一种抗凝血酶Ⅲ蛋白突变体的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种抗凝血酶III蛋白突变体，所提供的抗凝血酶III与已报道的人抗凝血酶III存在3个氨基酸位点的不同，从而导致该抗凝血酶III和肝素的结合效率大幅度提高，便于亲和层析方法对该蛋白的纯化，从而弥补了现有技术的不足。本发明的新型抗凝血酶III，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，编码该抗凝血酶III的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。本发明获得的重组人抗凝血酶III与对照组相比，耐温、耐pH值及酶的特异比活均无明显差别，但是肝素亲和层析纯化该蛋白时，其纯化效率提高20％以上，更利于抗凝血酶III的广泛应用。
【专利说明】一种抗凝血酶III蛋白突变体
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程和蛋白质改造【技术领域】，具体涉及一种抗凝血酶III蛋白突变 体。 技术背景
[0002] 抗凝血酶III (AT III)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，由432个氨基酸组成，主要功能 是通过抑制凝血酶和其他凝血因子的活性来维持体内凝血与抗凝血的平衡，从而保持正常 的生理状态，可有效预防和治疗抗凝血酶缺乏症及急、慢性血栓血塞的形成等疾病，在临床 上有很广泛的应用。
[0003] 由于血液中抗凝血酶III很少，且存在携带病毒的风险等问题，因此利用基因工程 技术生产表达重组人抗凝血酶III (rhAT III)是更安全可行的方法。目前AT III已经在多种 生物体系中进行了重组研究，如E. coil，CHO细胞等，但前者表达的蛋白活性低，后者的表 达系统成本高、产量低。而转基因动物乳腺生物反应器兼顾了二者的优点，成为目前最为理 想的获得抗凝血酶III的技术平台。
[0004] 目前一般采用肝素亲和层析的方法进行抗凝血酶III的纯化，但是该纯化方法存在 纯化效率低的问题。因此期望在不影响其抗凝血功能的前提下，寻找和克隆出能更容易纯 化的重组人抗凝血酶III，将对其应用起到极大的推动作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种抗凝血酶III蛋白突变体，所提供的抗凝血酶III与已报道 的人抗凝血酶III存在3个氨基酸位点的不同，从而导致该抗凝血酶III和肝素的结合效率大 幅度提高，便于亲和层析方法对该蛋白的纯化，从而弥补了现有技术的不足。
[0006] 本发明的新型抗凝血酶III，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1，编码该抗凝血酶III的基 因的核苷酸序列为SEQ ID N0:2。
[0007] 上述的新型抗凝血酶III的最适pH值在5. 5-8. 0的范围内能保留50%以上的酶活 性。低于70°C，放置24h时，新型抗凝血酶III的酶活能保留60%以上。其特异比活为5IU/ mg。与对照组相比，具有相同的酶活性质，但肝素亲和层析的纯化效率提高20%以上。
[0008] 本发明还提供一种重组表达载体，用于重组表达上述的新型抗凝血酶III。
[0009] 本发明获得的人抗凝血酶III突变体与对照组相比，耐温、耐pH值及酶的特异比活 均无明显差别，但是肝素亲和层析纯化该蛋白时，其纯化效率提高了 24. 16%，更利于抗凝 血酶III的广泛应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1、新型抗凝血酶III的最适pH值性质研究图；
[0011] 图2、新型抗凝血酶III的耐温性质研究图；
[0012] 图3、抗凝血酶III突变体的耐温性质研究图；
[0013] 图4、抗凝血酶III突变体的最适pH值性质研究图。
【具体实施方式】
[0014] 申请人:在之前的研究中构建了转入人抗凝血酶III基因的奶山羊，在对不同个体来 源的转基因羊奶进行抗凝血酶III蛋白纯化的过程中，发现一个个体的得率明显比其它个体 的高，在进行抗凝血酶III蛋白的测序分析后完成了本发明。
[0015] 下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下 列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook) 等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域 相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要 求范围不限于所提供的案例。
[0016] 实施例1 :转人抗凝血酶III基因羊乳的纯化
[0017] 1 ?羊奶预处理
