第二类为HZ08 株和GDlO株，第三类型为104株。在相关的研究报道中已有提到将其进行基因分型的探讨， 即分别把一、二和三类按照基因序列差异分为I、II和III型。同一亚型的毒株，其对应各节 段基因同源性均在95%以上。当前，全国各地分离到的流行株中，三类亚型均有报道，有的 单独感染，也有混合感染。根据近几年的草鱼出血病监测和流行病学调查分析表明，目前导 致草鱼出血病流行和爆发的最主要为GCRV II型。
[0003] 目前，检测草鱼呼肠孤病毒的方法有多种，如病毒分离、电镜观察、核酸带型分析、 RT-PCR和实时荧光RT-PCR技术。病毒分离敏感度不高，特别是对于没有明显细胞病变的 Π 型草鱼呼肠孤病毒，而且操作烦琐，成本较高，周期较长，对病料的要求较高。目前，广泛 应用的常规RT-PCR检测方法简单、方便、快速，但仍存在假阳性和PCR污染的问题；实时 荧光RT-PCR ( real-time RT-PCR)技术虽然灵敏度较高，但仪器设备和技术含量都要求 较高，不适合基层兽医部门的诊断。
[0004] 依赖核酸序列的扩增（nucleuic acid sequence based amplification，NASBA) 是在PCR基础上发展起来的一种新技术。NASBA-ELISA方法是将NASBA技术和ELISA (酶 联免疫吸附剂测定）方法相结合，其原理是将地高辛标记到检测探针上，通过探针捕获探 针将地高辛标记的探针和NASBA产物的复合物吸附到微量反应板上，作用于底物硝基苯基 磷酸盐显色，然后通过分析吸光度来检测RNA产物。由于捕获探针和检测探针的应用，使检 测结果更为特异，而酶标仪的高通量性能使一次能够检测多个样品。当前，还没有建立草鱼 呼肠孤病毒NASBA检测方法的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的在于提供一种II型草鱼呼肠孤病毒NASBA-ELISA检测引物、探 针及试剂盒。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供上述引物、探针及试剂盒在检测II型草鱼呼肠孤病 毒中的应用。
[0007] 本发明所采取的技术方案是： Π 型草鱼呼肠孤病毒NASBA-ELISA检测引物及探针，其针对II型草鱼呼肠孤病毒S6节 段保守区域。所述引物及探针的序列如下所示： (1) II型GCRV S6基因一对特异性引物： S6-F:5-GATGCAAGGTCGCATATGAGCAGACGGGTCACCGTATTGTTACA-3, (SEQ ID NO. 1), S6-R:5, -AATTCTAATACGACTCACTAAAGGGAGAAGGGAACTCATCAGTAAAGTCGGA-3' （SEQ ID NO. 2)； (2) II型GCRV S6基因特异性捕获探针： S6-CP:5'BI0-TCAGCAGGTGCCGTTAATTTGT-3'（SEQ ID N0.3); (3) II型GCRV S6基因特异性检测探针 S6-DP:5'-TGATGCAAGGTCGCATATGAG-DIG3'（SEQ ID N0.4)。
[0008] -种用于检测II型草鱼呼肠孤病毒的NASBA-ELISA试剂盒，其含上述的引物及探 针，还含有NASBA扩增缓冲液，酶混合液，扩增产物检测试剂，阴性对照和阳性对照。
[0009] 所述 NASBA 扩增缓冲液含有：pH 8. 5 Tris-HCl 50 mmol/L，KCl 50 mmol/L， MgCl2 12 mmol/L，DTT 5 mmol/L，dNTP 2 mmol/L，NTP 10 mmol/L，DMSO 100 g/L。
[0010] 所述酶混合液含有：AMV反转录酶20U，T7 RNA聚合酶40U，核糖核酸酶H 0. 8U。
[0011] 所述扩增产物检测试剂的组成为： (1) 链霉亲和素包被的96孔酶标板； (2) 杂交缓冲液：20XSSPE (pH7.4)，50mM/L Tris-HCl (pH8.8)，l% (W/V)BSA 45yL; (3) 酶标抗体：碱性磷酸酶抗地高辛抗体100 μ L ; (4) 洗液：PBST 溶液 500yL ; (5) 显色液：3mg pNPP溶于ImL CldH2O中，加入Iml二乙醇胺，避光-20°C保存，IOOyL; (6) 终止液：0· 5M Na2C03 溶液 100 μ L。
