一种可降解草酸的富硒乳酸菌制剂及其制备方法与应用与流程

本发明属于饲料添加剂生产领域，涉及一种可降解草酸的富硒乳酸菌制剂的制备方法和应用，所述的富硒乳酸菌制剂专用于动物保健品的生产，可用作犬粮添加剂，能发挥有机硒抗氧化和乳酸菌降解草酸的双重作用，预防犬草酸钙尿石症的发生。

背景技术：

尿结石是动物和人体内一种常见病，动物尿路结石中大约有70％～80％是草酸钙结石。由于草酸钙的低溶解性，目前治疗草酸钙结石的方法仍主要是以手术移除为主，这给患者带来了极大的痛苦，对于动物养殖而言，增加了饲养成本。草酸钙结石形成需要三个条件：第一，高浓度的草酸尿；第二，存在形成结石的晶核；第三，高钙尿症。钙离子浓度增高，会提高草酸钙的饱和度，钙离子也会与尿路结石抑制剂结合。在人临床上，大约三分之一的草酸钙结石患者有高钙尿和体内钙代谢紊乱的症状。有研究报道称在草酸钙结石的形成过程中，草酸吸收和代谢异常所起的作用较钙大，它的轻微变化就能导致草酸钙结晶的产生。体内的草酸来自内源性的代谢和外源性的吸收，其中体内的氨基酸、vc等经过一系列的代谢，终产物为草酸；外源性的草酸则主要源自于肠道从食物中吸收的草酸。由于脊椎动物不能利用草酸作为碳源，体内的草酸则通过肾脏经尿液排出体外。动物体的草酸大部分源自食物，理论上通过控制从饮食中摄入的草酸量，可以防止高草酸尿的形成。但是大多数食物中均含有草酸，所以这种方法无法实现。对正常人和动物来说，内源性草酸的代谢量一定，因此，减少肠道对草酸的吸收，是预防草酸钙肾石病的发生较为可行的办法。另外，结晶的析出聚集需要结核存在，损伤的细胞为晶体的聚集提供了这一条件，因而是结石形成的另一重要条件。草酸钙结石形成的晶核，多来自于肾上皮细胞的损伤。机体代谢的过程中，会产生可引起脂质过氧化反应的活性氧，其会导致肾上皮细胞的氧化损伤。损伤的细胞会促进草酸钙晶体的聚集、粘附、增大，形成结石。因此，减少肾上皮细胞的氧化损伤也是防止草酸钙结石产生的另一重要途径。

硒是人和动物所必需的微量元素，是一种多功能的生命营养元素。研究表明，硒具有抗氧化，提高机体免疫力，抗病能力，调节机体代谢，提高繁育机能，抗肿瘤，防治地方病，延缓衰老，拮抗有毒元素等多种功能。硒是机体清除脂质过氧化物和自由基的谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase，gsh-px)的必要组成部分，硒发挥抗氧化作用就是通过gsh-px的抗氧化能力来实现的。硒的抗氧化作用可以防止自由基对肾上皮细胞的损伤作用，防止尿结石的晶核形成。常用的硒制剂有无机硒和有机硒两种，但相比而言有机硒有利用率高，无毒副作用等优点。有机硒的合成有两种方法：人工合成和生物转化。但人工合成有机硒价格过高，无法大规模用于动物生产。硒的生物转化法主要通过植物和微生物转化无机硒成有机硒。目前，用酵母制备有机硒已进入工业化生产阶段。

乳酸菌(lacticacidbacteria，lab)是一群能从可发酵碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性球菌和杆菌的总称。乳酸菌作为一种益生菌具有多项生理作用，包括营养作用、降胆固醇作用、增强免疫功能等。同时，也有一些乳酸菌具有分解肠道草酸的作用，曾有报道从草酸钙结石发病率较低的犬中分离到能够降解草酸的乳酸菌。乳酸菌与其它可分解草酸的细菌不同，其不仅有着较好的草酸降解力，而且还属于益生菌。

