一种用于鹅性别鉴定的试剂盒的制作方法

一种用于鹅性别鉴定的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种用于鹅性别鉴定的试剂盒，包括底座、固定在底座上的工具盒及至少一个收纳盒，收纳盒依次叠加并通过转轴与工具盒转动连接；位于顶层的收纳盒内放置衬垫，衬垫上开有通孔，通孔内分别放置用于盛放上下游引物混合物HYp的第一试剂瓶、用于盛放扩增缓冲液的第二试剂瓶、用于盛放DNAmarker的第三试剂瓶及用于盛放琼脂糖粉的第四试剂瓶。本实用新型的有益效果为：试剂盒结构简单，使用方便，且收纳盒内同时存在与鹅性染色体W染色体和Z染色体上的CHD1基因序列合理设计PCR引物，检测时，直接利用PCR-琼脂糖电泳技术和基因分型方法确定个体鹅的性别，提高了鉴别准确率和鉴别效率。
【专利说明】一种用于鹅性别鉴定的试剂盒

【技术领域】
[0001]本实用新型涉及生物【技术领域】，具体而言，涉及一种用于鹅性别鉴定的试剂盒。

【背景技术】
[0002]目前鹅性别鉴定中常用的方法包括外形鉴定法和翻肛鉴定法，对于外形鉴定法是由于雏鹅公母差异较小，所以很多饲养者通过外形判断雌雄性，这种鉴定方法准确率较低，容易出现鉴别错误，所以这种鉴定方法一般用于成年鹅的性别鉴定；对于翻肛鉴定法一般用于雏鹅的性别鉴定，但是翻肛鉴定法必须在出壳后24小时内完成，因为在此时间内雌雄雏鹅生殖隆起的性状最显著，24小时之后肛门发紧，生殖突起萎缩，不便观察，所以使用这种方法往往具有1-2%的误判率，使用该方法同时需要操作者技术娴熟，否则对雏鹅的伤害较大。随着我国养鹅业的发展，快速、及时、准确地鉴别出雏鹅的性别，成了一个亟待解决的问题。
[0003]近年来，分子生物技术的进步，为这一难题的解决提供了另一种思路，人们通过试齐?对于动物性别进行检测，检测过程中人们大多使用试剂盒，为了防止污染，提高检测的准确性和较高的检测速率，试剂盒在行业中不断的被运用。
[0004]目前现有的试剂盒大多比较简单，使用很不方便，试剂盒内的试剂瓶往往与实验用具统一存放，不仅污染程度大，而且往往导致检测结构不准确，另外每次的试剂瓶的位置并不固定，每次使用每次均需要清洗，若清洗不净，很可能造成试剂污染，而且加料和观察时均不方便，使用比较繁琐，降低了鹅性别鉴定的效率，为此提供一种鹅性别鉴定专用的试剂盒成为当前的迫切需要。


【发明内容】

[0005]为解决现有技术中存在的试剂盒大多比较简单，使用很不方便，试剂盒内的试剂瓶往往与实验用具统一存放，不仅污染程度大，而且往往导致检测结构不准确等缺陷，本实用新型的目的在于提供一种用于鹅性别鉴定的试剂盒。
[0006]为达到上述目的，本实用新型实施例中提供了一种用于鹅性别鉴定的试剂盒，包括底座、固定在底座上的工具盒及至少一个收纳盒，收纳盒依次叠加并通过转轴与工具盒转动连接；其中，
[0007]位于顶层的收纳盒内放置衬垫，衬垫上开有通孔，通孔内分别放置用于盛放上下游引物混合物HYp的第一试剂瓶、用于盛放扩增缓冲液的第二试剂瓶、用于盛放DNAmarker的第三试剂瓶及用于盛放琼脂糖粉的第四试剂瓶。
[0008]本实用新型结构简单，使用方便，工具盒内用于盛放较大的且无需消毒的常用工具，收纳盒可以有多层，位于最顶层的收纳盒内放置检测鹅性别所用的试剂，位于下面的收纳盒内可以盛放蒸馏水或者其他需要消毒存放的实验容器，使用时，若不使用实验用具则可仅将顶层的收纳盒打开进行实验，实验容器清洗后，放置在相对应的收纳盒内，试剂瓶清洗或使用后，应防止在相对应的通孔内，放置错放、误放，导致试剂瓶污染，提高了实验检测的准确性，另外收纳盒与工具盒转动连接，可以同时将多个收纳盒打开，也可以将其中一个收纳盒打开，互不影响，实用性强。
