一种融合蛋白CR2-Linker-GDH及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种融合蛋白CR2-Linker-GDH及其应用，属于基因工程和生物催化【技术领域】。本发明通过将羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶进行融合表达，实现这两个酶的偶联，利用成功构建的重组菌胞内分离纯化后的融合蛋白进行生物转化COBE获得S-CHBE。通过优化反应条件，融合蛋白可完全转化底物，产物的光学纯度>99％，完全转换数(TTN)高达1200。通过底物分批补加策略，底物终浓度为305mmol/L，产物的得率高达53％，得到162mmol/L的产物，e.e.值保持＞99％。本发明为辅酶再生循环途径耦合入S-CHBE的生物转化途径提供新的研究思路，对于简化手性转化途径具有重要意义。
【专利说明】_种融合蛋白CR2-Linker-GDH及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种融合蛋白CR2-Linker-GDH及其应用，属于基因工程和生物催化
【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 手性醇类化合物是一类医药/食品/农药化学/精细化工/化妆品等领域的重要 中间体。光学纯的（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[(S)-CHBE]是合成降胆固醇药物阿托伐他 汀（Atovastatin)/轻甲基戊二酸甲酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂及生物碱SlageninsB 和C等药物的前体物质。在其的生产方法中，生物法具有反应条件温和/反应步骤少等优 势，且该方法具有很强的立体和对映选择性。
[0003] 通过氧化还原酶进行生物转化的理论收率可以达到100%，但是在氧化还原酶的 应用中，除了需要合适的酶外，还需要提供高效/低成本的辅酶再生系统。辅酶的生物法 再生通常包括酶耦联法和底物耦联法，其中酶耦联法是利用两个平行的氧化还原反应酶系 统，一个酶催化底物转化，另一个酶则催化辅酶循环再生。
[0004] 在传统的酶耦联法再生体系中，需要分别添加底物催化酶和辅酶循环酶两种酶， 操作麻烦，成本高，且辅酶在两个酶分子间传递，有可能造成辅酶再生效率不高。利用融合 策略构建人工酶有可能使两个酶的活性位点接近，从而提高催化效率。
[0005] 亚磷酸脱氢酶（PTDH)能以廉价的亚磷酸盐作为底物实现NADPH的再生， Torres Pazmifio等构建了一系列B-V单加氧酶（BVMOs)和PTDH的融合酶，在NADP浓度只 有5umol/L时，仍能实现苯丙酮到乙酸苄酯的有效转化（79%，3h)，融合后各个酶都能保持 天然酶的催化活性。H lsch等构建了甲酸脱氢酶（FDH)和3-酮酰基-ACP还原酶（KR)的 融合酶进行手性醇生产，与两个酶混合物相比，初始催化速度提高了 2倍，底物转化率能达 到 99. 97%，并且具有极高的光学选择性（99. 9% (S)-l-(pentafluorophenyl)ethanol)。
[0006] 本发明构建了一种融合蛋白，同时具备羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的活性，以一 定浓度的4-氯乙酰乙酸乙酯（C0BE)为底物，葡萄糖为辅助底物，利用融合蛋白进行生物转 化反应，实现了催化和辅酶循环的双重功能。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种融合蛋白，同时具备羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的活 性，本发明利用基因工程技术实现两种酶蛋白的融合，实现了双酶功能的成功整合。利用该 融合蛋白为催化剂可不对称转化制备（S) -4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
[0008] 所述羰基还原酶的氨基酸序列是SEQ ID NO. 1所示的序列。
[0009] 所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列是SEQ ID NO. 2所示的序列。
