转基因大豆mon89788及其衍生品种的lamp检测引物组、检测试剂盒和检测方法

转基因大豆mon89788及其衍生品种的lamp检测引物组、检测试剂盒和检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种转基因大豆MON89788及其衍生品种的LAMP检测引物组、检测试剂盒和检测方法。检测引物组包括四条特异性引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照；试剂盒还可以有显色剂或荧光指示剂；其检测方法是通过提取待检大豆品种的DNA、采用四条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在60～65℃对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增效率可达到109～1010个拷贝，其鉴定采用反应管内沉淀的浊度变化、加入显色剂观察反应管内颜色变化、利用实时荧光检测仪观察确定待检大豆品种是否含有或为转基因大豆MON89788及其衍生品种。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。
【专利说明】转基因大豆M0N89788及其衍生品种的LAMP检测引物组、检测试剂盒和检测方法

【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，涉及转基因植物品种的检测方法，具体涉及转基因大豆M0N89788及其衍生品种的LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法。

【背景技术】
[0002]自1996年以来，全球转基因作物的种植面积实现了非凡增长，特别是其中有12年的增长率达到两位数。2013年是转基因作物种商业化的第18年(1996 — 2013)，国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)发表《2013年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势》的报告，报告显示:过去18年内全球30多个国家数百万农民以空前的比例种植了转基因作物，这些农民独立作出了 100多万次种植和再种植转基因作物的决定，累计种植面积超过16亿公顷，这个面积大体相当于或者超过美国或中国150%的国土面积，再次种植率高达为100%。2013年，全球27个国家的1800万农民种植了共1.752亿公顷的转基因作物。
[0003]然而，与转基因作物产业化的蓬勃发展相对应的是各国民众对其安全性的担忧，主要包括对人和动物健康的风险，对生态环境与农业的风险，对非目标生物的风险。针对第一种风险，1993年，联合国经济发展与合作组织(OECO)提出了食品安全性评估的“实质等同性”原则。如果准基因作物生产的产品与传统产品具有实质等同性，则可以认为是安全的。最早提出对转基因食品进行标识管理的是欧盟，1998年，欧盟在世界上签署第一个法案，要求对转基因产品进行标签说明；1999年，要求出口到欧盟的非转基因产品不得含有1%的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最低限量降低到0.9%。日本，澳大利亚，新西兰对转基因成分的最低含量做了不同规定，阈值从I?5%不等。
[0004]我国自2001年起相继颁布了一系列法律法规，对大豆、玉米、棉花、油菜、番茄5类转基因作物的17种产品实施强制性定性标识。2013年12月，国家主席习近平就转基因技术发表《占领转基因技术制高点》的专题讲话，他明确指出，“我强调两点:一是确保安全，二是要自主创新。也就是说，在研究上要大胆，在推广上要慎重。转基因农作物产业化、商业化推广，要严格按照国家制定的技术规程规范进行，稳打稳扎，确保不出闪失，涉及安全的因素都要考虑到。要大胆创新研究，占领转基因技术制高点，不能把转基因农产品市场都让外国大公司占领了。”由此可见，国家对转基因产品安全性的重视程度。
[0005]卞MXGlycine ffiar)是一种其种子含有丰富的蛋白质的豆科植物,原产国为中国，至今已有5000年的种植史。1996年以来中国开始大量进口大豆，进口量相当于我国的大豆产量。我国进口的大豆主要来自美国、阿根廷和巴西。这三个国家均为转基因大豆种植大国。其中，从美国进口的转基因大豆就占进口总量的89%。抗草甘膦大豆M0N89788是美国孟山都公司研发的第2代转基因大豆品种，也称作RR2Y (Roundup RReady2 Yield?)。M0N89788大豆在美国、加拿大等国家获准商业化种植，并已于2008年获准进口我国用作加工原料。
[0006]不言而喻，建立有效的转基因作物的检测方法与体系，对转基因作物及其产品标识制度的实施和安全性评价具有十分重要的意义。目前，转基因作物的检测方法主要有以下2类:
1)基于蛋白质的检测，如酶联免疫吸附法(ELISA)试纸条检测、Western杂交等方法检测，这类方法要求高质量、高稳定性的抗体，否则会影响检测的准确性，因此只能作为辅助检测手段；