[0009]进一步的,工具盒连接储存盒,储存盒位于收纳盒上方；转轴依次穿接收纳盒，且转轴两端分别固定在储存盒与底座上。本技术方案中，进一步描述了在收纳盒顶部安装储存盒，储存盒用于储存常用的工具，例如记录笔等，另外对转轴和收纳盒的连接关系进一步详细描述，收纳盒通过转轴连接，使用更加方便，而且储存盒和收纳盒之间互不影响，便于实验的操作。
[0010]进一步的，储存盒内放置可折叠的紫外线灯和计时器。进一步对储存盒进行限定，储存盒内可以放置紫外线灯及计时器，紫外线灯用于在黑暗条件下照明和用于试验中观察检测情况，收纳方便，操作简单。
[0011]进一步的，收纳盒的侧壁上均安装用于照明和消毒的紫外线杀菌灯，同一收纳盒内的紫外线杀菌灯均为串联连接，不同收纳盒内的紫外线杀菌灯为并联连接。本技术方案中，在收纳盒内需要使用紫外线杀菌灯对实验容器进行杀菌处理，防止细菌影响实验操作，在提供了性别检测试验准确率的前提下，提高了试验效率。不同收纳盒内的紫外线杀菌灯并联连接，可以分别控制。
[0012]进一步的，储存盒内安装用于控制紫外线杀菌灯开启/关闭的开关。本技术方案中，开关安装在储存盒内，开关用于分别控制每层收纳盒内的紫外线杀菌灯的开启或关闭，便于控制，无需将每层收纳盒均打开后再开启或关闭杀菌灯，实用性强。
[0013]进一步的，收纳盒上远离转轴的一端安装第一磁条，工具盒上安装与第一磁条相互吸附的第二磁条。本技术方案中，收纳盒关闭后，收纳盒上的第一磁条与工具盒上的第二磁条相互吸附，保证了收纳盒不会轻易打开，使用方便，另外收纳盒外侧为透明玻璃制作，可以直接观察试剂瓶内的情况，例如用于观察试剂瓶内的试剂量和颜色，使用更加方便。
[0014]进一步的，收纳盒外侧连接提手。本技术方案中，提手用于将收纳盒拉开，使用方便。
[0015]进一步的，衬垫上安装与通孔对应的标签盒，标签盒内放置标签。本技术方案中，在衬垫的标签盒上放置标签，可以很方便的辨别试剂，防止弄混试剂，保证了试验的正常检测，使用方便，操作简单。
[0016]优选的，工具盒侧面连接可插入实验记录本的储物槽。本技术方案中，储藏槽可以放置记录本，记录本用于记录放置在盒体内试剂瓶的种类、温度、以及时间等试验参数，使用方便，减少了实验误差。
[0017]优选的，工具盒侧面开有盛放槽，盛放槽内放置有清洁布。本技术方案中，清洁布用于擦拭试剂盒，保证了试剂盒的干净、卫生。
[0018]本实用新型提供的试剂盒内的试剂瓶中，第一试剂瓶盛放的特异性引物混合物HYp，其中HYp详细信息如下:
[0019]引物混合物HYp表示用于CHDl基因PCR扩增的上下游引物混合物，引物信息如下:
[0020]上游引物5’- TGCAGAAGCAATATTACAAGT- 3’，
[0021]下游引物5’- AATTCATTATCATCTGGTGG - 3’。
[0022]本实用新型的有益效果为:本实用新型结构简单，使用和携带均很方便，便于检测鉴定试验的进行；另外在鹅性别鉴定试验中，利用CHDl基因PCR扩增的上下游引物混合物HYp、扩增缓冲液、DNA marker和琼脂糖粉进行鹅性别鉴定的化学试验，使用更加方便，试剂瓶统一储存在试剂盒的收纳盒内，打开即可使用，本实用新型与现有技术相比，本实用新型使用该试剂盒，根据同时存在于鹅性染色体W染色体和Z染色体上的CHDl基因序列合理设计PCR引物，利用PCR-琼脂糖电泳技术和基因分型方法，确定个体鹅的性别，具有操作简单方便、鉴别快速、结果准确和价格低廉等优点，避免了采用传统方法耗时、耗力和易出错的缺点，提闻了性别鉴定效率。

