H3n8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量rt-pcr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3和6的碱基序列。实验证明，本发明具有检测时间短、检测敏感性高且特异性强的优点，可实现同时检测和鉴别H3亚型AIV和N8亚型AIV两种病原体，并对其相应病原含量进行定量，可用于H3N8亚型AIV的快速诊断和监测，因此本发明对H3N8亚型禽流感病毒的防治有重要意义。
【专利说明】H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试 剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于PCR检测病毒【技术领域】，尤其涉及一种H3N8亚型禽流感病毒一步法实 时荧光定量RT-PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 禽流感（Avian influenza, Al)是危害禽类养殖的一类重要传染病，其病原 体AIV为单股负链分节段的RNA病毒，其中血凝素（Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶 (Neuraminidase，NA)是两个比较重要的基因节段，Susan等的研宄表明HA和NA基因之间 存在某种平衡对病毒的致病性有很大关系。H3是目前已知的人类流行的主要亚型之一，血 清学分析显示，从马等频繁分离到的H3N8亚型早在18世纪的人类中间流行，同时马可以通 过实验感染H3N8亚型AIV这一事实，说明不应低估H3N8亚型AIV在自然界中的作用，应注 意防止马、禽及人类H3亚型AIV的感染，对于H3N8亚型AIV的防控应予以高度重视。目 前，针对AIV的检测方法为传统血清学试验，存在检测耗时长、敏感性较低、不易标准化等 缺点，在实际应用中具有一定的局限性。
[0003] 荧光定量PCR技术实现了对模板的定量，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现 多重反应和实时性好等特点。实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时 间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量快速检 测。多重荧光PCR采用多对引物扩增检测多个模板，克服了单重荧光PCR的不足。但是， 建立多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证 不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪具有相应的多个检测通 道。目前，针对H3N8亚型AIV-步法实时荧光定量RT-PCR方法未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便 的H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，以实现同时检测并定量 H3N8亚型禽流感病毒，为H3N8亚型AIV的监测提供技术支撑。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：H3N8亚型禽流感病毒一步法实 时荧光定量PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4,它们分 别具有序列表SEQ. ID. No. 1和2、SEQ. ID. No. 4和5的碱基序列。
[0006] H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括引物组和探 针组；引物组有引物1至4,它们分别具有序列表SEQ. ID. No. 1和2、SEQ. ID. No. 4和5的碱 基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ. ID. No. 3和6的碱基序列。
[0007] 探针A的5'端标记有报告荧光染料FAM，3'端标记有淬灭荧光染料ECLIPSE ;探 针B的5'端标记有报告荧光染料R0X，3'端标记有淬灭荧光染料ECLIPSE。
[0008] 引物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为3 :3 :3 :2 :2 :2。
[0009] 该试剂盒含有以下试剂：
[0010] A液：PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B ;
[0011] B液：AIV-H3+AIV-N8模板，作为阳性对照；
[0012] C液：ddH20,作为阴性对照。
[0013] A液中引物1、引物2、探针A终浓度均为0. 6 μ M，引物3、引物4、探针B终浓度均 为 0· 4 μΜ。
[0014] 针对目前缺乏对Η3Ν8亚型AIV进行检测和诊断的有效可靠的技术，发明人研宄筛 选了两套特异性的探针和引物，并通过进行不同浓度的配比，获得最佳引物和探针的浓度 组合，据此建立了 Η3Ν8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR的检测方法，并制备了 相应的检测试剂盒。实验证明，本发明具有如下优点：
[0015] 1)检测时间短