技术实现要素：

技术问题：本发明的目的是提供一种简便、低成本生产可降解草酸的富硒乳酸菌制剂的生产方法和产品，该产品能同时发挥有机硒抗氧化作用和乳酸菌分解草酸的双重功效，能有效地预防草酸钙结石的发生。生产方法：在培养基中添加无机硒源，用能分解草酸的乳酸菌作为菌种，在适宜的条件下培养，待乳酸菌将无机硒转变为有机硒，得到富含有机硒且能降解草酸乳酸菌制剂。

技术方案：一种可降解草酸的富硒乳酸菌制剂，它是以乳酸乳球菌乳酸亚种和屎肠球菌种为菌种，经菌种活化、制备种子液、再经发酵培养获得的乳酸乳球菌乳酸亚种和屎肠球菌的总浓度为1×10¹⁰～10¹¹cfu/ml，有机硒以硒的含量计为3.0～4.0μg/ml的制剂。

本发明所述的可降解草酸的富硒乳酸菌制剂的制备方法，包括菌种活化、种子液的获得、可降解草酸的富硒乳酸菌制剂的获得，具体包括以下步骤：

(1)菌种活化：取保存在-20℃的乳酸乳球菌乳酸亚种和屎肠球菌种解冻后，各接种于斜面培养基上温度30～40℃培养；

(2)种子液的获得：将乳酸乳球菌乳酸亚种和屎肠球菌各接种入种子培养基中，温度35～40℃，培养30～40h，分别获得乳酸乳球菌乳酸亚种种子液和屎肠球菌种子液；

(3)可降解草酸的富硒乳酸菌制剂的获得：将亚硒酸钠加入发酵培养基中，使培养基中的se⁴⁺浓度为3～6μg/ml，分别将乳酸乳球菌乳酸亚种种子液和屎肠球菌种子液接种于发酵培养基中，温度30～40℃，培养30～40h，扩大培养得到可降解草酸的富硒乳酸菌制剂。

所述的乳酸乳球菌乳酸亚种为乳酸乳球菌乳酸亚种njodl1，分类命名为：lactococcuslactissubsp.lactis，于2011年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为cgmccno.4582。参见申请人于2011年6月22日申请的发明专利申请(公开号cn102250800a)。

所述的屎肠球菌为屎肠球菌njode1，分类命名为：enterococcusfaecium，于2011年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为cgmccno.4581。参见申请人于2011年6月22日申请的发明专利申请(公开号cn102250799a)。

步骤(1)中，菌种活化的具体方法为：将保存在-20℃的乳酸乳球菌乳酸亚种和屎肠球菌种解冻后，各接种于斜面培养基上，温度30～40℃下培养36小时，连续传代3～5次。

所述的斜面培养基为mrs固体培养基，配制方法为，以配置1000ml斜面培养基为例：蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，柠檬酸三铵2g，乙酸钠5g，吐温80.1ml，mgso4·7h2o0.58g，k2hpo42g，mnso4·4h2o0.05g，琼脂20g，水1000ml，调节ph＝6.2～6.4；121℃，高压蒸汽灭菌15min.。用于乳酸菌的复苏和保存。

步骤(2)中，所述的种子培养基为mrs液体培养基，配制方法为，以配置1000ml斜面培养基为例：蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，柠檬酸三铵2g，乙酸钠5g，吐温80.1ml，mgso4·7h2o0.58g，k2hpo42g，mnso4·4h2o0.05g，水1000ml，调节ph＝6.2～6.4；121℃，高压蒸汽灭菌15min.。