【专利附图】

【附图说明】
[0023]图1为本实用新型实施例所述的一种用于鹅性别鉴定的试剂盒的结构示意图一；
[0024]图2为本实用新型实施例所述的一种用于鹅性别鉴定的试剂盒的结构示意图二。
[0025]图中，
[0026]1、底座；2、工具盒；3、收纳盒；4、转轴；5、衬垫；6、通孔；7、第一试剂瓶；8、第二试剂瓶；9、第三试剂瓶；10、第四试剂瓶；11、储存盒；12、紫外线灯；13、盛放槽；14、计时器；15、紫外线杀囷灯；16、开关；17、第一磁条；18、第_.磁条;19、提手；20、标签盒；21、储物槽。

【具体实施方式】
[0027]下面通过具体的实施例并结合附图对本实用新型做进一步的详细描述。
[0028]实施例1，如图1所示，本实用新型实施例所述的一种用于鹅性别鉴定的试剂盒，包括底座1、固定在底座上的工具盒2及至少一个收纳盒3，收纳盒依次叠加并通过转轴4与工具盒转动连接；其中，
[0029]位于顶层的收纳盒内放置衬垫5，衬垫上开有通孔6，通孔内分别放置用于盛放上下游引物混合物HYp的第一试剂瓶7、用于盛放扩增缓冲液的第二试剂瓶8、用于盛放DNAmarker的第三试剂瓶9及用于盛放琼脂糖粉的第四试剂瓶10。
[0030]该试剂盒结构简单，工具盒内用于盛放较大的且无需消毒的常用工具，收纳盒可以有多层，位于最顶层的收纳盒内放置检测鹅性别所用的试剂，位于下面的收纳盒内可以盛放蒸馏水或者其他需要消毒存放的实验容器，使用时，若不使用实验用具则可仅将顶层的收纳盒打开进行实验，实验容器清洗后，放置在相对应的收纳盒内，试剂瓶清洗或使用后，应防止在相对应的通孔内，放置错放、误放，导致试剂瓶污染，提高了实验检测的准确性，另外收纳盒与工具盒转动连接，可以同时将多个收纳盒打开，也可以将其中一个收纳盒打开，互不影响，实用性强。
[0031]具体检测时，使用该试剂盒内的PCR引物对鹅性别鉴定的方法为:以待测鹅的总DNA为模板，采用鹅性别鉴定用PCR引物进行PCR扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，当扩增产物只出现466 bp的特异性扩增条带时判定为公鹅(ZZ型，一条大的PCR产物片段)，当扩增产物同时出现466 bp的特异性扩增条带和326 bp的特异性扩增条带时判定为母鹅(ZW型，一大一小的两条PCR产物片段)。其中，条带的大小以及序列是通过将扩增产物送由测序公司测序得到的。
[0032]实施例2，如图1-2所示，本实用新型实施例所述的一种用于鹅性别鉴定的试剂盒，包括底座、固定在底座上的工具盒及至少一个收纳盒，收纳盒依次叠加并通过转轴与工具盒转动连接；其中，
[0033]位于顶层的收纳盒内放置衬垫，衬垫上开有通孔，通孔内分别放置用于盛放上下游引物混合物HYp的第一试剂瓶、用于盛放扩增缓冲液的第二试剂瓶、用于盛放DNAmarker的第三试剂瓶及用于盛放琼脂糖粉的第四试剂瓶。
[0034]本技术方案中，进一步所述的工具盒连接储存盒11,储存盒位于收纳盒上方；转轴依次穿接收纳盒，且转轴的两端分别固定在储存盒与底座上。本技术方案中，进一步所述的储存盒内放置可折叠的紫外线灯12和计时器14。本技术方案中，进一步所述的收纳盒的侧壁上均安装用于照明和消毒的紫外线杀菌灯15，同一收纳盒内的紫外线杀菌灯均为串联连接，不同收纳盒内的紫外线杀菌灯为并联连接。本技术方案中，进一步所述的储存盒内安装用于控制紫外线杀菌灯开启/关闭的开关16。
[0035]本技术方案中，进一步所述的收纳盒上远离转轴的一端安装第一磁条17，工具盒上安装与第一磁条相互吸附的第二磁条18。本技术方案中，进一步所述的收纳盒外侧连接提手19。
