本发明属于发酵乳领域，具体涉及一种发酵乳的制备方法。此外，本发明还涉及一种发酵乳及发酵乳粉。
背景技术：
近年来，糖尿病在全世界广泛流行，目前已成为继肿瘤、心血管疾病之后第三大类严重危害人类健康的慢性疾病。随着我国经济、社会的迅速发展，膳食结构和生活方式的改变，人口老龄化速度的加快，糖尿病的患病率也呈现快速增加的趋势。在糖尿病患病率快速上升的同时，我国糖尿病的知晓率、治疗率及控制率明显偏低。糖尿病已成为一个严重危害我国人群健康的公共卫生问题，对经济社会发展产生越来越严重的影响。
根据发病机制不同，糖尿病分为I型糖尿病(胰岛素依赖型)和II型糖尿病(非胰岛素依赖型)，后者约占糖尿病总数的85％以上。迄今为止，治疗II型糖尿病的药物根据治疗机制不同主要分为：(1)促胰岛素分泌剂；(2)胰岛素增敏剂；(3)α-葡萄糖苷酶抑制剂(α-GI)。由于α-GI具有作用温和持久、毒副作用小甚至无毒的优点，因此得到越来越多国内外研究者的青睐。
研究表明，α-葡萄糖苷酶抑制剂(α-GI)可有效地降低糖尿病人的餐后高血糖，作为口服降糖药的一种，其发生作用的场所位于小肠，作用方式是抑制小肠体内的α-葡萄糖苷酶活性，从而达到降低餐后高血糖的目的。如果使用者饮食中碳水化合物占50％以上，则降糖效果更为明显，因此其适用于以碳水化合物为主食的人群，尤其是中老年糖尿病患者。
普通发酵乳中通常会含有大量的糖，所以高血糖的病人不能饮用。而目前所发现的α-GI虽能克服传统降糖药的一些缺点，但其来源相对狭窄，主要集中于放线菌，这些菌株无法代谢脱脂乳产生α-葡萄糖苷酶抑制剂，因此，市场上至今未有具备显著抑制α-葡萄糖苷酶活性的发酵型乳制品面市，这是本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现要素：
基于上述技术问题，本发明提供了一种新的发酵乳的制备方法，采用该方法可以制得具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的发酵乳制品。
具体的，一方面，提供了一种发酵乳的制备方法，包括以下步骤：将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333接种于脱脂乳中进行发酵，得到发酵乳。
进一步地，上述牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333的接种量为1.25x106～1x107cfu/mL。
进一步地，上述脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为6～12％。
进一步地，上述发酵的温度为20℃～35℃。
进一步地，上述发酵的时间为3～12h。
进一步地，上述发酵为振荡培养，振荡速度为100～300rpm。
第二方面，还提供了一种发酵乳，由上述任一种制备方法制得。
第三方面，还提供一种发酵乳粉，由上述发酵乳进行冷冻干燥制得。
进一步地，上述发酵乳粉对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50≤86mg/mL。
与现有技术相比，上述技术方案中的制备方法，首次采用牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333，以脱脂乳作为培养基进行发酵，制备得到具有α-葡萄糖苷酶抑制活性发酵乳，披露了牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333具有发酵脱脂乳生成α-葡萄糖苷酶抑制剂的新用途。与其他常规发酵脱脂乳的菌株相比，牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333所制备的发酵乳对α-葡萄糖苷酶的抑制活性更显著，并且稳定性较好。
具体实施方式
为更清楚的对本发明技术方案予以阐述，下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步阐述：
在一个具体的实施方式中，提供了一种发酵乳的制备方法，包括以下步骤：将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333接种于脱脂乳中进行发酵，得到发酵乳。
上述技术方案中的制备方法，首次采用牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333，以脱脂乳作为培养基进行发酵，制备得到具有α-葡萄糖苷酶抑制活性发酵乳，披露了牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333具有发酵脱脂乳生成α-葡萄糖苷酶抑制剂的新用途。与其他常规发酵脱脂乳的菌株相比，牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333所制备的发酵乳对α-葡萄糖苷酶的抑制活性更显著，并且稳定性较好。
此外，上述技术方案中的制备方法极大简化了生产步骤，节省了生产成本，同时降低了非连续性操作中带来的污染风险；制备所采用的发酵培养基来源广泛、成本低廉、天然安全，在降低物料成本的同时，提高了食品的安全性。
进一步地，牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333的接种量为1.25x106～1x107cfu/mL；较佳地为2.5x106～7.5x106cfu/mL，更佳地为5x106cfu/mL。
脱脂乳可以是新鲜的脱脂乳，也可以是配制而成的脱脂乳。优选的为配制的脱脂乳，配制的脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为6～12％。制备方法可以包括以下步骤：在蒸馏水中加入脱脂乳粉，混匀充分溶解后，95～125℃灭菌5～20分钟，冷却即得。
优选的发酵温度为20℃～35℃；较佳地为25℃～35℃；更佳地为30℃。
优选的发酵时间为3～12h；较佳地为6～12小时；更佳地为6小时。
优选的发酵方式为振荡培养，振荡速度为100～300rpm；较佳地为150～250rpm；更佳地为200rpm。