步骤(3)中，乳酸乳球菌乳酸亚种种子液和屎肠球菌种子液以5％的体积接种量接种于发酵培养基中。所述的发酵培养基为mrs液体培养基。

所述的可降解草酸的富硒乳酸菌制剂中富硒乳酸乳球菌乳酸亚种和屎肠球菌的总浓度为1×10¹⁰～10¹¹cfu/ml，有机硒以硒的含量计为3.0～4.0μg/ml，硒转化率为60％以上。该产品的益生菌数符合《益生菌类保健食品评审规定》中的标准。

所述的无机硒为亚硒酸钠；所述的有机硒为硒蛋氨酸。

本发明制得的可降解草酸的富硒乳酸菌制剂在制备保健品中的应用，优选在制备预防犬草酸钙尿石症的保健品中的应用。

本发明制得的可降解草酸的富硒乳酸菌制剂在制备犬粮添加剂中的应用，优选在制备预防犬草酸钙尿石症的犬粮添加剂中的应用。

有益效果：

(1)本发明选用特定的具有草酸分解能力的乳酸乳球菌亚种和屎肠球菌，采用生物转化法，通过乳酸菌将无机硒转化为有机硒，转化率为60％以上，得到富含有机硒的可降解草酸的富硒乳酸菌制剂，发挥有机硒和乳酸菌的双重生物学功效，既能发挥抗氧化的功能，又可降解草酸，共同预防草酸钙尿结石的形成。

(2)本发明所得可降解草酸的富硒乳酸菌制剂预防犬草酸钙尿石症效果显著。试验表明：富硒乳酸菌制剂能显著防止尿液草酸的升高、尿液ph的降低和血钙的降低；在提高机体抗氧化能力上，富硒乳酸菌可显著提高机体血和肾组织抗氧化酶如超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)和过氧化氢酶(cat)的活性，能有效防止血和肾组织丙二醛(mda)的升高。本发明可降解草酸的富硒乳酸菌制剂作为一种安全的保健品，可用作犬粮添加剂，在预防草酸钙尿结石的过程中必将发挥极其重要的作用，预防犬草酸钙尿石症的发生。

附图说明

图1为实施例1中空白对照组肾脏he切片图(he,×400)；

图2为实施例1中0.5％草酸组肾脏he切片图(he,×400)；

图3为实施例1中0.5％草酸组+有机硒组肾脏he切片图(he,×400)；

图4为实施例1中0.5％草酸组+乳酸菌组肾脏he切片图(he,×400)；

图5为实施例1中0.5％草酸组+富硒乳酸菌制剂组肾脏he切片图(he,×400)。

生物材料保藏信息

njodl1，分类命名为：lactococcuslactissubsp.lactis，于2011年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为cgmccno.4582。

njode1，分类命名为：enterococcusfaecium，于2011年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为cgmccno.4581。

具体实施方式

实施例1：可降解草酸的富硒乳酸菌制剂对食源性草酸过多犬尿石症的预防作用试验

1、可降解草酸的富硒乳酸菌制剂，其生产方法如下：

1)乳酸菌种：

乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)，由南京农业大学内科教研组提供，为农业部允许使用的益生菌菌种。于2011年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为cgmccno.4582。

屎肠球菌(enterococcusfaecium)，由南京农业大学内科教研组提供，为农业部允许使用的益生菌菌种。于2011年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为cgmccno.4581。

2)无机硒源：亚硒酸钠，配制se⁴⁺浓度为1mg/ml的亚硒酸钠溶液500ml，121℃，高压蒸汽灭菌15min，备用。

3)培养基

斜面培养基(mrs固体培养基)：蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，柠檬酸三铵2g，乙酸钠5g，吐温80.1ml，mgso4·7h2o0.58g，k2hpo42g，mnso4·4h2o0.05g，琼脂20g，水1000ml，调节ph＝6.2～6.4；121℃，高压蒸汽灭菌15min。用于乳酸菌的复苏和保存。

种子培养基(mrs液体培养基)：蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，柠檬酸三铵2g，乙酸钠5g，吐温80.1ml，mgso4·7h2o0.58g，k2hpo42g，mnso4·4h2o0.05g，水1000ml，调节ph＝6.2～6.4；121℃，高压蒸汽灭菌15min。