2)基于核酸的检测,如核酸分子杂交技术(Sourthernblot)和PCR检测技术,其中PCR检测方法是最主要、最准确的检测转基因作物的方法，但这类方法的反应体系和操作过程比较复杂，需要专业人员；所需PCR仪价格在5万元左右，扩增时间2?3小时，扩增结果的电泳时间需要I小时左右；电泳常用染料EB为强致癌物质，有较强毒性，且难以实行现场检测。
[0007]综上所述，在科学研究和生产实践中均需要一种快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠且适用于现场操作的转基因作物检测方法。
[0008]环介导等温基因扩增技术(Loop-MediatedIsothermal Amplificat1n,以下简称LAMP法)是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，其具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点，目前尚未有将恒温扩增目视检测技术、恒温实时荧光技术应用于快速检测转基因大豆M0N89788及其衍生品种的试剂盒


【发明内容】

[0009]本发明的一个目的在于提供一种转基因大豆M0N89788及其衍生品种的LAMP检测引物组。
[0010]本发明的另Iv目的在于提供一种转基因大? Μ0Ν89788及其衍生品种的LAMP检测试剂盒。
[0011]本发明的另一个目的在于提供一种基于上述检测引物组和检测试剂盒的转基因大豆M0N89788及其衍生品种的恒温基因扩增检测方法。
[0012]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
转基因大豆M0N89788及其衍生品种的LAMP检测引物组，包括外引物I和外引物2、内引物I和内引物2，其核苷酸序列分别如下所示:
外引物 I:TTCCTGCTCCACTCTTCC (SEQ ID No:1)；
外引物 2:GCTAATGGTTTGGAGACTCTG (SEQ ID No:2)；
内引物 1:AGAGCTTGATGGGGATCAGATTGTCGCTTCAATCGTGGTTATCA (SEQ ID No:3);
内引物 2:GTTATCAAGCTTCTGCAGGTCCTGTACCCTGACCTTGTTGAGG (SEQ ID No:4)。
[0013]转基因大豆M0N89788及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，包括以下成分:
(O引物液:含有权利要求1所述的引物组，浓度分别为48?52μ M外引物1、48?52 μ M夕卜弓丨物2，48?52 μ M内引物1、48?52 μ M内引物2 ;
(2)反应液:含有12mM dNTP> 10X Isothermal Amplificat1n 反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液，三者的体积比是7?9:4?6:2 ;
(3)DNA聚合酶:浓度为7?9υ/μ I ;
(4)对照:阳性对照为转基因大豆Μ0Ν89788的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。
[0014]作为本发明进一步的方案:所述引物液中含有50 μ M外引物1、50μΜ外引物2，50μΜ内引物1、50μΜ内引物2。
[0015]作为本发明进一步的方案:所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/y I。
[0016]作为本发明进一步的方案:所述反应液中，12mM dNTP: 10X IsothermalAmplificat1n反应缓冲液:150mM MgS04的体积比为8:5:2。
[0017]利用以上所述的转基因大豆M0N89788及其衍生品种的LAMP检测试剂盒检测转基因大豆M0N89788及其衍生品种的方法，包括如下步骤:
1)待检样品DNA的提取:采用CTAB法提取纯化样品DNA；
2)恒温检测反应:在PCR管中配制反应体系:引物液1.8 μ 1，反应液15.2 μ 1，DNA聚合酶 1μ I,待检DNA I ?6μ 1，用 DNase/RNase-Free Distilled Water 补齐到 25 μ I ;设置阳性对照反应时，用转基因大豆Μ0Ν89788的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ;将配制好的PCR管混匀后离心，并于60?65°C反应45?90min，并在80°C持续2min ；
3)结果判断:通过观察PCR管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果。
[0018]作为本发明进一步的方案:还含有显色剂，所述显色剂为荧光染料Calcein。
[0019]利用以上所述的转基因大豆M0N89788及其衍生品种的LAMP检测试剂盒检测转基因大豆M0N89788及其衍生品种的方法，包括如下步骤:
1)待检样品DNA的提取:采用CTAB法提取纯化样品DNA；