[0036]本技术方案中，进一步所述的衬垫上安装与通孔对应的标签盒20，标签盒内放置标签。本技术方案中，优选的所述工具盒侧面连接可插入实验记录本的储物槽21。本技术方案中，优选的所述工具盒侧面开有盛放槽13，盛放槽内放置有清洁布。
[0037]具体使用时，首先将收纳盒旋转打开，然后利用收纳盒内的试剂进行实验，如果在屋内进行实验，可以将折叠灯打开，便于实验的进行，实验时将数据记录在记录本上。实验结束后，通过清洁布清洁试剂盒，然后通过清洗实验容器，并将清洗后的实验容器放置在收纳盒内，打开紫外线杀菌灯，对清洗后的容器进行杀菌消毒，实用性强。
[0038]本实用新型提供的试剂盒内的试剂瓶中，第一试剂瓶盛放的特异性引物混合物HYp，其中HYp详细信息如下：
[0039]引物混合物HYp表示用于CHDl基因PCR扩增的上下游引物混合物，引物信息如下：
[0040]上游引物5’- TGCAGAAGCAATATTACAAGT- 3’，
[0041]下游引物5’- AATTCATTATCATCTGGTGG - 3’。
[0042]鹅性别鉴定的检验原理：禽类的性染色体有两种一Z染色体和W染色体。母禽基因型为ZW型，公禽基因型为ZZ型。Z染色体和W染色体在大小上相差悬殊，因此位于Z染色体上的大部分基因在W染色体上并不存在。但是目前也发现有少数基因在禽类Z和W染色体上均存在。这些基因的某些内含子在W染色体和Z染色体中的序列大小不同，这就使得我们能够通过设计保守性引物扩增该区域序列，所得产物经过琼脂糖凝胶电泳，最后根据电泳形成的PCR产物的条带差异来判断个体的性别。
[0043]本实用新型提供的试剂盒使用方法：
[0044]I、PCR扩增目的片段：
[0045]I) PCR扩增反应体系准备：在200 μ L的PCR薄壁管中，加入2 μ L模板DNA (约50 ng)、12. 5 μ L扩增缓冲液、2 PL引物HYp (10 Mmol/L)和8. 5 μ L水，PCR的反应体系为25 μ L，充分混匀后短暂离心。
[0046]2)PCR扩增反应程序设置：在Eppendorf PCR仪上设置PCR的反应条件为：在94°C的温度下预变性4 min后，继续在94°C的温度下变性30 S，然后在53.2°C的温度下复性30s，最后在72°C的温度下延伸30 S，这样为一个循环，共进行35个循环，最后在72°C的温度下延伸6 min,并在4°C的温度下保存备用，程序设置完毕后，将PCR反应管放入PCR仪进行反应扩增。
[0047]2、鉴定性别:将2%琼脂糖凝胶置于I X TBE电泳液中，取4-10 μ L反应产物点样于凝胶孔中，室温下，合适的电压(按照电泳槽宽度Χ6-8 V)电泳20分钟，根据PCR扩增产物电泳图谱鉴定性别。
[0048]使用本实用新型提供的试剂盒进行如下试验:运用本试剂盒对已知性别的8只13胚龄朗德鹅鹅胚、8只13胚龄伊犁鹅鹅胚进行分子性别分型鉴定。
[0049]1、样品:采集8只13胚龄朗德鹅鹅胚和8只13胚龄伊犁鹅鹅胚的尿囊膜，应用传统的苯酚/氯仿法提取DNA，并将DNA浓度稀释到50 ng/ μ L。
[0050]2、PCR扩增反应及结果
[0051 ] DPCR扩增反应体系准备:在200 μ L的PCR薄壁管中，加入2 μ L模板DNA (约50 ng)、12.5 UL扩增缓冲液、2 μ L引物HYp (10 Mmol/L)和8.5 yL水，PCR的反应体系为25 μ L，充分混匀后短暂离心。
[0052]2 ) PCR扩增反应程序设置:
