柱状黄杆菌快速检测引物及检测方法

柱状黄杆菌快速检测引物及检测方法
【专利摘要】本发明公开了柱状黄杆菌快速检测引物及检测方法，柱状黄杆菌快速检测引物是由外引物和内引物组成，所述外引物由SEQ ID NO.1所示的外引物上游引物和SEQ ID NO.2所示的外引物下游引物组成；所述内引物由SEQ ID NO.3所示的内引物上游引物和SEQ ID NO.4所示的内引物下游引物组成。本发明的优点：(1)检测周期短、成本低、不依赖专业设备和技术人员、能应用于现场检测，检测操作，简单快速。(2)准确性高，灵敏度较常规的PCR高1-2个数量级。(3)检测成本低，无需PCR仪之类的专业仪器设备，只需一台控温精准的水浴锅或恒温金属浴，操作简便，适合现场检测。
【专利说明】柱状黄杆菌快速检测引物及检测方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种柱状黄杆菌快速检测引物及检测方法，属于养殖鱼类病原菌快速 检测领域。

【背景技术】
[0002] 鱼类细菌性烂尾、烂鳃病是一种发生于世界范围内的、几乎危害所有的淡水养殖 鱼类的疾病。该病病原为柱状黄杆菌，为革兰氏阴性长杆状菌，是一种条件致病菌，可导致 被感染鱼类体表及鳃严重溃烂致鱼死亡或导致观赏鱼观赏价值的丧失，造成的经济损失十 分巨大。目前对于柱状黄杆菌致病机理尚不完全明确，对于柱状黄杆菌的防控，早期检测及 早发现病原，及时采取有效措施至关重要。目前对于柱状黄杆菌的检测，多采用传统的细菌 分离培养技术，耗时长，成本高；生产中也根据病鱼症状及显微镜镜检结果来判断，准确性 欠佳，且均需要专业的技术人员及仪器设备，养殖生产中亟需一种可以用于养殖现场的操 作简便的柱状黄杆菌快速有效的检测技术。
[0003] 环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)是2000 年以后发展起来的一种新型核酸等温扩增技术，其基本原理是利用链置换型聚合酶在合成 新链的同时置换出原链，从而为下一轮扩增制备模板，扩增不需变性步骤，可以在等温条件 下进行。经过十几年的发展，LAMP检测技术已显示出较好的应用前景，国内外近年来已建立 了多种病原生物的LAMP检测技术，60?90min即可完成整个检测过程，通过加入钙黄绿素， 有核酸扩增即可显示颜色反应，即时得到检测结果，具较强的实用性，更适合于应用于养殖 现场及大批量样品的检疫，灵敏度可与实时定量PCR相比。


【发明内容】

[0004] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种柱状黄杆菌快速检测引物。
[0005] 本发明的第二个目的是提供一种对鱼体损伤小的、快速准确、操作简便的柱状黄 杆菌快速检测方法。
[0006] 本发明的第三个目的是提供第二种对鱼体损伤小的、快速准确、操作简便的柱状 黄杆菌快速检测方法。
[0007] 本发明的技术方案概述如下：
[0008] -种柱状黄杆菌快速检测引物，是由外引物和内引物组成，所述外引物由SEQ ID NO. 1所示的外引物上游引物和SEQ ID NO. 2所示的外引物下游引物组成；所述内引物由 SEQ ID NO. 3所示的内引物上游引物和SEQ ID NO. 4所示的内引物下游引物组成。
[0009] 一种柱状黄杆菌快速检测方法，包括如下步骤：
[0010] (1)提取待检样品DNA ;
[0011] (2)在装有19 ill LAMP反应基础液的200 ill PCR反应管中加入4 ill引物混合液， I ill Bst DNA聚合酶，I ill待检样品DNA模板，配成25 ill的LAMP反应体系；于60-65 °C 放置40-60min，再于85°C放置15min得到检测液；
[0012]所述 19 ii I LAMP 反应基础液组成：1. 5 ii I dNTP，2. 5 ii I IOXThermopol Roaction Buffer，I u I I丐黄绿素和 14 u I DEPC 水；