2)恒温检测反应:在200μ I PCR管中配制反应体系:引物液1.8 μ 1，反应液15.2μ1，DNA 聚合酶 I μ 1，待检 DNA I ?6 μ 1，用 DNase/RNase-Free Distilled Water 补齐到25 μ I ;设置阳性对照反应时，用转基因大豆Μ0Ν89788的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ;将配制好的PCR管混匀后离心，并于60?65°C反应45?90min，并在80°C持续2min ；
3)结果判断:在上述PCR管中加入I?2μI显色剂，混匀，根据显色结果来判断扩增结果。
[0020]作为本发明进一步的方案:还含有荧光指示剂，所述荧光指示剂为SYT0-9。
[0021 ] 利用以上所述的转基因大豆Μ0Ν89788及其衍生品种的LAMP检测试剂盒检测转基因大豆M0N89788及其衍生品种的方法，包括如下步骤:
1)待检样品DNA的提取:采用CTAB法提取纯化样品DNA；
2)恒温检测反应:在200μ I PCR管中配制反应体系:引物液1.8 μ 1，反应液15.2μ 1，DNA 聚合酶 I μ 1，SYT0-9 I μ 1，待检 DNA I ?6 μ 1，用 DNase/RNase-Free DistilledWater补齐到25 μ I ;设置阳性对照反应时，用转基因大豆Μ0Ν89788的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ;将配制好的PCR管混匀后离心，并于实时荧光检测仪(如qPCR仪等)在60?65°C反应45?90min，并在80°C持续2min ；
3)结果判断:根据是否出现“S”型扩增曲线判断扩增结果。
[0022]其中，CTAB法提取转基因大豆M0N89788 DNA的方法为:
(I)取转基因大豆M0N89788约10mg,放入研钵中，加入少量液氮迅速磨碎,液氮反复加入3?4次，磨碎成粉末为止； (2)加入1.5ml预热至65°C的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样，65°C保温30min，期间不停颠倒混匀；
(3)约12000rpm离心1min,转移上清至一新离心管,加入I倍体积的苯酹:氯仿:异戍醇(25:24:1),充分混合,约12000rpm离心15min,转移上清至一新离心管中；
(4)加入I倍体积的氯仿:异戊醇(24:1)，充分混合，约12000rpm离心15min，转移上清至一新离心管中；
(5)加入2倍体积的CTAB沉淀缓冲液，室温静置保育60min；12000rpm离心15min，弃上清；加入350 μ I氯化钠溶液溶解沉淀；12000rpm离心1min,转移上清至一新离心管；
(6)加入0.6倍体积异丙醇，倒置离心管轻柔混合，室温放置20min，12000rpm离心15min,弃上清,加入500 μ 170%乙醇溶液，并颠倒离心管数次，12000rpm离心1min,弃上清；
(7)干燥DNA 沉淀，加 100 μ I DNase/RNase-Free Distilled Water 溶解 DNA。
[0023]本发明基于环介导等温扩增技术(LAMP法)，根据靶基因设计的四条引物能特异性识别靶基因序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎一环DNA混合物。采用4条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在60?65°C对核酸进行扩增反应，反应需在恒温条件下进行，反应时间依据模板DNA质量变化,一般为90min或更少,在45?90min的短时间内扩增效率可以达到19?10 1Q个拷贝。加入模板DNA，在60?65°C反应45?90min后，在80°C保温2min，终止反应。在反应中，有核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中Mg离子结合，产生副产物焦磷酸镁的白色沉淀。
[0024]与现有技术相比，本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等有益效果:
(1)快速高效:整个扩增只用45?90min即可完成，扩增产量可达19?101(1个拷贝；
(2)操作简便:不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部实时荧光检测仪就能反应和检测，条件比较温和；
(3)高特异性:本发明根据转基因大豆M0N89788的外源基因与内源基因结合处设计了四条特异性引物，应用上述四条引物，扩增靶序列的6个区域，具有很强的品系特异性，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
(4)高灵敏度:最低检测极限可达到5个拷贝；
(5)鉴定简便:可通过观察加入Calcein颜色变化、是否存在焦磷酸镁沉淀或是否出现“S”型扩增曲线来判断扩增与否，无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。

【专利附图】

【附图说明】
[0025]图1是实施例1的显色检测结果图；
图2是实施例1的扩增检测结果图(1:阳性对照；2-5:待检样品；6:阴性对照)；
图3是实施例2的显色检测结果图(1:阳性对照；2-5:待检样品；6:阴性对照)；
图4是实施例2的扩增检测结果他(1:阳性对照；2-5:待检样品；6:阴性对照)；