[0010] 编码所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列之间连接有寡肽接头： (ggggs)3〇
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述寡肽接头为柔性的寡肽接头（ggggs)3。
[0012] 所述融合蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO. 3所示的序列。
[0013] 编码所述融合蛋白的基因的核苷酸序列是SEQ ID NO. 4所示的序列。
[0014] 本发明还提供一种表达所述融合蛋白的重组大肠杆菌。
[0015] 本发明还提供一种所述融合蛋白在制备（S)-4_氯-3-羟基丁酸乙酯方面的应用。
[0016] 所述应用，在本发明的一种实施方式中，是以C0BE为底物，葡萄糖为辅助底物，融 合蛋白为催化剂，添加定量的NADP+，进行不对称转化反应，得到（S) -4-氯-3-羟基丁酸乙 酯。
[0017] 所述应用，在本发明的一种实施方式中，是以C0BE为底物，在30°C，pH 5. 5的醋酸 缓冲液中，加入7U融合蛋白CR2,0. 05mmol/LNADP+，反应90min。该实施方式是优化反应条 件的实施方式，在该实施方式下产率为100%。
[0018] 本发明通过将羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶两个酶的编码基因融合表达，实现这两 个酶的偶联，成功构建的重组菌的融合蛋白表达量可达到〇. 143g/g(蛋白/菌体）。本发 明的融合蛋白的羰基还原酶的Km是没有发生融合的单一的羰基还原酶Km的1. 4倍，对底 物C0BE的Vmax为58. 82 y mol/min*mg比单一蛋白的Vmax值50. 66提高了 16%，催化效率 kcat/Km是单一蛋白CR2催化效率的2. 8倍。
[0019] 本发明还利用胞内分离纯化后的融合蛋白进行生物转化C0BE获得S-CHBE，底物 能够完全转化，产物的光学纯度>99%，完全转换数（TTN)高达1200。融合蛋白催化转化 C0BE的最适pH为5. 5,最适温度为30°C条件，最适辅酶浓度0. 05mmol/L，最适条件下的反 应转化率100%，6.6.值>99%。通过底物分批补加策略，底物终浓度为305_〇1/1，产物的 得率高达53 %，得到162mmol/L的产物，e. e.值保持>99 %。这些工作为辅酶再生循环途径 耦合入S-CHBE的生物转化途径提供新的研宄思路，对于简化手性转化途径具有重要意义。 本发明为成功整合两种氧化还原酶的生物功能，高效经济制备手性化合物提供一条崭新的 思路。
【具体实施方式】
[0020] 产物光学纯度的检测：采用HPLC分析，色谱柱为Chiralcel 0B-H柱 (4.6_X25cm;Daicel Chemical Ltd;Japan)，流动相为正己烧/异丙醇（9:1)，流速为 0. 5mL/min，S-CHBE和R-CHBE的出峰时间分别为19. 4min和16. 5min。根据峰面积计算得 到产物e. e.值。
[0021] 底物/产物浓度定量：采用GC分析，色谱柱为Varian PEG-20M毛细管柱，气化室 温度250°C，检测器温度300°C，柱温从60°C保留2. 5min，以20°C /min升温至180°C，然后 保持6. 5min。内标为苯戊酮（Valerophenone)。苯戊酮，CHBE出峰时间分别为11.2min， 1L 5min〇
[0022] 产物（S) -4-氯-3-羟基丁酸乙酯对映过量值的计算：
[0023] 对映过量值（e. e. % ) = [(CS_CRV(CS+CR)]*100%
[0024] 产物（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯产率的计算：产率（％ ) = CS/C0*100%
[0025] 其中，式中CS为反应后（S)_对映体的浓度，CR为反应后（R)-对映体的浓度，C0 为反应前底物4-氯乙酰乙酸乙酯的浓度。
[0026] 实施例1 :融合基因的获得
[0027]采用从 E. coliBL21/pET-CR2 和 E. coliBL21/pET-GDH 中通过抽提质粒、PCR 扩增 的方法，或者是直接化学合成的方法，获得羰基还原酶CR2和葡萄糖脱氢酶GDH的核苷酸序 列（分别如SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示），其氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2所示。