[0013] 所述引物混合液是等体积的浓度为5 y mol/L由SEQ ID NO. 1所示的外引物上游 引物，浓度为5iimol/L由SEQ ID NO. 2所示的外引物下游引物，浓度为40iimol/L由SEQ ID NO. 3所示的内引物上游引物和浓度为40 iimol/L由SEQ ID NO. 4所示的内引物下游引 物组成；
[0014] (3)肉眼观察颜色反应，呈绿色为阳性表示待检样品中含有柱状黄杆菌；呈橙红 色为阴性表示不含有柱状黄杆菌。
[0015] 所述待检样品为鱼鳃、鱼体表溃烂处、鱼鳍溃烂处、鱼血液或柱状黄杆菌。
[0016] 一种柱状黄杆菌快速检测方法，包括如下步骤：
[0017] (1)提取待检样品DNA ;
[0018] (2)在装有19 ill LAMP反应基础液的200 ill PCR反应管中加入4 ill引物混合液， I ill Bst DNA聚合酶，I ill待检样品DNA模板，配成25 ill的LAMP反应体系；于60-65 °C 放置40-60min，再于85°C放置15min得到检测液；
[0019] 所述 19 ii I LAMP 反应基础液组成：1. 5 ii I dNTP，2. 5 ii I IOXThermopol Roaction Buffer 和 15 u I DEPC 水；
[0020] 所述引物混合液是等体积的浓度为5 mol/L由SEQ ID NO. 1所示的外引物上游 引物，浓度为5iimol/L由SEQ ID NO. 2所示的外引物下游引物，浓度为40iimol/L由SEQ ID NO. 3所示的内引物上游引物和浓度为40 iimol/L由SEQ ID NO. 4所示的内引物下游引 物组成；
[0021] (3)采用质量浓度1 %的琼脂糖电泳检测检测液是否产生连续的阶梯状的DNA条 带，是则为阳性，或在步骤（2)获得的检测液中加入I 荧光染料SYBR Green I工作液， 肉眼观察颜色反应，呈绿色为阳性表示待检样品中含有柱状黄杆菌；呈橙红色为阴性表示 不含有柱状黄杆菌。
[0022] 待检样品为鱼鳃、鱼体表溃烂处、鱼鳍溃烂处、鱼血液或柱状黄杆菌。
[0023] 本发明与现有技术相比，具有以下优点：
[0024] (1)本发明解决了现有技术检测柱状黄杆菌周期长、成本高、依赖于专业设备和技 术人员、不能应用于现场检测等问题，本发明在2h内即可完成所有检测操作，简单快速。
[0025] (2)本发明基于检测柱状黄杆菌16S rDNA基因序列，可用于养殖生产中柱状黄杆 菌的检测，准确性高，灵敏度较常规的PCR高1-2个数量级，实验室检测所能检测柱状黄杆 菌的最低浓度为3X102cfu/ml。
[0026] (3)检测成本低，无需PCR仪之类的专业仪器设备，只需一台控温精准的水浴锅或 恒温金属浴，操作简便，适合现场检测。
[0027] (4)不需经过细菌培养，检测所需样品量少，仅需取少量鱼类病变组织即可进行检 测，实现了微创取样，尤其适用于经济价值较高的观赏性鱼类。
[0028] (5)本发明还可以用于水体中柱状黄杆菌的检测。

【专利附图】

【附图说明】
[0029] 图1为一种柱状黄杆菌快速检测方法检测结果图，肉眼观察，1为阴性对照，检测 液为橙红色，2为柱状黄杆菌菌液的检测结果，检测液呈现明显的绿色，为阳性。
[0030] 图2为一种柱状黄杆菌快速检测方法检测结果图，电泳图，1为阴性对照，2为柱状 黄杆菌菌液的检测结果。
[0031] 图3为一种柱状黄杆菌快速检测方法灵敏性检测结果示意图。
[0032] 图4为一种柱状黄杆菌快速检测方法特异性检测结果示意图。

【具体实施方式】
[0033] 下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明，这里所述实施例的方案， 不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这 些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。