图5是实施例3的扩增检测结果图(1:阳性对照；2-7依次为:3%、0.3%、0.08%、003%、0.008%、0.003%的样品DNA ；8:阴性对照)； 图6是实施例3的电泳检测结果图(1:阳性对照；2-7依次为:3%、0.3%、0.08%、003%、0.008%、0.003%的样品DNA ；8:阴性对照)；
图7是实施例4的扩增检测结果图(1-20依次为:转基因大豆MON89788、RoundupReady GTS 40-3-2、A2704-12、A5547-127、A5547-35、DP305423、DP56423、M0N87708、M0N87751、M0N87769，转基因玉米M0N810，转基因水稻BT63，转基因土豆EH92-527-1，转基因棉花M0N531，转基因油菜T45，非转基因大豆、非转基因水稻、非转基因小麦、非转基因玉米、非转基因棉花)。

【具体实施方式】
[0026]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0027]如无特殊说明，以下实施例中的“％”均指质量百分比。
[0028]实施例1含显色剂的试剂盒及检测方法:
转基因大豆M0N89788及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，包括引物液、反应液、DNA聚合酶、对照和显色剂:
(1)引物液:含有50μ M外引物1、50μΜ外引物2，50 μ M内引物1、50μΜ内引物2，四条引物为:
外引物 I:TTCCTGCTCCACTCTTCC (SEQ ID No:1);
外引物 2:GCTAATGGTTTGGAGACTCTG (SEQ ID No:2)；
内引物 1:AGAGCTTGATGGGGATCAGATTGTCGCTTCAATCGTGGTTATCA (SEQ ID No:3);
内引物 2:GTTATCAAGCTTCTGCAGGTCCTGTACCCTGACCTTGTTGAGG (SEQ ID No:4)；
(2)反应液:含有12mM dNTP、10X Isothermal Amplificat1n 反应缓冲液、150mMMgS04水溶液，三者的体积比是8:5:2 ;
(3)DNA聚合酶-.Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μ I ;
(4)对照:含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；
(5)显色剂:荧光染料Calcein。
[0029]用上述试剂盒按以下方法对待测大豆品种种子进行检测:
1)待检样品DNA的提取:采用CTAB法提取纯化待测样品DNA；
2)恒温检测反应:在200μ I PCR管配制反应体系:引物液1.8 μ 1，反应液15.2μ1，DNA 聚合酶 I μ 1，待检 DNA I ?6 μ 1，用 DNase/RNase-Free Distilled Water 补齐到25μ I ;设置阳性对照反应时，用含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ;将配制好的PCR管混匀后离心，并于60?65°C反应45?90min，并在80°C持续2min ；
3)结果判断:在上述反应管中加入2μI显色剂，混匀，若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。
[0030]请参阅图1，本实施例中，阴性对照显现橙色，阳性对照显现绿色，待测样品1、2的PCR管显绿色，表明待测大豆种子样品1、2中含有或全部为转基因大豆Μ0Ν89788及其衍生品种，含有转基因大豆M0N89788成分，待测样品3、4的PCR管显橙色，表明待测样品3、4中不含转基因大豆M0N89788成分。
[0031 ] 转基因大豆M0N89788及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，包括引物液、反应液、DNA聚合酶、对照和荧光指示剂:
(1)引物液:含有50μ M外引物1、50μΜ外引物2，50 μ M内引物1、50μΜ内引物2，四条引物为:
外引物 I:TTCCTGCTCCACTCTTCC (SEQ ID No:1);
外引物 2:GCTAATGGTTTGGAGACTCTG (SEQ ID No:2)；
内引物 1:AGAGCTTGATGGGGATCAGATTGTCGCTTCAATCGTGGTTATCA (SEQ ID No:3);
内引物 2:GTTATCAAGCTTCTGCAGGTCCTGTACCCTGACCTTGTTGAGG (SEQ ID No:4)；
(2)反应液:含有12mM dNTP、10X Isothermal Amplificat1n 反应缓冲液、150mMMgS04水溶液，三者的体积比是8:5:2 ;
(3)DNA聚合酶-.Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μ I ;
(4)对照:含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；
(5)荧光指示剂:SYT0-9。
[0032]用上述试剂盒按以下方法对待测大豆品种种子进行检测:
