家禽性别快速鉴定试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种家禽性别快速鉴定试剂盒，属于生物【技术领域】，包括盒体和盒体内的衬垫，所述衬垫上设有孔腔，所述孔腔内分别设有特异性引物混合物JYp、扩增缓冲液、DNAMarker和琼脂糖粉。本实用新型根据同时存在于家禽性染色体W染色体和Z染色体上的CHD1基因序列合理设计PCR引物，利用PCR-琼脂糖电泳技术和基因分型方法，确定个体的性别，具有操作简单方便、鉴定快速、结果准确和价格低廉等优点，避免了采用传统方法耗时、耗力和易出错的缺点。
【专利说明】家禽性别快速鉴定试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型属于生物【技术领域】，利用PCR-琼脂糖电泳技术，提供一种家禽性别鉴定用快速鉴定试剂盒。
【背景技术】
[0002]对于规模化养殖的禽类，其性别的早期鉴定将有助于节约饲养成本，提高养殖效率。蛋禽的养殖一般倾向于雌性的饲养，出雏时正确地鉴定出性别，可以及早淘汰雄性，节约饲养空间以及饲养成本；肉禽养殖中，不同性别的个体其营养需求不同，及早地区分性别可以对个体区别饲养；对于种禽养殖，不同物种需要不同的合理的性别比例，早期的性别鉴定将有助于实现这一过程。目前生产上禽类的性别鉴定方法主要还是翻肛法，尤其对于鸡、鸭来说更是如此。虽然其对个体有一定的应激性，但人工成本的低廉，有其一定的优势。翻肛法在鹅、鸽上的应用并不理想。在生产应用中，依靠人的经验判定雏鸽的性别，其正确率只有70%左右；对于鹅的性别判定，主要是通过咽袋以及其他外观的观察，但效果并不好。近年来，分子生物技术的进步，为这一难题的解决提供了另一种思路，也为我们带来了性别鉴定的另一种全新的手段。
[0003]禽类的性染色体有两种——Z染色体和W染色体。母禽基因型为ZW型，公禽基因型为ZZ型。Z染色体和W染色体在大小上相差悬殊，因此位于Z染色体上的大部分基因在W染色体上并不存在。但是目前也发现有少数基因在禽类Z和W染色体上均存在。这些基因的某些内含子在W染色体和Z染色体中的序列大小不同，这就使得我们能够通过设计保守性引物扩增该区域序列，所得产物经过琼脂糖凝胶电泳，最后根据电泳形成的PCR产物的条带差异来判断个体的性别。
实用新型内容
[0004]本实用新型的目的是针对现有家禽性别鉴定技术的不足，提供一种家禽性别快速鉴定试剂盒，能够准确、快速地进行家禽性别鉴定，价格低廉。
[0005]本实用新型是通过以下技术方案实现的，一种家禽性别快速鉴定试剂盒，包括盒体和盒体内的衬垫，衬垫上设有孔腔，所述孔腔内分别设有特异性引物混合物JYp、扩增缓冲液、DNA Marker和琼脂糖粉。
[0006]进一步地,所述盒体上设有盒盖。
[0007]进一步地，所述盒体的形状为方形。
[0008]进一步地，所述盒体左右侧壁顶部分别设有内盖。
[0009]其中JYp详细信息如下:
[0010]引物混合物JYp表示用于CHDl基因PCR扩增的上下游引物混合物，引物信息如下:
[0011]上游引物5’- TGCAGAAGCAATATTACAAGT- 3’，
[0012]下游引物5’- AATTCATTATCATCTGGTGG - 3’。
[0013]本实用新型家禽性别快速鉴定试剂盒的使用方法:以待测家禽的总DNA为模板，采用家禽性别鉴定用PCR引物进行PCR扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。当扩增产物只出现一条特异性扩增条带时判定为雄性(ZZ型，一条大的PCR产物片段)；当扩增产物同时出现两条特异性扩增条带时判定为雌性(ZW型，一大一小的两条PCR产物片段)。
[0014]1、PCR扩增目的片段
[0015]I) PCR扩增反应体系准备
[0016]在200 μ L的PCR薄壁管中，加入2 yL模板DNA (约50 ng)、12.5 μ L扩增缓冲液、2 μ?引物JYp (10 Mmol/L)和8.5 μ L水，PCR的反应体系为25 U L，充分混匀后短暂离心。
[0017]2) PCR扩增反应程序设置
[0018]在PCR仪上设置PCR的反应条件为:94 V预变性4 min后，94 V变性30s、51 V复性30 s、72 V延伸30 s共35个循环，最后72 V延伸6 min并4 V保存备用。程序设置完毕后，将PCR反应管放入PCR仪进行反应扩增。
[0019]2、鉴定性别
[0020]将2%琼脂糖凝胶置于I X TBE电泳液中。取4-6 μ L反应产物点样于凝胶孔中。室温下，合适的电压(按照电泳槽宽度X 6-8 V)电泳30分钟。根据PCR扩增产物电泳图谱鉴定性别。
[0021]与现有技术相比，本实用新型具有以下有益效果:
[0022]第一，本实用新型由CHDl基因PCR扩增的上下游引物混合物JYp、扩增缓冲液和琼脂糖粉组成，本实用新型通过设计特异性引物，PCR扩增产物更具特异性，保证了通过特异性PCR产物进行家禽性别基因分型的准确性。本实用新型设计合理、使用方便、结果可靠且成本低廉。