[0012] 所述阳性对照为GCRV ΗΖ08株病毒液提取的RNA，所述阴性对照为未感染草鱼呼 肠孤病毒的健康草鱼内脏组织提取的总RNA。
[0013] 以上所述的试剂盒在检测II型草鱼呼肠孤病毒中的应用。
[0014] 本发明的NASBA-ELISA技术由1对带有Τ7启动子序列的引物引导的连续、等温、 基于酶反应的核酸扩增技术，反应在41°C条件下进行，可在2 h内将模板RNA扩增IO9倍， 比常规PCR法高IO3倍，而且不需特殊仪器，是一种快速、简便、特异的扩增技术，具有敏 感性高、特异性好、操作简单等特点，很适合基层兽医部门推广应用。
[0015] NASBA的简要过程如下=(I)RNA模板链进入反应混合物后，第一个引物首先与 模板链的3'端结束。（2)反转录酶（AMV)，合成反义的补偿的DNA链。（3)RNaseH，分解破 坏RNA模板链。（4)第二个引物与DNA的5'端结合。（5) T7 RNA polymerase合成RNA 补偿链，并加入到步骤1中，使反应可以循环进行。
[0016] 本发明的有益效果是： 本发明的II型草鱼呼肠孤病毒NASBA-ELISA检测试剂盒检测时间周期短、检测效率 高；检测病毒特异性高，准确率高；在进行病毒定性分析的同时还能进行病毒定量分析；检 测灵敏度比普通PCR高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为K+浓度对NASBA的影响，其中M为DNA分子量标准，1、2、3为KCl浓度分别 为25mM、50mM和75mM的扩增结果，RT为RT-PCR扩增结果； 图2为RnaseH用量对NASBA的影响，其中M为DNA分子量标准，1、2、3为RnaseH的用 量分别是〇. 6U、0. 8U、1. 2U的扩增结果； 图3为T7 RNA polymerase用量对NASBA的影响，其中M为DNA分子量标准，1、2、3为 T7 RNA polymerase分别是20U、40U和60U的扩增结果； 图4为引物浓度对NASBA的影响，其中M为DNA分子量标准，1、2、3中引物浓度分别为 0. 1、0. 2、0. 25uM。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0019] 以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、 DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子 克隆实验指南》（第三版）（Sambrook J，Russell DW，Janssen K，Argentine J.黄培堂等 译，2002,北京：科学出版社），或按照制造厂商所建议的条件。
[0020] 实施例1 :特异性引物和探针的设计与合成 从 NCBI 获得 GCRV-GD108、106、918、HeNan988、HeNan794、HZ08 和 109 共 7 个病毒株 S6 序列，进行比对；在保守区域设计1对扩增引物及相应的捕获探针和检测探针。
[0021] S6-F:5'-GATGCAAGGTCGCATATGAGCAGACGGGTCACCGTATTGTTACA-3' (SEQ ID NO. 1)， 下划线部分与检测探针互补； S6-R :5 ' -AATTCTAATACGACTCACTAAAGGGAGAAGGGAACTCATCAGTAAAGTCGGA-3' (SEQ ID NO. 2)，下划线部分为T7启动子序列。
[0022] II 型 GCRV S6 基因特异性捕获探针：S6-CP :5'BI0-TCAGCAGGTGCCGTTAATTTGT-3' (SEQ ID NO. 3)； II 型 GCRV S6 基因特异性检测探针 S6-DP :5' -TGATGCAAGGTCGCATATGAG-DIG3'（SEQ ID NO. 4)。