[0028] 采用重叠延伸PCR的方法，在两个基因之间添加一个柔性的寡肽接头（GGGGS) 3，得 到融合表达基因cr2-linker-gdh。融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，其编码的 氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0029] 所述融合基因的获得方法，具体是：
[0030] (1)以质粒pET-cr2为模板，利用上游引物1(序列如SEQ ID N0.7所示）、下游引 物2 (序列如SEQ ID NO. 8所示），通过PCR反应扩增cr2基因片段；
[0031] (2)以质粒pET-gdh为模板，利用上游引物3(序列如SEQ ID N0.9所示）、下游引 物4 (序列如SEQ ID NO. 10所示），通过PCR反应扩增gdh基因片段。
[0032] (3)cr2、gdh两片段经退火重叠连接后于72°C在DNA聚合酶的作用下延伸至完整 的双链；以上一轮获得的完整双链DNA为模板，利用引物1和引物4PCR获得融合表达基因 cr2-linker-gdh〇
[0033] 实施例2 :表达融合蛋白CR2-Linker-GDH的基因工程菌的构建
[0034] (1)将实施例1得到的融合基因进行纯化后连接到PMD-19T载体上，转化大肠杆菌 E. coliJM109感受态细胞，筛选正确的重组质粒pMD-C-L-G，并测序验证；
[0035] (2)利用限制性内切酶NdeI和NotI分别对重组质粒pMD-C-L-G和pET-28a进 行酶切，胶回收和纯化酶切产物，线性化的pET-28a载体与c-1-g基因片段在T4连接酶的 作用下连接，获得带有两个目的基因cr2和gdh的重组质粒，筛选正确的重组质粒，命名为 pET-C-L-G。
[0036](3)将上一步得到的重组质粒pET-C-L-G转化感受态E. coliBL21 (DE3)，获得最终 阳性菌株 E.coli BL21/pET-C-L-G。
[0037] 实施例3:融合蛋白的诱导表达
[0038] 挑取重组菌株E. coli BL21/pET-C_L_G单菌落接种于5mL含50 y g/mL的卡那霉 素的LB液体培养基中，于37 °C，200rpm振荡培养过夜，取lmL培养液转接于50ml含50 y g/ mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C，200rpm振荡培养至0D为0. 6-0. 8后，培养物中加 入诱导物异丙基一D-硫代半乳糖苷IPTG 0?lmmol/L，于17°C下诱导培养10h ;10,000rpm 离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤两次，收集得到重组菌全细胞。融合蛋白表达量可达 到0? 143g/g (蛋白/菌体）
[0039] 将收集的重组菌全细胞重悬在纯化要用的进样缓冲液中，超声破碎：工作时间 2s，间歇时间3s，共20min;破碎液12000rpm离心30min;弃沉淀，取上清进行后续的蛋白纯 化工作；
[0040] 蛋白纯化：先将上清挂QIAGEN公司的Ni柱，用10-15%的洗脱缓冲液洗脱杂蛋 白，用20 %的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，最后用30 %的洗脱缓冲液洗脱杂蛋白，收集目的 蛋白进行超滤浓缩和脱盐。经SDS-PAGE检测目的蛋白纯度达到95%以上。
[0041] 实施例4:融合蛋白CR2-Linker-GDH的应用
[0042] 以C0BE为底物，葡萄糖为辅助底物，融合蛋白为催化剂，添加定量的NADP+，进 行不对称转化反应：在lmL 0? lmol/L pH4. 0-6. 0的醋酸缓冲液中，或者lmL 0? lmol/L pH6. 0-8. 0的磷酸缓冲液中，或者lmL 0. lmol/L pH8. 0-9. 0的Tris-HCl缓冲液中，底物 4-氯乙酰乙酸乙酯的浓度为10g/L，葡萄糖浓度13. 5g/L，NADP+浓度0. 012?0. 2mmol/L， 反应温度为25-50°C。反应结束后，取lOOyL反应液，加入10yL内标苯戊酮，90yL乙酸 乙酯萃取，有机相进行分析。取500 y L反应液，加入500 y L正己烧萃取，有机相进行分析。