结合实施例和比较例1亦可知，在优选发酵参数的范围之外时，牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵脱脂乳的产物对α-葡萄糖苷酶抑制效果明显下降。而在优选范围之内，接种量、脱脂乳浓度、发酵温度和时间相互影响，使得牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵产生的具有α-葡萄糖苷酶抑制效果的发酵乳的抑制效果更佳。例如，在接种量过少时，菌种繁殖速度慢，使得最终获得的发酵乳对α-葡萄糖苷酶的抑制活性低于优选的接种量范围；当接种量过多时，一定时间后菌种个体因生存空间及营养的限制而死亡或停滞生长，不利于代谢物的积累，也使得最终获得的发酵乳对α-葡萄糖苷酶的抑制活性低于优选的接种量范围。又例如，当发酵温度低于优选范围值时，菌种代谢缓慢，会导致发酵乳的α-葡萄糖苷酶抑制活性有所降低。还例如，发酵的振荡速度低于优选范围时，菌种发酵的溶氧量不够，生产和代谢受到限制，导致发酵乳的α-葡萄糖苷酶抑制剂活性降低。
在另一个具体的实施方式中，提供了一种发酵乳，该发酵乳由上述任一种发酵乳的制备方法制得。此外，提供了一种发酵乳粉，该发酵乳粉由上述的发酵乳进行冷冻干燥制得。
由于发酵乳的制备方法具备上述的有益效果，由该制备方法制得的发酵乳以及发酵乳粉也具有相应的有益效果，此处不再赘述。
较佳地，上述的冷冻干燥为真空冷冻干燥，真空冷冻干燥条件较佳地为：板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～2.0mm，真空度10～30Pa。
采用冷冻干燥，将发酵乳制备成发酵乳粉，从而更便于消费者使用和运输，同时，冷冻干燥得到的发酵乳粉的α-葡萄糖苷酶抑制活性不会产生较大的变化。
进一步的，上述发酵乳粉对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50≤86mg/mL。结合实施例亦可知，上述发酵乳粉的α-葡萄糖苷酶的抑制活性显著高于其他常规脱脂乳发酵菌株。
下面通过实施例进一步说明上述具体实施方式，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，所有原料均为市售，并均符合相关的国家标准。
实施例1
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333(该菌株的来源请参见公开号为CN 103740618A的中国专利)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于TYC固体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，30℃好氧培养48h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL TYC液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，30℃、180rpm振荡培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于TYC液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，30℃、180rpm振荡培养24h后，培养物15,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子，种子液的菌浓度为2.5x108cfu/mL。
(b)脱脂乳的制备：将质量百分比为10％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在125℃下灭菌5min，冷却至室温，即得所需浓度的脱脂乳。
(c)待测样品制备：将发酵乳粉溶解于无菌水中，煮沸10min后冷却至室温，再4℃、10,000rpm离心10min，取上清，pH调节至6.80，再次4℃、10,000rpm离心10min，取得的上清即可用于α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测。
α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测：取100μL待测样品于1.5mL EP(Eppendorf)管，接着加入50μLα-葡萄糖苷酶(100mU/mL，sigma，美国)，混匀，37℃温育15min，然后加入80μL 2mM的PNPG(sigma，美国)，混匀，37℃反应15min，最后加入80μL 0.2M的Na2CO3终止反应，再4℃、10,000rpm离心2min，取200μL上清于96孔微孔板(Greinerbio-one，德国)，在405nm波长下用Spectra Max M5多功能酶标仪(MolecularDevices,美国)测定吸光度值。待测样品对α-葡萄糖苷酶的抑制活性如以下公式所示：
其中：阴性对照组为空白脱脂乳替代待测样品；
阴性空白组为0.1M、pH＝6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)替代阴性对照组中的α-葡萄糖苷酶；
样品空白组为PBS替代待测样品组中的α-葡萄糖苷酶。
α-葡萄糖苷酶半抑制率浓度IC50的测定：以倍半稀释的方法将待测样品溶液进行稀释，获得不同浓度的待测样品组，利用上述检测方法测定不同浓度的待测样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率，根据浓度与α-葡萄糖苷酶抑制率构成的线性关系计算得出样品对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度(IC50)。
2、具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的发酵乳及发酵乳粉的制备
将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量2％(v/v，种子液占发酵液的体积百分比，下同)无菌接种于10％(w/w)脱脂乳，30℃、200rpm培养6小时得发酵乳。
将发酵乳冷冻干燥即得发酵乳粉A。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
将发酵乳粉A以上述方法制备为待测样品后测定其对α-葡萄糖苷酶抑制活性，结果表明该发酵乳粉对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50＝59mg/mL。
实施例2