[0034] 本发明所用仪器及试剂：
[0035] 电热恒温水浴锅（购自北京三二八科学仪器有限公司），高速冷冻离心机（SIGMA 公司），Bst DNA 聚合酶、IOXThermopol Roaction Buffer、dNTP(购自 NEB 公司），引物 FlcoF3、FlcoB3、FlcoFIP、FIcoBIP均由上海生工生物工程有限公司合成；钙黄绿素（购自 SIGMA公司）；DEPC水购自上海生工生物工程有限公司，柱状黄杆菌为本站从患病剑尾鱼体 内分离得到，经形态学、生化特性分析及以16S rDNA为遗传标记的系统发育分析鉴定为柱 状黄杆菌。
[0036] 钙黄绿素工作液为5mmol/L钙黄绿素和60mmol/LMnCl2的配合物稀释4倍获得。
[0037] Bst DNA聚合酶，每微升含8个活性单位（8U/ ill)。
[0038] 实施例1.弓丨物设计合成
[0039] 采用blast软件分析柱状黄杆菌基因序列，筛选出柱状黄杆菌16S rDNA基因序列 (GenBank登录号：AB078047)的保守核苷酸序列，根据LAMP技术引物设计原则，针对该片段 设计出LAMP引物并合成，
[0040] F3 :5, -GAGTGGCTAAGCGAAAGTGA-3'（SEQ ID NO. 1，外引物上游引物）
[0041] B3 :5' -GCTGACGACAACCATGCA-3'（SEQ ID NO. 2,外引物下游引物）
[0042] FIP :5，-CCACATGCTCCTCCGCTTGTGttttGTATCCCACCTGGGGAGTA-3,（SEQ ID NO. 3,内 引物上游引物）
[0043] BIP :5' -ACGCGAGGAACCTTACCAAGGggatccGCACCTTGAAAAACGTCCGA-3'（SEQ ID NO. 4,内引物下游引物）
[0044] 实施例2
[0045] 一种柱状黄杆菌快速检测方法，是包括如下步骤：
[0046] (1)提取待检样品DNA ;
[0047] 采用DNA提取试剂盒（天根的快速DNA提取检测试剂盒KG203)提取纯培养的柱 状黄杆菌菌液基因组DNA ;
[0048] (2)在两只分别装有19 ill LAMP反应基础液的200 ill PCR反应管中各加入4 ill 引物混合液，Iul Bst DNA聚合酶，一只加入Iiil待检柱状黄杆菌样品DNA作为样品，另一 只加入I DEPC水作为阴性对照，均配成25 ill的LAMP反应体系；于63°C放置50min，再 于85°C放置15min得到检测液；
[0049] 19 U I LAMP 反应基础液组成：1. 5 U I dNTP，2. 5 U I IOXThermopol Roaction Buffer，I ill 钙黄绿素和 14 ill DEPC 水；
[0050] 4 ill弓丨物混合液由下述组份组成：1 ill浓度为5 ii mol/L由SEQ ID NO. I所示的 外引物上游引物，I U 1浓度为5 ii mol/L由SEQ ID NO. 2所示的外引物下游引物，I ill浓度 为40 ii mol/L由SEQ ID NO. 3所示的内引物上游引物和I ill浓度为40 ii mol/L由SEQ ID NO. 4所示的内引物下游引物；
[0051] 上述Bst DNA聚合酶，每微升含8个活性单位（8U/ ill)。
[0052] (3)肉眼观察颜色反应，样品呈绿色为阳性表示待检样品中含有柱状黄杆菌；阴 性对照呈橙红色为阴性表示不含有柱状黄杆菌。
[0053] 实施例3. -种柱状黄杆菌快速检测方法，包括如下步骤：
[0054] (1)取病鱼鳃组织0. lg，加入100 样品预处理液（TE缓冲液，以下各实施例均 为TE缓冲液），研磨至浆状；