1)待检样品DNA的提取:采用CTAB法提取纯化待测样品DNA；
2)恒温检测反应:在200μ I PCR管配制反应体系:引物液1.8 μ 1，反应液15.2μ1，DNA 聚合酶 I μ l，SYT0-9 Ιμ?，待检 DNA I ?6 μ 1，用 DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25 μ I ;设置阳性对照反应时，用转基因大豆Μ0Ν89788的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA;将配制好的PCR管混匀后离心，并于LineGene 9640 qPCR仪上60?65°C反应45?90min,并在 80°C持续 2min ；
3)结果判断:根据是否出现“S”型扩增曲线判断扩增结果，若显现“S”型扩增曲线则为阳性，若没显现“ S ”型扩增曲线则为阴性。
[0033]请参阅图2，本实施例中，阴性对照显现“直线”扩增曲线，阳性对照显现“S”型扩增曲线，待测样品1、2的显现“S”型扩增曲线(详见图2中的曲线2、曲线3)，表明待测大豆种子样品1、2中含有或全部为转基因大豆M0N89788及其衍生品种，含有转基因大豆M0N89788成分，待测样品3、4显现“直线”扩增曲线(详见图2中的曲线4、曲线5)，表明待测样品3、4中不含转基因大豆M0N89788成分。
[0034]参照EU Reference Laboratory for GM Food and Feed 中的引物 MON89788 F:TCCCGCTCTAGCGCTTCAAT (SEQ ID No:5),M0N89788 R: TCGAGCAGGACCTGCAGAA (SEQ ID No:6)和探针 M0N89788 Probe: FAM-CTGAAGGCGGGAAACGACAATCTG-TAMRA (SEQ ID No:7)进行荧光定量PCR检验，检验结果与上述LAMP方法结果相一致。
[0035]实施例2不含显色剂的试剂盒及其检测方法:
试剂盒中除缺少实施例1中的显色剂和荧光指示剂外，其余同实施例1。
[0036]用上述试剂盒按以下方法对待测大豆品种进行检测:
1)待检样品DNA的提取:采用CTAB法提取纯化待测样品DNA；
2)恒温检测反应:在200ulPCR管配制反应体系:引物液1.8 μ 1，反应液15.2 μ I,DNA聚合酶 I μ 1，待检 DNA I ?6μ 1，用 DNase/RNase-Free Distilled Water 补齐到 25 μ I ;设置阳性对照反应时，用转基因大豆Μ0Ν89788的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ;将配制好的PCR管混匀后离心，并于60?65°C反应45?90min，并在80°C持续2min ；
3)结果判断:将反应管放置在浊度仪中按2)中步骤反应，观察反应管内沉淀的浊度变化或是否出现“S”型扩增曲线判断扩增结果:如果出现沉淀则为阳性，无沉淀则为阴性；若显现“S”型扩增曲线则为阳性，若没显现“S”型扩增曲线则为阴性。
[0037]请参阅图3-图4，本实施例中，阴性对照无沉淀，阳性对照产生沉淀，待测样品1、2的PCR管出现沉淀(详见图3中的管2、管3 )、显现“ S”型扩增曲线(详见图4中的曲线2、曲线3)，表明待检大豆种子样品1、2中含有或全部为转基因大豆M0N89788及其衍生品种，含有转基因大豆M0N89788成分。待测样品3、4的PCR管没有出现沉淀(详见图3中的管4、管
5)、没有显现“S”型扩增曲线(详见图4中的曲线4、曲线5)，表明待检样品3、4中不含转基因大豆M0N89788成分。
[0038]参照EU Reference Laboratory for GM Food and Feed 中的引物 MON89788 F:TCCCGCTCTAGCGCTTCAAT (SEQ ID No:5),M0N89788 R: TCGAGCAGGACCTGCAGAA (SEQ ID No:
6)和探针M0N89788 Probe: FAM-CTGAAGGCGGGAAACGACAATCTG-TAMRA (SEQ ID No:7)进行荧光定量PCR检验，检验结果与上述LAMP方法结果相一致。
[0039]实施例3 PCR反应与本发明检测方法灵敏度的比较:
按下列配方制备转基因大豆M0N89788及其衍生品种的LAMP检测试剂盒:
(1)引物液:含有50μ M外引物1、50μΜ外引物2，50 μ M内引物1、50μΜ内引物2，四条引物为:
外引物 I:TTCCTGCTCCACTCTTCC (SEQ ID No:1);
外引物 2:GCTAATGGTTTGGAGACTCTG (SEQ ID No:2)；
内引物 1:AGAGCTTGATGGGGATCAGATTGTCGCTTCAATCGTGGTTATCA (SEQ ID No:3);
内引物 2:GTTATCAAGCTTCTGCAGGTCCTGTACCCTGACCTTGTTGAGG (SEQ ID No:4)；
(2)反应液:含有12mM dNTP、10X Isothermal Amplificat1n 反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液，三者的体积比是8:5:2 ;