[0023] 实施例2 NASBA方法中引物浓度、酶浓度、离子浓度的摸索及优化 (I)K+浓度的优化 在不同的文献中，K+浓度分别为10mM、20mM、42mM、70mM、120mM ;有文献显示IOOmM以上 的浓度对结果影响不大；基础体系中K+浓度为25mM ;分别设置KCl浓度为25mM、50mM、75mM 进行NASBA扩增。50mM和75mM的结果相似，均比25mM扩增的条带要亮，确定以后体系中使 用 50mM KC1。
[0024] (2) RnaseH用量的优化 在不同的文献中，每20ul反应体系中RnaseH的用量从0. 1U、0. 2U至0. 8U不等；使用 较少RnaseH的反应体系中添加了 DMSO或者山梨醇来激发AMV的内源RnaseH活性。但是 过少的RnaseH很难用移液器吸取，故本反应系统没有添加 DMSO和山梨醇。设立0. 6U、0. 8U 和I. 2U三个RnaseH用量。实电泳结果表明，RnaseH用量为0. 8U时的条带最亮。
[0025] (3) T7 RNA polymerase 用量的优化 在不同的文献中，每20ul反应体系中T7 RNA polymerase的用量从20U、38U、60U不 等；保持上述基本体系不变，调整T7 RNA polymerase的用量分别为20U、40U和60U进行反 应；当T7 RNA polymerase用量从20U增加到40U时，扩增产物量明显增加；但是60U的用 量下，扩增产物较40U略有增加，没有明显的差异；考虑到酶的用量成本，选择40U为最佳用 量。
[0026] (4)引物浓度的优化 在不同的文献中，引物的使用量从〇. luM、0. 2uM、0. 4uM到0. 5uM不等。本体系中使用 的引物浓度为〇. 25uM，电泳检测发现具有较强的引物二聚体。设立0. 1、0. 2、0. 25uM三个引 物浓度梯度，按上述优化的条件进行NASBA反应。电泳结果显示扩增产物条带和二聚体条 带没有明显的变化。
[0027] 实施例3NASBA-ELISA反应体系及反应程序的建立 1、病毒RNA的提取 ① 取200ul病毒样本，加入Iml Trizol,剧烈振荡15s，室温放置5min ; ② 加入200ul氯仿，剧烈振荡15s，4°C 12000rpm离心15min ; ③ 取上清，加入650ul异丙醇，-20°C沉淀IOmin ; ④ 4°C 12000rpm离心15min，去上清； ⑤ 加入Iml DEPC水配制的75%乙醇清洗沉淀，4°C 8000rpm离心5min ; ⑥ 轻轻去上清，用枪头吸去残留液体，室温干燥沉淀IOmin ; ⑦ 加入24ul DEPC水溶解沉淀，5ul分装成8管于-80°C保存备用；同时提取健康草鱼 组织的RNA作为对照之用。
[0028] 2、NASBA反应体系和反应程序 取 3yL 模板 RNA，0. 5yL 上游引物（IOOp mol/yL)和 0. 5yL 下游引物（IOOp mol/ μ L)，12 μ L NASBA Buffer (含有 50 mmol/L、pH 8.5 Tris-HCl, 50 mmol/L KCl，12 mmol/ L MgCl2,5 mmol/L DTT，2 mmol/L dNTP，10 mmol/L NTP，100 g/L DMS0。）加入到 500yL离 心管中，65°C加热2 min，去除RNA二级结构，41°C冷却2 min;迅速加入酶混合液4yL (含 20U的AMV反转录酶，40U T7 RNA聚合酶，0.8 U核糖核酸酶H)，反应总体积为20 μ L，震荡 混匀后，41°C反应90 min，-20°C终止反应。
[0029] 3、ELISA检测NASBA扩增产物 (1) 链霉亲和素包被酶标板 取无 Rnase的酶标板用pH9. 6的0. 05M碳酸盐缓冲液配置0. 01mg/ml的链霉亲和素， 每孔100 μ 1，室温过夜； (2) 封闭 用pH9. 6的0. 05M碳酸盐缓冲液配置0. 2% BSA封闭酶标板，每孔100ul，37°C孵 30min，PBST洗版3次。4°C避光保存备用。
[0030] (3)杂交 配制如下杂交体系：NASBA产物5 μ 1，捕获探针（10 μ Μ)5 μ 1，检测探针（10 μ Μ)5 μ 1， 20XSSPE杂交缓冲液25μ 1，CldH2O 60μ 1。然后振荡混匀，45°C孵育30min。