[0023]第二，本实用新型根据同时存在于家禽性染色体W染色体和Z染色体上的CHDl基因序列合理设计PCR引物，利用PCR-琼脂糖电泳技术和基因分型方法，确定个体性别，具有操作简单方便、鉴别快速、结果准确等优点，避免了采用传统方法耗时、耗力和易出错的缺点。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为本实用新型家禽性别快速鉴定试剂盒的结构示意图；
[0025]图中:1 一盒体、2 —衬垫、3—特异性引物混合物JYp、4一扩增缓冲液、5 — DNAmarker >6 一琼脂糖粉、7—盒盖、8 —内盖。
【具体实施方式】
[0026]结合实施例和附图作进一步说明本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本实用新型的保护范围。
[0027]如图1所示，一种家禽性别快速鉴定试剂盒，包括盒体1、盒体内的衬垫2、衬垫的各孔腔内分别置入的特异性引物混合物JYp3、扩增缓冲液4、DNA marker 5和琼脂糖粉6。
[0028]盒体上设有盒盖7。
[0029]盒体的形状为方形。
[0030]盒体左右侧壁顶部分别设有可打开和闭合的内盖8。
[0031]本实用新型由CHDl基因PCR扩增的上下游引物混合物JYp、扩增缓冲液和琼脂糖粉组成，设计合理，价格低廉；
[0032]本实用新型根据同时存在于家禽性染色体W染色体和Z染色体上的CHDl基因序列合理设计PCR引物，利用PCR-琼脂糖电泳技术和基因分型方法，确定个体性别，具有操作简单方便、鉴别快速、结果准确等优点，避免了采用传统方法耗时、耗力和易出错的缺点。
[0033]实施例1
[0034]运用本试剂盒对已知性别的8只北京油鸡、8只大骨鸡、8只攸县麻鸭、8只北京鸭、8只朗德鹅、8只雁鹅、8只石岐鸽、8只银羽王鸽进行性别分子鉴定。
[0035]1、样品
[0036]采集家禽个体的血液，应用传统的苯酚/氯仿法提取DNA，并将DNA浓度稀释到50 ng/μ L0
[0037]2、PCR扩增反应及结果
[0038]I) PCR扩增反应体系准备
[0039]在200 μ L的PCR薄壁管中，加入2 yL模板DNA (约50 ng ),12.5 yL扩增缓冲液、2 UL引物JYp(10 Mmol/L)、和8.5 μ L水，PCR的反应体系为25 yL，充分混匀后短暂离心。
[0040]2) PCR扩增反应程序设置
[0041]在Eppendorf PCR仪上设置PCR的反应条件为:94 V预变性4 min后，94 V变性30 s、51 V复性30 s、72 V延伸30 s共35个循环，最后72 V延伸10 min并4 0C保存备用。程序设置完毕后，将PCR反应管放入PCR仪进行反应扩增。
[0042]3、PCR扩增产物的琼脂糖电泳鉴定
[0043]将2%琼脂糖凝胶置于I X TBE电泳液中。取4_10 μ L反应产物点样于凝胶孔中。室温下，合适的电压(按照电泳槽宽度X 6-8 V)电泳30 min。根据PCR扩增产物电泳图谱鉴定性别。
[0044]根据电泳图谱，鉴定基因型。在对应DNA marker 500 bp略下处出现的PCR产物为Z带，在对应DNA marker 250 bp左右出现的PCR产物为W带。因此，如果只出现Z带的，为雄性ZZ型；出现Z、W两条条带的，为雌性ZW型。样品个体分子性别鉴定结果分别为:北京油鸡1-4号为公、5-8号为母，大骨鸡9-12号为公、13-16号为母；攸县麻鸭1-4号为公、5-8号为母，北京鸭9-13号为母，14-16号为公；朗德鹅1_4号为公、5-8号为母,雁鹅9-14号为公、15、16号为母；石岐鴻1-4号为公、5_8号为母,银羽王鸽10、12号为公、9、11、13-16号为母。通过分子鉴定的性别结果与通过解剖观察性腺的结果没有差异。
【权利要求】
1.一种家禽性别快速鉴定试剂盒，包括盒体和盒体内的衬垫，其特征是，所述衬垫上设有孔腔，所述孔腔内分别设有由上游引物5’- TGCAGMGCAATATTACAAGT- 3’和下游引物5’-AATTCATTATCATCTGGTGG - 3’组成的特异性引物混合物JYp、扩增缓冲液、DNA Marker和琼脂糖粉。
2.根据权利要求1所述的家禽性别快速鉴定试剂盒，其特征是，所述盒体上设有盒盖。
3.根据权利要求2所述的家禽性别快速鉴定试剂盒，其特征是，所述盒体的形状为方形。
4.根据权利要求3所述的家禽性别快速鉴定试剂盒，其特征是，所述盒体左右侧壁顶部分别设有内盖。
【文档编号】C12Q1/68GK204079950SQ201420318646
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年6月16日 优先权日:2014年6月16日
【发明者】李慧芳, 刘宏祥, 胡艳, 徐文娟, 贾雪波, 宋迟, 陶志云, 姬改革, 章明 申请人:江苏省家禽科学研究所