[0018] 分别取新型抗凝血酶III (Mut-rhAT III)羊奶及对照组抗凝血酶III (rhAT III)羊奶 20ml，编号分别rhAT III和Mut-rhAT III，离心除去乳脂和沉淀。
[0019] 2?酪蛋白沉淀
[0020] 离心后的上清液加入等体积去离子水，用6N盐酸将其pH值调整为4. 6。室温静置 沉淀一个小时后，4000rpm，4°C，离心40min，去除沉淀。将上清液的pH值调整为7. 2,备用。
[0021] 3.肝素亲和层析纯化rhAT III蛋白
[0022] (1)装柱
[0023] 将IOmL肝素亲和介质（保存于20%乙醇中）摇匀后备用；取GE公司的XK 16/20 层析柱，清洗干净后垂直放置，排空出口端adapter的气泡后将其接到层析柱上，添加约 Icm高度的去离子水，然后由玻璃棒将搅拌均匀的肝素亲和介质（过程所提供）缓慢引入层 析柱中，接着将已排出气泡的入口端的adapter连接到层析柱上。
[0024] 层析柱安装完毕后通过层析系统先用去离子水冲洗（冲洗掉保存介质的乙醇）5 个柱体积（流速：l〇ml/min)，最后降低入口端adapter至介质表面，注意排空气泡。记录最 终层析柱高度，柱床体积控制在IOml左右。
[0025] (2)平衡
[0026] 用Buffer A(20mM pH7. 2Tris - HC1)平衡层析柱，选用流速为5ml/min，平衡5个 柱体积。
[0027] (3)进料和淋洗
[0028] 以流速2ml/min进料，共进料约40mL，收集出口流出液称重定容；再以Buffer A 淋洗2个柱体积，流速5ml/min。进料20mL后开始收集穿透峰，进料结束之后继续收集1. 5 个柱体积为穿透峰PO。
[0029] (4)洗脱
[0030] 用 50% Buffer B(20mM pH7. 2Tris - HC1+0. 5M NaCl)洗脱，流速为 5ml/min。洗脱 50mL之后开始收集洗脱峰，收集30ml为洗脱峰Pl。用100% Buffer B洗脱，流速为5ml/ min。出峰后开始收集洗脱峰，收集30ml个柱体积为洗脱峰P2。
[0031] (5)清洗
[0032] 用纯水冲洗层析柱，流速5ml/min，共5个柱体积。
[0033] (6)测定蛋白浓度
[0034] 用BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天）测定蛋白浓度，具体方法如下：根据样品数 量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B (50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。完 全溶解蛋白标准品，取10 y 1稀释至100 y 1，使终浓度为〇. 5mg/ml。然后将标准品按照0， I ii l，2ii l，4ii l，8ii 1，12ii 1，16ii l，20ii 1加到96孔中的标准品孔中，加用于稀释标准品 的溶液补足到20 yl。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液到 20iU。各孔加入200iUBCA工作液，37°C放置30min。测定A562。根据标准曲线计算蛋白 浓度。
[0035] (7)超滤浓缩
[0036] 用Millipore的30KD超滤浓缩管将收集的目的蛋白用进行超滤浓缩。
[0037] 结果见表1，表明在同样的纯化条件下，本发明的新型抗凝血酶III (Mut-rhAT III) 的纯化收率与对照组的抗凝血酶III (rhAT III)相比，提高了 21.92%。
[0038] 表1 :亲和层析纯化结果
[0039]
【权利要求】
1. 一种抗凝血酶III，其特征在于，所述的抗凝血酶III的氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
2. -种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的抗凝血酶III。
3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:2。
4. 一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体用于重组表达权利要求1所 述的抗凝血酶III。
5. 如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体携带有权利 要求3所述的基因。
【文档编号】C12N15/15GK104356228SQ201410655390
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月18日 优先权日:2014年11月18日
【发明者】邹贤刚, 赵雅琳, 袁三平 申请人:青岛森淼实业有限公司