[0031] (4)结合酶标抗体 用含0. 2%BSA的PBST按1 :250稀释AP-DIG抗体，每孔100 μ 1，室温孵育30min，TBST 洗版3次。
[0032] (5)显色及读值 每孔加入IOOul pNPP显色液，室温避光显色l-2hr ;每孔加入IOOul 0. 5M Na2CO3终止 液终止显色。在405nm处读取吸光度值。以阴性对照MEAN+3SD为判定阳性的标准值。进 行NASBA反应的产物进行ELISA检测，阳性孔和阴性孔各做4个复孔，显色后405nm读值， 结果如下： 表1阳性结果判定标准
【权利要求】
1. II型草鱼呼肠孤病毒NASBA-ELISA检测引物及探针，其特征在于，所述引物及探针 针对II型草鱼呼肠孤病毒S6节段保守区域。
2. 根据权利要求1所述的II型草鱼呼肠孤病毒NASBA-ELISA检测引物及探针，其特征 在于，所述引物及探针的序列如下所示： (1) II型GCRV S6基因一对特异性引物： S6-F:5-GATGCAAGGTCGCATATGAGCAGACGGGTCACCGTATTGTTACA-3, (SEQ ID NO. 1), S6-R：5, -AATTCTAATACGACTCACTAAAGGGAGAAGGGAACTCATCAGTAAAGTCGGA-3, (SEQ ID NO. 2)； (2) II型GCRV S6基因特异性捕获探针： S6-CP ：5,BI0-TCAGCAGGTGCCGTTAATTTGT-3, (SEQ ID NO. 3)； (3) II型GCRV S6基因特异性检测探针 S6-DP:5'-TGATGCAAGGTCGCATATGAG-DIG3'（SEQ ID N0.4)。
3. -种用于检测II型草鱼呼肠孤病毒的NASBA-ELISA试剂盒，其含有权利要求1或2 所述的引物及探针。
4. 根据权利要求3所述的用于检测II型草鱼呼肠孤病毒的NASBA-ELISA试剂盒，其特 征在于，所述试剂盒中还含有NASBA扩增缓冲液，酶混合液，扩增产物检测试剂，阴性对照 和阳性对照。
5. 根据权利要求4所述的用于检测II型草鱼呼肠孤病毒的NASBA-ELISA试剂盒，其 特征在于，所述 NASBA 扩增缓冲液含有：pH 8. 5 Tris-HCl 50 mmol/L，KCl 50 mmol/L， MgCl2 12 mmol/L，DTT 5 mmol/L，dNTP 2 mmol/L，NTP 10 mmol/L，DMSO 100 g/L。
6. 根据权利要求4所述的用于检测II型草鱼呼肠孤病毒的NASBA-ELISA试剂盒，其特 征在于，所述酶混合液含有：AMV反转录酶20U，17 RNA聚合酶40U，核糖核酸酶H 0. 8U。
7. 根据权利要求4所述的用于检测II型草鱼呼肠孤病毒的NASBA-ELISA试剂盒，其特 征在于，所述扩增产物检测试剂的组成为： (1) 链霉亲和素包被的96孔酶标板； (2) 杂交缓冲液：20XSSPE (pH7.4)，50mM/L Tris-HCl (pH8.8)，l% (W/V)BSA 45iiL; (3) 酶标抗体：碱性磷酸酶抗地高辛抗体100 ii L ; (4) 洗液：PBST 溶液 500iiL ; (5) 显色液：3mg pNPP溶于lmL ddH20中，加入lml二乙醇胺，避光-20°C保存，lOOuL; (6) 终止液：0? 5M Na2C03 溶液 100 ii L。
8. 根据权利要求4所述的用于检测II型草鱼呼肠孤病毒的NASBA-ELISA试剂盒，其特 征在于，所述阳性对照为GCRV HZ08株病毒液提取的RNA，所述阴性对照为未感染草鱼呼肠 孤病毒的健康草鱼内脏组织提取的总RNA。
9. 权利要求3?8任一项所述的试剂盒在检测II型草鱼呼肠孤病毒中的应用。
【文档编号】C12R1/93GK104388588SQ201410633166
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月11日 优先权日:2014年11月11日
【发明者】曾伟伟, 王庆, 王英英, 梁虹茹, 吴淑勤, 宋新建, 李莹莹, 石存斌 申请人:中国水产科学研究院珠江水产研究所