[0055] (2)在装有19 ill LAMP反应基础液的200 ill PCR反应管中加入4 ill弓丨物混合 液，I Bst DNA聚合酶，I ill步骤⑴获得的上清液，配成25 ill的LAMP反应体系；于 60°C放置60min，再于85°C放置15min得到检测液；
[0056] 所述19 ill LAMP反应基础液组成同实施例2 ;
[0057] 所述引物混合液同实施例2 ;
[0058] (3)肉眼观察颜色反应，呈绿色为阳性表示待检样品病鱼鳃组织中含有柱状黄杆 菌。
[0059] 实施例4. 一种柱状黄杆菌快速检测方法，包括如下步骤：
[0060] (1)在无菌条件下抽取待检鱼血液100 ，加入100 Ul样品预处理液充分混匀；
[0061] (2)在装有19 ill LAMP反应基础液的200 ill PCR反应管中加入4 ill弓丨物混合 液，I Bst DNA聚合酶，I ill步骤⑴获得的上清液，配成25 ill的LAMP反应体系；于 65°C放置40min，再于85°C放置15min得到检测液；
[0062] 所述19 ill LAMP反应基础液组成同实施例2 ;
[0063] 所述引物混合液同实施例2 ;
[0064] (3)肉眼观察颜色反应，呈绿色为阳性表示待检样品鱼血液中含有柱状黄杆菌。
[0065] 实施例5. -种柱状黄杆菌快速检测方法，包括如下步骤：
[0066] (1)同实施例2的步骤（1);
[0067] (2)在两只分别装有19 ill LAMP反应基础液的200 ill PCR反应管中各加入4 ill 引物混合液，Iul Bst DNA聚合酶，一只加入Iiil待检柱状黄杆菌样品DNA作为样品，另一 只加入I DEPC水作为阴性对照，均配成25 ill的LAMP反应体系；于63°C放置50min，再 于85°C放置15min得到检测液；
[0068] 19 U I LAMP 反应基础液组成：1. 5 U I dNTP，2. 5 U I IOXThermopol Roaction Buffer 和 15 ii I DEPC 水；
[0069] 4 ill弓丨物混合液由下述组份组成：1 ill浓度为5 ii mol/L由SEQ ID NO. 1所示的 外引物上游引物，I U 1浓度为5 ii mol/L由SEQ ID NO. 2所示的外引物下游引物，I ill浓度 为40 ii mol/L由SEQ ID NO. 3所示的内引物上游引物和I ill浓度为40 ii mol/L由SEQ ID NO. 4所示的内引物下游引物；
[0070] 上述Bst DNA聚合酶，每微升含8个活性单位（8U/ ill)。
[0071] (3)采用质量浓度1%的琼脂糖电泳检测检测液，产生连续的阶梯状的DNA条带。 见图2。实施例6. -种柱状黄杆菌快速检测方法，包括如下步骤：
[0072] (1)取鱼体表溃烂处组织0. lg，加入100 样品预处理液，研磨至浆状；
[0073] (2)在装有19 ill LAMP反应基础液的200 ill PCR反应管中加入4 ill弓丨物混合 液，I Bst DNA聚合酶，I ill步骤⑴获得的上清液，配成25 ill的LAMP反应体系；于 60°C放置60min，再于85°C放置15min得到检测液；
[0074] 19 ill LAMP反应基础液和4 ill弓丨物混合液同实施例5 ;
[0075] (3)采用质量浓度1%的琼脂糖电泳检测检测液，产生连续的阶梯状的DNA条带。
[0076] 实施例7. -种柱状黄杆菌快速检测方法，包括如下步骤：
[0077] (1)在无菌条件下抽取待检鱼血液100 ，加入100 样品预处理液充分混匀；
[0078] (2)在装有19 ill LAMP反应基础液的200 ill PCR反应管中加入4 ill弓丨物混合 液，I Bst DNA聚合酶，I ill步骤⑴获得的上清液，配成25 ill的LAMP反应体系；于 65°C放置40min，再于85°C放置15min得到检测液；