[0016] 应用本发明可实现一管二检的目的，并且反转录和PCR -步完成，仅需约30分钟， 并且反应结果可以直接通过电脑观察，而常规的RT-PCR方法起码需要3. 5小时来完成扩增 反应，然后还得花2小时进行凝胶电泳来观察结果；
[0017] 2)检测敏感性高且特异性强
[0018] 当Η3亚型AIV和Ν8亚型AIV同时存在时，本发明对其检测的CT值与单个病毒检 测的CT值比较，结果基本一样，并未影响对Η3亚型AIV和Ν8亚型AIV的检出及检出的敏 感性。另外，利用本发明还可对样品中相应病原含量进行定量，并且检测敏感性非常高，均 能检测到100个拷贝的Η3Ν8亚型AIV，比常规PCR方法敏感性高100倍，可用于Η3Ν8亚型 AIV的快速诊断和监测，因此本发明对Η3Ν8亚型禽流感病毒的防治有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1是荧光定量PCR检测Η3亚型禽流感病毒的敏感性（FAM通道）结果图，图中： 1?7分别为I X IO8?I X 10 2拷贝/ μ 1，8阴性对照。
[0020] 图2是荧光定量PCR检测Η3亚型禽流感病毒的敏感性（FAM通道）的标准曲线。
[0021] 图3是荧光定量PCR检测Ν8亚型禽流感病毒的敏感性（ROX通道）结果图，图中： 1?7分别为I X IO8?I X 10 2拷贝/ μ 1，8阴性对照。
[0022] 图4是荧光定量PCR检测Ν8亚型禽流感病毒的敏感性（ROX通道）的标准曲线。
[0023] 图5是荧光定量PCR检测Η3亚型禽流感病毒的特异性（FAM通道）结果图，图中： 1-12 分别为 Η3Ν8、HlNl、Η3Ν2、Η3Ν6、Η4Ν2、Η4Ν5、Η5Ν1、Η6Ν1、Η6Ν6、Η6Ν8、Η7Ν2、Η9Ν2 亚型 AIV ; 13. NDV ; 14. IBV ; 15. ILTV ; 16. MG ; 17. ARV ; 18.空白对照。
[0024] 图6是荧光定量PCR检测N8亚型禽流感病毒的特异性（ROX通道）结果图，图中： 1-12 分别为 H3N8、HlNl、H3N2、H3N6、H4N2、H4N5、H5N1、H6N1、H6N6、H6N8、H7N2、H9N2 亚型 AIV ; 13. NDV ; 14. IBV ; 15. ILTV ; 16. MG ; 17. ARV ; 18.空白对照。
[0025] 图7是荧光定量PCR检测H3亚型禽流感病毒的批内重复性（FAM通道）结果图， 图中：1-3为IXlO 8拷贝/yL;4.阴性对照。
[0026] 图8是荧光定量PCR检测N8亚型禽流感病毒的批内重复性（ROX通道）结果图， 图中：1-3为IXlO 8拷贝/yL;4.阴性对照。
【具体实施方式】
[0027] 以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂 等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下：
[0028] LightcyCler2· 0荧光定量PCR仪（Roche)。胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自 广州东盛生物科技有限公司；pGEM-T Easy试剂盒购自Promega公司；T7体外转录试剂盒 购自 Fermengtas 公司；One Step PrimeScript RT-PCR Kit 购自大连宝生物公司；DNA/RNA 抽提试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。
[0029] H3N2、H6N8 亚型禽流感病毒记载在 "Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay"，Virol J, 2011，8:337,公众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得；
[0030] HlNl亚型禽流感病毒记载在"利用RT-LAMP可视化检测技术检测Hl亚型禽流感 病毒及NI、N2亚型的分型"，病毒学报，2013, 29(2) : 154-159,公众可从广西壮族自治区兽 医研宄所获得；
[0031] H3N6亚型禽流感病毒记载在基因库NCBI中，登录号为"KM186122-KM186129"，公 众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得；
[0032] H3N8 亚型禽流感病毒记载在 "Genetic Characterization of a Natural Reassortant H3N8Avian Influenza Virus Isolated from Domestic Geese in Guangxi, Southern China"，Genome Announc. 2014, 2(4) :e00747_14,公众可从广西壮族自 治区兽医研宄所获得；
[0033] H4N2亚型禽流感病毒记载在基因库NCBI中，登录号为"KJ881013-KJ881020"，公 众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得；
[0034] H4N5、H5N1、H7N2亚型禽流感病毒记载在"H7N9亚型AIV双重实时荧光定量 RT-PCR检测方法的建立"，动物医学进展，2013, 34 (12) : 1-5,公众可从广西壮族自治区兽医 研宄所获得；
[0035] H6N1 记载在"Complete genome sequence analysis of an H6Nlavian influenza virus isolated from Guangxi pockmark ducks"，J. Virol. 2012, 86:13868 - 13869,公众 可从广西壮族自治区兽医研宄所获得；