(3)DNA聚合酶-.Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μ I ;
(4)对照:阳性对照为含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；
(5)显色剂:荧光染料Calcein。
[0040]用上述试剂盒按以下方法对确定为转基因大豆M0N89788的待测样品进行检测: O待检样品DNA的提取:采用CTAB法提取纯化待测样品DNA，分别稀释成5%、0.5%、
0.1%、0.05%、0.01%、0.005% 的样品 DNA ；
2)恒温检测反应:在200 μ I PCR管配制反应体系:引物液1.8 μ 1，反应液15.2μ1，DNA 聚合酶 I μ 1，待检 DNA I ?6 μ 1，用 DNase/RNase-Free Distilled Water 补齐到25μ I ;设置阳性对照反应时，用含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ;将配制好的PCR管混匀后离心，并于63°C反应90 min，并在80°C持续2min ； 3)结果判断:将反应管放置在浊度仪中按2)中步骤反应，观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，如果出现沉淀则有扩增，无沉淀则无扩增。也可以在2)中得到产物中加入I μ I显色剂，混匀，肉眼观察。无扩增反应的管子呈现橙色，有扩增反应的管子变成绿色。
[0041]按下列配方制备转基因大豆Μ0Ν89788及其衍生品种的LAMP检测试剂盒:
(1)引物液:含有50μ M外引物1、50μΜ外引物2，50 μ M内引物1、50μΜ内引物2，四条引物为:
外引物 I:TTCCTGCTCCACTCTTCC (SEQ ID No:1)；
外引物 2:GCTAATGGTTTGGAGACTCTG (SEQ ID No:2)；
内引物 1:AGAGCTTGATGGGGATCAGATTGTCGCTTCAATCGTGGTTATCA (SEQ ID No:3);
内引物 2:GTTATCAAGCTTCTGCAGGTCCTGTACCCTGACCTTGTTGAGG (SEQ ID No:4)；
(2)反应液:含有12mM dNTP、10X Isothermal Amplificat1n 反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液，三者的体积比是8:5:2 ;
(3)DNA聚合酶-.Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μ I ;
(4)对照:阳性对照为含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；
(5)荧光指示剂:SYT0-9。
[0042]用上述试剂盒按以下方法对确定为转基因大豆M0N89788的待测样品进行检测: O待检样品DNA的提取:采用CTAB法提取纯化待测样品DNA，分别稀释成3%、0.3%、
0.8%、0.03%、0.08%、0.003 的样品 DNA ；
2)恒温检测反应:在200μ I PCR管配制反应体系:引物液1.8 μ 1，反应液15.2μ1，DNA 聚合酶 I μ l，SYT0-9 Ιμ?，待检 DNA I ?6 μ 1，用 DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25 μ I ;设置阳性对照反应时，用浓度为3%的含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ;将配制好的PCR管混匀后离心，并于LineGene 9640 qPCR仪上63°C反应90min (I min设定为I个循环)，并在80°C持续2min ；
3)结果判断:根据是否出现“S”型扩增曲线判断扩增结果，若显现“S”型扩增曲线则为阳性，若没显现“ S ”型扩增曲线则为阴性。
[0043]请参阅图5，本实施例中，阳性对照、3%、0.3%、0.8%、0.03%,0.08%,0.003%均出现沉淀、“S”型扩增曲线显示为有扩增(详见图5中的曲线1-曲线7)，阴性对照无沉淀、无“S”型扩增曲线(详见图5中的曲线8)，即无扩增；加入显色剂后，阳性对照、3%、0.3%、0.8%、0.03%、0.08%、0.003%的PCR管显绿色，阴性对照管呈现橙色。
[0044]PCR反应引物采用本方法反应中的外引物I和外引物2。PCR反应为25μ1体系，10XPCR Buffer (PCR 反应缓冲液，Life technologies) 2.5 μ I, 1mM dNTPs (Lifetechnologies) 0.5 μ 1，上、下游引物分别对应外引物I和外引物2，各0.2 μ 1，Taq酶(5U/μ I , Life technologies)。.5 μ 1,DNA 模板 I μ I,用 DNase/RNase-Free Distilled Water补至25 μ I。反应程序为95°C预变性5min，95°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，72°C延伸5min。PCR产物取5μ I与2%琼脂糖凝胶电泳，110V电压下40min,通过凝胶成像分析仪观察结果如图6所示，对应条带分别为:M，DL600 DNA Marker (DNA分子量标准，最大DNA片段为 600 碱基对)；1，阳性对照；2,3% ;3，0.3% ;4，0.08% ;5，0.03% ;6，0.008% ;7，0.003% ；8，阴性对照。其中PCR方法的灵敏度为0.03%,而6，7显示为阴性结果。