[0079] 19 ill LAMP反应基础液和4 ill弓丨物混合液同实施例2 ;
[0080] (3)肉眼观察颜色反应，呈绿色为阳性表示待检样品鱼血液中含有柱状黄杆菌。
[0081] 实施例8. -种柱状黄杆菌快速检测方法，包括如下步骤：
[0082] (1)在装有19 ill LAMP反应基础液的200 ill PCR反应管中加入4 ill弓丨物混合 液，I ill Bst DNA聚合酶，I ill纯培养的柱状黄杆菌菌液，配成25 ill的LAMP反应体系；于 60°C放置60min，再于85°C放置15min得到检测液；
[0083] 所述19 ill LAMP反应基础液组成同实施例2 ;
[0084] 所述引物混合液同实施例2 ;
[0085] (2)肉眼观察颜色反应，呈绿色为阳性表示待检样品鱼血液中含有柱状黄杆菌。
[0086] 实施例9. 一种柱状黄杆菌快速检测方法，包括如下步骤：
[0087] (1)-(2)同实施例 5 的步骤（1)-(2);
[0088] (3)在步骤（2)获得的检测液中加入I ill荧光染料SYBR Green I工作液，肉眼观 察颜色反应呈绿色，表示待检样品中含有柱状黄杆菌。
[0089] 实施例10. -种柱状黄杆菌快速检测方法，包括如下步骤：
[0090] (1)取鱼鳍溃烂处0. lg，加入100 ill样品预处理液，研磨至浆状；
[0091] (2)同实施例6的步骤（2);
[0092] (3)在步骤（2)获得的检测液中加入I ill荧光染料SYBR Green I工作液，肉眼观 察颜色反应呈绿色，表示待检样品中含有柱状黄杆菌。
[0093] 实施例11. 一种柱状黄杆菌快速检测方法，包括如下步骤：
[0094] (1)-(2)同实施例 7 的步骤（1)-(2);
[0095] (3)在步骤（2)获得的检测液中加入I ill荧光染料SYBR Green I工作液，肉眼观 察颜色反应呈绿色，表示待检样品中含有柱状黄杆菌。
[0096] 实施例12. -种柱状黄杆菌快速检测方法的检测灵敏度测定
[0097] 取纯培养的柱状黄杆菌菌液，以无菌生理盐水洗涤3次，调整菌液浓度为 3 X 109Cfu/ml，10倍比梯度稀释，煮沸IOmin后取上清作为LAMP反应的模板。采用实施例8 步骤（1)中的25iil的LAMP反应体系，将反应液置于63°C放置50min，再于85°C放置15min 得到检测液；采用质量浓度I %的琼脂糖电泳检测检测液是否产生连续的阶梯状的DNA条 带，是则为阳性；阳性表示待检样品中含有柱状黄杆菌；阴性表示不含有柱状黄杆菌。结 果：可以检测到的最低柱状黄杆菌浓度为3X102cfu/ml，见图3。
[0098] 图3中M为分子量Marker DL 2000，样品1-9作为模板的细菌浓度分别为 3 X 109cfu/ml、3 X 108cfu/ml、3 X 107cfu/ml、3 X 106cfu/ml、3 X 105cfu/ml、3 X 104cfu/ml、 Sxio3CfuAiuxio2CfuAiuxiO1CfuAil tj 检测结果显不当菌液浓度为 3X102cfu/ml 时 开始有扩增条带，即该检测方法所能检测到的柱状黄杆菌最低浓度为3X 102cfu/ml。
[0099] 实施例13. -种柱状黄杆菌快速检测方法的检测特异性测试
[0100] 分别取纯培养并鉴定后的柱状黄杆菌、美人鱼发光杆菌、无乳链球菌、哈维氏弧 菌、嗜水气单胞菌、诺卡氏菌、爱德华氏菌、维氏气单胞菌、鳗弧菌，培养菌液作为LAMP反应 的模板，按照实施例8所述方法，用已建立的柱状黄杆菌快速检测方法检测以上样品。检测 结果：样品1柱状黄杆菌出现核酸扩增，检测液呈现绿色为阳性，其余样品均为阴性，见图 4。