[0053]在Eppendorf PCR仪上设置PCR的反应条件为:在94°C的温度下预变性4 min后，继续在94°C的温度下变性30 S，然后在53.2 V的温度下复性30 S，最后在72°C的温度下延伸30 S，这样为一个循环，共进行35个循环，最后在72°C的温度下延伸6 min，并在4°C的温度下保存备用，程序设置完毕后，将PCR反应管放入PCR仪进行反应扩增。
[0054]3、PCR扩增产物的琼脂糖电泳鉴定
[0055]将2%琼脂糖凝胶置于IXTBE电泳液中，取4_10 μ L反应产物点样于凝胶孔中，室温下，合适的电压(按照电泳槽宽度X 6-8 V)电泳20分钟，根据PCR扩增产物电泳图谱鉴定性别。
[0056]根据电泳图谱，鉴定基因型，在对应DNA marker 500 bp处出现的PCR产物为Z带466 bp，在对应DNA marker 250-500 bp之间出现的PCR产物为W带326 bp。因此，只在对应DNA marker 500 bp处出现一条PCR产物的的雄性ZZ型；在对应DNA marker 250-500bp之间出现两条PCR产物的雌性ZW型，样品个体分子性别鉴定结果与其已知性别核对无误。
[0057]以上所述仅为本实用新型的优选实施例而已，并不用于限制本实用新型，对于本领域的技术人员来说，本实用新型可以有各种更改和变化。凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种用于鹅性别鉴定的试剂盒，其特征在于，包括底座(I)、固定在底座上的工具盒(2)及至少一个收纳盒(3),收纳盒依次叠加并通过转轴(4)与工具盒转动连接；其中， 位于顶层的收纳盒内放置衬垫(5)，衬垫上开有通孔(6)，通孔内分别放置用于盛放上下游引物混合物HYp的第一试剂瓶(7)、用于盛放扩增缓冲液的第二试剂瓶(8)、用于盛放DNA marker的第三试剂瓶(9)及用于盛放琼脂糖粉的第四试剂瓶(10)。
2.根据权利要求1所述的用于鹅性别鉴定的试剂盒，其特征在于，工具盒连接储存盒(11)，储存盒位于收纳盒上方；转轴依次穿接收纳盒，且转轴的两端分别固定在储存盒与底座上。
3.根据权利要求2所述的用于鹅性别鉴定的试剂盒，其特征在于，储存盒内放置可折叠的紫外线灯(12)和计时器(14)。
4.根据权利要求3所述的用于鹅性别鉴定的试剂盒，其特征在于，收纳盒的侧壁上均安装用于照明和消毒的紫外线杀菌灯(15)，同一收纳盒内的紫外线杀菌灯均为串联连接，不同收纳盒内的紫外线杀菌灯为并联连接。
5.根据权利要求4所述的用于鹅性别鉴定的试剂盒，其特征在于，储存盒内安装用于控制紫外线杀菌灯开启/关闭的开关(16)。
6.根据权利要求2所述的用于鹅性别鉴定的试剂盒，其特征在于，收纳盒上远离转轴的一端安装第一磁条(17)，工具盒上安装与第一磁条相互吸附的第二磁条(18)。
7.根据权利要求6所述的用于鹅性别鉴定的试剂盒，其特征在于，收纳盒外侧连接提手(19)。
8.根据权利要求1所述的用于鹅性别鉴定的试剂盒，其特征在于，衬垫上安装与通孔对应的标签盒(20 )，标签盒内放置标签。
9.根据权利要求1所述的用于鹅性别鉴定的试剂盒，其特征在于，工具盒侧面连接可插入实验记录本的储物槽(21)。
10.根据权利要求1所述的用于鹅性别鉴定的试剂盒，其特征在于，工具盒侧面开有盛放槽(13)，盛放槽内放置有清洁布。
【文档编号】C12M1/00GK204111736SQ201420524491
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】刘宏祥, 徐文娟, 胡艳, 束婧婷, 宋迟, 李慧芳, 章双杰, 单艳菊, 陶志云, 姬改革 申请人:江苏省家禽科学研究所