发酵培养基：同种子培养基。

4)菌种活化：将保存在-20℃的乳酸菌种解冻后，分别接种于mrs斜面培养基上，37℃，培养36h，在此条件下连续传代3～5次(即每次传代培养的温度是37℃，时间36h)。

5)种子液的获得：分别将乳酸乳球菌乳酸亚种和屎肠球菌各自接接种于装有50ml种子培养基的250ml的锥形瓶中，调节培养基ph为6.4，温度40℃，培养36h。

6)可降解草酸的富硒乳酸菌产品的获得：将亚硒酸钠加入发酵培养基中，调节发酵培养基中se⁴⁺浓度为5μg/ml，500ml锥形瓶培养基装液量为300ml，分别将乳酸乳球菌乳酸亚种种子液和屎肠球菌种子液以5％的接种量接种于发酵培养基中，培养基ph为6.4，温度40℃，摇床培养37h，得到可降解草酸的富硒乳酸菌制剂。

上述所得能降解草酸的富硒乳酸菌制剂中，乳酸乳球菌乳酸亚种和肠屎肠球菌的总浓度为3.8×10¹⁰cfu/ml，有机硒(硒蛋氨酸)以硒的含量计为3.83μg/ml，硒转化率约为76.50％。

2、上述可降解草酸的富硒乳酸菌制剂饲喂食源性草酸过多犬试验

1)试验动物选取、处理及饲养管理：

a.选用10kg左右南京本地杂种雄犬40只，随机分为5组。

b.基础犬粮的配方和营养水平见表1。

c.试验前预养2周，注射犬五联疫苗。

d.试验时空白对照组饲喂基础犬粮，其他各组犬日粮添加草酸，草酸剂量为日粮的0.5％；除草酸对照组外，其他3草酸组分别添加有机硒(即添加硒蛋氨酸作为有机硒对照，无活酵母)、乳酸菌菌剂(乳酸菌菌剂的制备方法同本实施例的富硒乳酸菌制剂生产方法，不过发酵培养基中不加入亚硒酸钠，乳酸菌的总浓度为3.8×10¹⁰cfu/ml)、富硒乳酸菌制剂。有机硒和富硒乳酸菌制剂的添加量均以硒计为0.3mg/kg日粮。

e.整个试验时间30天，试验期间定时定量喂料，限水，常规管理和环境控制。于试验第0d、15d、和30d，采用尿导管导尿法收集犬尿液。4℃保存，收集24h尿液后，混匀，测尿量及ph值。用浓盐酸将5ml尿液酸化至ph为1后冻存，测定尿草酸的浓度；剩余尿液离心后，取上清液用于测定游离钙、尿素氮和尿肌酐。犬前肢外侧静脉采血，一部分装于抗凝管，一部分装于10ml离心管用于制备血清，将制好的血清-20℃保存备用。检测血钙、血尿素氮、血肌酐、血液抗氧化功能。第30d将实验犬采用呼吸麻醉后，取出犬的肾脏，将左肾切开后泡在10％的福尔马林中用作制备常规he切片；将右肾切成小块，按组织与生理盐水1:9的比例制成10％的匀浆液，用作组织酶的测定。

表1基础犬粮的配方和营养水平

表2富硒乳酸菌制剂对犬尿草酸含量的影响(mmol/l)

1注：0d表示未补给任何物质前1天，15d和30d表示补给富硒制剂和草酸后第15天和第30天，下同。

2注：同行中标有不同小写字母间表示差异显著(p＜0.05)，下同。

表3富硒乳酸菌制剂对犬尿ph值的影响

表4富硒乳酸菌制剂对犬血钙含量的影响(mmol/l)

表5富硒乳酸菌制剂对犬尿肌酐含量的影响(mmol/l)