[0101] 样品1-9细菌分别为柱状黄杆菌、美人鱼发光杆菌、无乳链球菌、哈维氏弧菌、嗜 水气单胞菌、诺卡氏菌、爱德华氏菌、维氏气单胞菌、鳗弧菌，10为阴性对照，结果显示仅样 品1柱状黄杆菌检测液呈绿色，为阳性，其它菌及阴性对照的检测液均呈橙红色，为阴性。
[0102] 本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行 修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
【权利要求】
1. 一种柱状黄杆菌快速检测引物，其特征是由外引物和内引物组成，所述外引物由SEQ ID NO. 1所示的外引物上游引物和SEQ ID NO. 2所示的外引物下游引物组成；所述内引物 由SEQ ID NO. 3所示的内引物上游引物和SEQ ID NO. 4所示的内引物下游引物组成。
2. -种柱状黄杆菌快速检测方法，其特征是包括如下步骤： (1) 提取待检样品DNA ; (2) 在装有19iU LAMP反应基础液的200iU PCR反应管中加入4iU引物混合液， 1 ill Bst DNA聚合酶，1 ill待检样品DNA模板，配成25 ill的LAMP反应体系；于60-65°C 放置40-60min，再于85°C放置15min得到检测液； 所述 19ii 1 LAMP 反应基础液组成：1. 1 dNTP，2. 1 lOXThermopol Roaction Buffer，1 ill 钙黄绿素和 14 ill DEPC 水； 所述引物混合液是等体积的浓度为5 ymol/L由SEQ ID NO. 1所示的外引物上游引物， 浓度为511111〇1/1由5￡0 10从).2所示的外引物下游引物，浓度为4011111〇1/1由5￡0 10勵.3 所示的内引物上游引物和浓度为40 ymol/L由SEQ ID NO. 4所示的内引物下游引物组成； (3) 肉眼观察颜色反应，呈绿色为阳性表示待检样品中含有柱状黄杆菌；呈橙红色为 阴性表示不含有柱状黄杆菌。
3. 根据权利要求2所述的一种柱状黄杆菌快速检测方法，其特征是所述待检样品为鱼 鳃、鱼体表溃烂处、鱼鳍溃烂处、鱼血液或柱状黄杆菌。
4. 一种柱状黄杆菌快速检测方法，其特征是包括如下步骤： (1) 提取待检样品DNA ; (2) 在装有19iU LAMP反应基础液的200iU PCR反应管中加入4iU引物混合液， 1 ill Bst DNA聚合酶，1 ill待检样品DNA模板，配成25 ill的LAMP反应体系；于60-65°C 放置40-60min，再于85°C放置15min得到检测液； 所述 19ii 1 LAMP 反应基础液组成：1. 1 dNTP，2. 1 lOXThermopol Roaction Buffer 和 15 ii 1 DEPC 水； 所述引物混合液是等体积的浓度为5 ymol/L由SEQ ID NO. 1所示的外引物上游引物， 浓度为511111〇1/1由5￡0 10从).2所示的外引物下游引物，浓度为4011111〇1/1由5￡0 10勵.3 所示的内引物上游引物和浓度为40 ymol/L由SEQ ID NO. 4所示的内引物下游引物组成； (3) 采用质量浓度1 %的琼脂糖电泳检测检测液是否产生连续的阶梯状的DNA条带，是 则为阳性，或在步骤（2)获得的检测液中加入1 yl荧光染料SYBR Green I工作液，肉眼观 察颜色反应，呈绿色为阳性表示待检样品中含有柱状黄杆菌；呈橙红色为阴性表示不含有 柱状黄杆菌。
5. 根据权利要求4所述的一种柱状黄杆菌快速检测方法，其特征是所述待检样品为鱼 鳃、鱼体表溃烂处、鱼鳍溃烂处、鱼血液或柱状黄杆菌。
【文档编号】C12Q1/04GK104450952SQ201510018146
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2015年1月14日 优先权日:2015年1月14日
【发明者】徐晓丽, 姚学良, 李贺密, 钟文慧, 杨超敬, 宋昀鹏 申请人:天津市水产技术推广站