[0043] 实施例5 :不同条件对催化反应的影响
[0044] 利用纯化后的目的蛋白催化转化C0BE，探索不同条件对转化效果的影响。以C0BE 为底物，葡萄糖为辅助底物，融合蛋白为催化剂，添加定量的NADP+，进行不对称转化反应。
[0045] (1)反应pH对融合蛋白体系不对称催化还原C0BE的影响
[0046] lmL反应体系，C0BE为10g/L，葡萄糖为13.5g/L，辅酶0.02mmol/L，在不同pH缓 冲液中（4. 0-9. 8)，0? lmol/L pH4. 0-6. 0 的醋酸缓冲液，或者 0? lmol/L pH6. 0-8. 0 的磷酸 缓冲液，或〇. lmol/L pH8. 0-9. 0的Tris-HCl缓冲液中，35°C条件下反应。取100 y L反应 体系，加入10 y L内标，90 y L乙酸乙酯萃取，进气相。结果发现，融合蛋白在pH 5. 5下催化 转化C0BE效果最好。
[0047] (2)反应温度对融合蛋白体系不对称催化还原C0BE的影响
[0048] 取获到最大TTN值时的辅酶浓度0. 02mmol/L，1ml反应体系，C0BE为10g/L，葡萄 糖为13. 5g/L。在不同温度条件25、30、35、40、45、50°〇下反应，取100 1^反应体系，加入 10 y 1内标，90 y L乙酸乙酯萃取，进气相。结果发现，融合蛋白在30°C下催化转化C0BE效 果最好。
[0049] (3)酶催化剂浓度及辅酶浓度对融合蛋白催化反应效率的影响
[0050] 在lmL反应体系，C0BE为10g/L，葡萄糖为13. 5g/L，缓冲液pH5. 5,30°C条件下，辅 酶的范围0. 012?0. 2mmol/L，融合蛋白的范围CR22?8U，反应90min，得到最适辅酶浓度 0. 05mmol/L，催化剂浓度7U，反应转化率100 %，e. e.值>99 %。
[0051] 通过条件优化，反应最适条件为：30°C、反应体系pH 5. 5、辅酶浓度0. 05mmol/L。
[0052] 实施例6酶学性质或其他
[0053] (1)融合蛋白C-L-G酶促反应最适pH和pH稳定性
[0054] 融合蛋白中羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的最适pH和稳定性分开测。
[0055] 羰基还原酶：总体积为100 y L的体系包括20mmol/L C0BE，1. 2mmol/L NADPH和 0. lmol/L不同pH值缓冲液，在30°C恒温2min，加入适量酶液测定其酶活，考察该酶的最适 pH。以所测定不同pH缓冲液中的最高酶活作为100%酶活对照，其它pH条件下所测酶活以 对照酶活的百分比表示。
[0056] 将电泳纯的酶液在不同pH缓冲液中，于4°C分别放置24h后，取等量的酶液测定残 余酶活，考察该酶的pH稳定性。以4°C，pH 5. 5条件下的新鲜电泳纯酶液的酶活作为100% 酶活对照，其它pH条件下酶活以对照酶活的百分比表示。
[0057] 葡萄糖脱氢酶：总体积为100 y L的体系包括10mmol/L葡萄糖，1. 2mmol/LNADPH 和0. lmol/L不同pH值缓冲液，其他条件同上。
[0058] 结果发现，融合蛋白的CR2在酸性和中性条件下较稳定，⑶H在pH 5. 5-6. 5即弱 酸性条件下较稳定。
[0059] (2)融合蛋白C-L-G酶促反应最适温度和温度稳定性
[0060] 融合蛋白中羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的最适温度和温度稳定性分开测。
[0061] 羰基还原酶：总体积为100uL的体系包括20mmol/L底物COBE，1.2mmol/L辅酶 NADPH和0. lmol/L醋酸钠（pH 5. 5)缓冲液，在不同温度（25?70°C )的水浴中恒温2min， 分别加入适量的电泳纯酶液测定其酶活，考察该酶的最适温度。以所测的不同反应温度下 最高酶活为100%酶活（对照），其它温度条件下所测酶活以对照酶活的百分比表示。
[0062] 将电泳纯酶液在不同温度（25?70°C )下分别保温12h，然后取等量的酶液测定 其残余酶活，考察该酶的热稳定性。以pH 5. 5条件下新鲜电泳纯酶液的酶活作为100%酶 活对照，其它温度下酶活以对照酶活的百分比表示。
[0063] 葡萄糖脱氢酶：总体积为100 y 1的体系包括10mmol/L葡萄糖，1. 2mmol/L NADP+ 和0. lmol/L醋酸钠（pH 5. 5)缓冲液，其他条件同上。