[0045]由两种方法比较可以看出，本发明的试剂盒的灵敏度的结果可以达到0.003%的浓度，PCR方法的灵敏度为0.03%，而0.008%或以下显示为阴性结果；经比对，本发明的试剂盒及方法灵敏度明显高于PCR方法的敏感度，能检测出更低含量的样品。
[0046]实施例4特异性实验
用实施例1的鉴定方法分别对分离纯化的转基因大豆M0N89788、RoundupReady GTS 40-3-2、A2704-12、A5547-127、A5547-35、DP305423、DP56423、M0N87708、M0N87751、M0N87769,转基因玉米M0N810，转基因水稻BT63，转基因土豆EH92-527-1，转基因棉花M0N531，转基因油菜T45，非转基因大豆、水稻、小麦、玉米、棉花进行鉴定，同时参照 EU Reference Laboratory for GM Food and Feed 中的引物 M0N89788 F:TCCCGCTCTAGCGCTTCAAT (SEQ ID No:5),M0N89788 R: TCGAGCAGGACCTGCAGAA (SEQ ID No:6)和探针 M0N89788 Probe: FAM-CTGAAGGCGGGAAACGACAATCTG-TAMRA (SEQ ID No:7)进行荧光定量PCR检验。
[0047]请参阅图7，鉴定结果显示:转基因大豆Roundup Ready GTS 40-3-2、A2704-12、A5547-127、A5547-35、DP305423、DP56423、M0N87708、M0N87751、M0N87769,转基因玉米M0N810,转基因水稻BT63，转基因土豆EH92-527-1，转基因棉花M0N531，转基因油菜T45，非转基因大豆、水稻、小麦、玉米、棉花)反应管均为橙色、无“S”型扩增曲线(详见图7中的曲线2-曲线19)，即无扩增；转基因大豆M0N89788的反应管为绿色、显现“S”型扩增曲线(详见图7中的曲线I)，即有扩增。本结果与EU Reference Laboratory for GM Food andFeed中的荧光定量PCR反应结果相一致，显示出良好的特异性。
[0048]本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等有益效果:
(1)快速高效:整个扩增只用45?90min即可完成，扩增产量可达19?101(1个拷贝；
(2)操作简便:不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部实时荧光检测仪就能反应和检测，条件比较温和；
(3)高特异性:本发明根据转基因大豆M0N89788的外源基因与内源基因结合处设计了四条特异性引物，应用上述四条引物，扩增靶序列的6个区域，具有很强的品系特异性，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
(4)高灵敏度:最低检测极限可达到5个拷贝；
(5)鉴定简便:可通过观察加入Calcein颜色变化、是否存在焦磷酸镁沉淀或是否出现“S”型扩增曲线来判断扩增与否，无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。
[0049]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0050]此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
【权利要求】
1.转基因大豆M0N89788及其衍生品种的LAMP检测引物组，其特征在于，包括外引物I和外引物2、内引物I和内引物2，其核苷酸序列分别如下所示:
外引物 I:TTCCTGCTCCACTCTTCC (SEQ ID No:1)；
外引物 2:GCTAATGGTTTGGAGACTCTG (SEQ ID No:2)；
内引物 1:AGAGCTTGATGGGGATCAGATTGTCGCTTCAATCGTGGTTATCA (SEQ ID No:3);
内引物 2:GTTATCAAGCTTCTGCAGGTCCTGTACCCTGACCTTGTTGAGG (SEQ ID No:4)。
2.转基因大豆M0N89788及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分: (O引物液:含有权利要求1所述的引物组，浓度分别为48?52μ M外引物1、48?52 μ M夕卜弓丨物2，48?52 μ M内引物1、48?52 μ M内引物2 ; (2)反应液:含有12mM dNTP> 10X Isothermal Amplificat1n 反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液，三者的体积比是7?9:4?6:2 ; (3)DNA聚合酶:浓度为7?9υ/μ I ; (4)对照:阳性对照为转基因大豆Μ0Ν89788的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。