[0036] H6N6亚型禽流感病毒和鸡毒霉形体（MG) S6株记载在"Epidemiological Surveillance of Low Pathogenic Avian Influenza Virus (LPAIV) from Po μ Ltry in Guangxi Province, Southern ChinaT3LOS ONE, 2013,8(10) :1_6,公众可从广西壮族自治区 兽医研宄所获得；
[0037] H9N2 禽流感病毒记载在 "Characterization of an avain influenza virus H9N2strain isolated from a wild bird in southern China. Genome Announc''， 2014, 2: e00600-14,公众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得；
[0038] 新城疫病毒（NDV F48E9株）记载在"新城疫病毒强弱毒株LAMP鉴别检测方法的 建立"中国兽医科学，2011，41 (09) : 917-922,公众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得；
[0039] 鸡传染性支气管炎病毒（IBV H52株）记载在"鸡传染性支气管炎病毒RT-LAMP可 视化检测方法的建立"，中国农学通报，2012, 28 (20) : 83-87,公众可从广西壮族自治区兽医 研宄所获得；
[0040] 鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV北京株）记载在"鸡传染性喉气管炎病毒LAMP检测 方法的建立兽医科技，2012, 44(11) :52-55,公众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得； [0041] 禽呼肠孤病毒（ARV S1733株）记载在"禽呼肠孤病毒S1733株单克隆抗体的制备 及夹心ELISA检测方法的建立"，畜牧与兽医，2013, 45(5)，49-52,公众可从广西壮族自治区 兽医研宄所获得。
[0042] 实施例1、引物与Taqman探针的设计与合成
[0043] 根据GenBank中H3亚型AIV和N8亚型AIV病毒的保守序列，米用Primer Express 3.0软件，设计了多套探针和引物，通过分析其引物之间的二聚体，选定两对特异性引物和 两条Taqmam探针（表1)。
[0044] 表1引物和TaqMan探针序列（5' -3'）
[0045]
【权利要求】
1. H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测引物组，其特征在于包括两 对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4,它们分别具有序列表SEQ. ID. No. 1和2、SEQ. ID. No. 4和5的碱基序列。
2. -种H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于 包括引物组和探针组；引物组有引物1至4,它们分别具有序列表SEQ. ID. No. 1和2、SEQ. ID. No. 4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ. ID. No. 3和 6的碱基序列。
3. 根据权利要求1所述的H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试 剂盒，其特征在于：所述探针A的5'端标记有报告荧光染料FAM，3'端标记有淬灭荧光染料 ECLIPSE ;所述探针B的5'端标记有报告荧光染料R0X，3'端标记有淬灭荧光染料ECLIPSE。
4. 根据权利要求2所述的H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试剂 盒，其特征在于：所述引物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为3 :3 :3 :2 : 2 ：2〇
5. 根据权利要求3所述的H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试剂 盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂： A液：PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B ; B液：AIV-H3+AIV-N8模板，作为阳性对照； C液：ddH20,作为阴性对照。
6. 根据权利要求5所述的H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试剂 盒，其特征在于：所述A液中引物1、引物2、探针A终浓度均为0.6 yM，引物3、引物4、探针 B终浓度均为0. 4yM。
【文档编号】C12Q1/70GK104498627SQ201410734982
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】谢芝勋, 刘婷婷, 谢志勤, 邓显文, 罗思思, 刘加波, 谢丽基, 黄莉, 黄娇玲, 曾婷婷, 王盛, 张艳芳 申请人:广西壮族自治区兽医研究所