[0064] 通过实验得出融合蛋白的CR2催化还原C0BE的最适反应温度为50°C，⑶H氧化葡 萄糖的最适反应温度为40°C。融合蛋白的CR2在35-52°C之间具有大于70%酶活力，⑶H 在30-42°C间具有大于70 %酶活力。同时结果表明，融合蛋白CR2在25?40°C之间均可保 持50%以上的活力。
[0065] (3)金属离子对融合蛋白C-L-G酶促反应影响
[0066] 选取 Mg2+、Zn2+、Ca2+、Mn2+、Ni 2+、Cu2+、Co2+、Fe3+和 EDTA，考察其对融合蛋白酶活的 影响。
[0067] 结果发现EDTA会抑制融合蛋白的活性，所在条件下测得酶活为不加EDTA时的 28%。说明融合蛋白表现为金属离子依赖性。Fe3+完全抑制催化活性，其余二价金属离子 均会提高其活性，其中在加入25mM的Ca 2+时酶活提高最大，达到对照的412%。
[0068] (4)融合蛋白C-L-G中CR2酶促反应动力学性质研宄
[0069] 融合蛋白CR2动力学参数测定：分别以辅酶NADPH为变量（0? 3?1. 2mmol/L)，在 不同底物C0BE浓度下测定酶活力，考察不同底物C0BE浓度（0. 5?5mmol/L)对CR2酶促 反应速率的影响。
[0070] 经过实验作图计算，得到融合蛋白CR2的动力学性质参数，米氏常数Km是表征酶 与底物之间亲和力的常数，Km越小，表示酶与底物之间的亲和力越大，即达到最大反应速 率一半时所需要的辅酶量就越小。融合蛋白CR2的Km(l. 17mmol/L)是单一蛋白CR2其 Km(0. 83mmol/L)的1.4倍，可以推测，融合蛋白CR2反应体系中，相比于单一蛋白CR2对还 原型辅酶NADPH的需求量更大。融合蛋白CR2对底物C0BE的Vmax为58. 82umol/min*mg， 较单一蛋白CR2的Vmax值50. 66偏大。融合蛋白CR2催化效率keat/Km为1. 0*105L/mol*S， 是单一蛋白CR2催化效率的2. 8倍。
[0071] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1. 一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶。
2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述羰基还原酶的氨基酸序列是SEQ ID NO. 1所示的序列；所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列是SEQ ID NO. 2所示的序列。
3. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，编码所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢 酶的氨基酸序列之间连接有寡肽接头（GGGGS)3。
4. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO. 3所不的序列。
5. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，编码所述融合蛋白的核苷酸序列是 SEQ ID NO. 4所示的序列。
6. 携带编码权利要求1-5任一所述融合蛋白的基因的载体。
7. 表达权利要求1-5任一所述融合蛋白的基因工程菌。
8. 权利要求1-5任一所述融合蛋白在制备（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯方面的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用以C0BE为底物，葡萄糖为辅助底 物，融合蛋白为催化剂，添加定量的NADP+，进行不对称转化反应，制备得到（S) -4-氯-3-羟 基丁酸乙酯。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用是以C0BE为底物，在30°C，pH 5. 5的醋酸缓冲液中，加入7U融合蛋白CR2,0. 05mmol/L NADP+，反应90min。
【文档编号】C12N15/70GK104450637SQ201510001375
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2015年1月4日 优先权日:2015年1月4日
【发明者】穆晓清, 徐岩 申请人:江南大学