3.根据权利要求2所述的转基因大豆Μ0Ν89788及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述引物液中含有50μΜ外引物1、50μΜ外引物2，50μΜ内引物1、50μΜ内引物2。
4.根据权利要求2所述的转基因大豆Μ0Ν89788及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/ μ I。
5.根据权利要求2所述的转基因大豆Μ0Ν89788及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述反应液中，12mM dNTP: 10X Isothermal Amplificat1n反应缓冲液:150mMMgS04的体积比为8:5:2。
6.利用权利要求2?5任一所述的转基因大豆M0N89788及其衍生品种的LAMP检测试剂盒检测转基因大豆M0N89788及其衍生品种的方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)待检样品DNA的提取:采用CTAB法提取纯化样品DNA； 2)恒温检测反应:在PCR管中配制反应体系:引物液1.8 μ 1，反应液15.2 μ 1，DNA聚合酶 1μ I,待检DNA I ?6μ 1，用 DNase/RNase-Free Distilled Water 补齐到 25 μ I ;设置阳性对照反应时，用转基因大豆Μ0Ν89788的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ;将配制好的PCR管混匀后离心，并于60?65°C反应45?90min，并在80°C持续2min ； 3)结果判断:通过观察PCR管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果。
7.根据权利要求2?5任一所述的转基因大豆M0N89788及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于，还含有显色剂，所述显色剂为荧光染料Calcein。
8.利用权利要求7所述的转基因大豆M0N89788及其衍生品种的LAMP检测试剂盒检测转基因大豆M0N89788及其衍生品种的方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)待检样品DNA的提取:采用CTAB法提取纯化样品DNA； 2)恒温检测反应:在200μ I PCR管中配制反应体系:引物液1.8 μ 1，反应液15.2μ1，DNA 聚合酶 I μ 1，待检 DNA I ?6 μ 1，用 DNase/RNase-Free Distilled Water 补齐到25 μ I ;设置阳性对照反应时，用转基因大豆Μ0Ν89788的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ;将配制好的PCR管混匀后离心，并于60?65°C反应45?90min，并在80°C持续2min ； 3)结果判断:在上述PCR管中加入I?2μ I显色剂，混匀，根据显色结果来判断扩增结果。
9.根据权利要求2?5任一所述的转基因大豆ΜΟΝ89788及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于:还含有荧光指示剂，所述荧光指示剂为SYTO-9。
10.利用权利要求9所述的转基因大豆MON89788及其衍生品种的LAMP检测试剂盒检测转基因大豆MON89788及其衍生品种的方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)待检样品DNA的提取:采用CTAB法提取纯化样品DNA； 2)恒温检测反应:在200μ I PCR管中配制反应体系:引物液1.8 μ 1，反应液15.2μ 1，DNA 聚合酶 I μ 1，SYTO-9 I μ 1，待检 DNA I ?6 μ 1，用 DNase/RNase-Free DistilledWater补齐到25 μ I ;设置阳性对照反应时，用转基因大豆ΜΟΝ89788的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ;将配制好的PCR管混匀后离心，并于实时荧光检测仪在60?65°C反应45?90min,并在 80°C持续 2min ； 3)结果判断:根据是否出现“S”型扩增曲线判断扩增结果。
【文档编号】C12N15/11GK104513861SQ201510018179
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2015年1月14日 优先权日:2015年1月14日
【发明者】李海鹏, 方雪恩, 王丽娟, 曹宏梅, 陈旭, 徐凌佳, 孔继烈 申请人:上海速芯生物科技有限公司, 复旦大学