表6富硒乳酸菌制剂对犬抗氧化功能的影响

表7富硒乳酸菌制剂对犬尿尿素氮含量的影响(mmol/l)

表8富硒乳酸菌制剂对犬血尿素氮含量的影响(mmol/l)

表9富硒乳酸菌制剂对犬血肌酐含量的影响(mmol/l)

表10富硒乳酸菌制剂对犬尿钙含量的影响(mmol/l)

表11富硒乳酸菌制剂对犬全血硒含量的影响(mg/l)

2)结果分析：在试验第15d时，与草酸组相比，仅富硒乳酸菌组防止草酸升高作用显著，在试验第30d时，与草酸组比较，乳酸菌组和富硒乳酸菌组防止草酸升高作用均显著，其中富硒乳酸菌对防止草酸升高作用显著优于有机硒组对防止草酸的升高作用(见表2)；有机硒、乳酸菌和富硒乳酸菌在试验第15d和第30d均能防止尿液ph的降低，与草酸组相比差异显著，且富硒乳酸菌防止尿液ph下降的效果最显著(见表3)；在试验第15d时，三个试验组对犬血钙影响不显著，在试验第30d时，与草酸组比较，富硒乳酸菌组可显著防止血钙降低，而有机硒组和乳酸菌组差异不显著(见表4)；在提高机体抗氧化能力上，富硒乳酸菌可显著提高机体血和肾组织抗氧化酶如超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)和过氧化氢酶(cat)的活性，显著防止血和肾组织丙二醛(mda)的升高(见表6)；与草酸组比较，三个试验组有可防止尿液肌酐和尿素氮的降低，以及血液肌酐和尿素氮的升高的作用，但差异不显著(见表5、表7、表8、表9)；在试验第15d和30d，与草酸组比较，乳酸菌和富硒乳酸菌能显著防止尿钙升高(见表10)；能升高犬全血硒含量(见表11)。结合5个处理组的肾脏he切片图(图1-5)可知，富硒乳酸菌制剂可有效预防犬草酸尿石症的发生。综上所述，富硒乳酸菌的上述效果显著优于单纯的有机硒和乳酸菌组。

实施例2：可降解草酸的富硒乳酸菌制剂对食源性草酸过多犬尿石症的预防作用试验

可降解草酸的富硒乳酸菌制剂，其生产方法同实施例1。制得的可降解草酸的富硒乳酸菌制剂中，乳酸乳球菌乳酸亚种和肠屎肠球菌的总浓度为6.7×10¹⁰cfu/ml，有机硒以硒的含量计为3.79μg/ml，有机硒转化率约为75.79％。

1)试验动物选取、处理及饲养管理：

a.选用10kg左右南京本地杂种雄犬为试验对象。

b.饲喂基础犬粮的配方和营养水平见表1。

c.试验前预养2周，注射犬五联疫苗。

d.试验犬随机分为3组，每组8只。a组为空白对照组，饲喂基础犬粮；b组为草酸对照组，每天饲喂基础犬粮并按犬粮重量0.5％添加草酸；c组每天饲喂基础犬粮并按犬粮重量0.5％添加草酸，并补给可降解草酸富硒乳酸菌制剂，其计量以硒计为0.3mg/kg日粮。

e.整个试验时间30天，试验期间定时定量喂料，限水，常规管理和环境控制。

表12富硒乳酸菌制剂对犬尿草酸含量的影响(mmol/l)

表13富硒乳酸菌制剂对犬抗氧化功能的影响

表14富硒乳酸菌对犬全血硒含量的影响(mg·l^-1)

2)结果分析：应用可降解草酸的富硒乳酸菌制剂于犬日粮中，能显著防止尿液草酸升高(见表12)、可显著提高机体抗氧化能力(见表13)；能升高犬全血硒含量(见表14)。结合肾组织切片记分表明，本发明可降解草酸的富硒乳酸菌能显著减少犬尿草酸尿石症的发生。