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
(b)脱脂乳的制备：将质量百分比为12％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在95℃下灭菌20min，冷却至室温，即得所需浓度的脱脂乳。
(c)待测样品制备：同实施例1。
2、具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的发酵乳及发酵乳粉的制备
将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量0.5％(v/v)无菌接种于12％(w/w)脱脂乳，35℃、100rpm培养12小时得发酵乳。
将发酵乳冷冻干燥即得发酵乳粉B。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
将发酵乳粉B以上述方法制备为待测样品后测定其对α-葡萄糖苷酶抑制活性，结果表明该发酵乳粉对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50＝68mg/mL。
实施例3
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
(b)脱脂乳的制备：将质量百分比为6％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在100℃下灭菌15min，冷却至室温，即得所需浓度的脱脂乳。
(c)待测样品制备：同实施例1。
2、具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的发酵乳及发酵乳粉的制备
将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量4％(v/v)无菌接种于6％(w/w)脱脂乳，20℃、300rpm培养3小时得发酵乳。
将发酵乳冷冻干燥即得发酵乳粉C。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
将发酵乳C以上述方法制备为待测样品后测定其对α-葡萄糖苷酶抑制活性，结果表明该发酵乳粉对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50＝86mg/mL。
实施例4
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
(b)脱脂乳的制备：将质量百分比为8％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在120℃下灭菌10min，冷却至室温，即得所需浓度的脱脂乳。
(c)待测样品制备：同实施例1。
2、具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的发酵乳及发酵乳粉的制备
将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量3％(v/v)无菌接种于8％(w/w)脱脂乳，25℃、250rpm培养5小时得发酵乳。
将发酵乳冷冻干燥即得发酵乳粉D。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
将发酵乳D以上述方法制备为待测样品后测定其对α-葡萄糖苷酶抑制活性，结果表明该发酵乳粉对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50＝66mg/mL。
实施例5
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
(b)脱脂乳的制备：将质量百分比为9％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在115℃下灭菌12min，冷却至室温，即得所需浓度的脱脂乳。
(c)待测样品制备：同实施例1。
2、具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的发酵乳及发酵乳粉的制备
将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量1％(v/v)无菌接种于9％(w/w)脱脂乳，28℃、150rpm培养9小时得发酵乳。
将发酵乳冷冻干燥即得发酵乳粉E。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
将发酵乳E以上述方法制备为待测样品后测定其对α-葡萄糖苷酶抑制活性，结果表明该发酵乳粉对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50＝72mg/mL。
效果实施例1产品口味与喜好程度测试
取上述实施例1-5所制备的发酵乳粉产品A、B、C、D和E溶解于温水中，得到浓度为100mg/mL的发酵乳溶液，以此为实验对象，进行产品的口味测试。测试人数50人。品尝方式：采用不记名打分的方式进行品尝；分别对上述发酵乳粉产品A、B、C、D和E的色泽、风味、口感、营养项进行单独打分，每一项满分是25分，计算平均分及其总分，统计结果记录于表1。同时，根据对产品的整体喜好程度给出的意见，统计对每个单品的喜好人数，统计结果记录于表2。
表1产品口味测试结果数据统计表
表2产品喜好程度测试结果数据统计表
从产品口味测试和喜好程度统计结果可以看出，总体而言，通过本发明技术方案中的方法所制得的具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的发酵乳粉在产品风味、口感、营养方面可被大部分消费者所接受。
效果实施例2冷藏条件下发酵乳粉对α-葡萄糖苷酶抑制效果的稳定性
将实施例1-5制备的发酵乳粉A、B、C、D和E置于常温条件(25℃)保存0、10、20和30天后取出，分别测定各样品对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50值，结果如表3所示。
表3常温条件下发酵乳粉对α-葡萄糖苷酶抑制效果的稳定性
由表3可知，所有测试的发酵乳粉在常温(25℃)保存30天后，对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50稳定保持在同一水平，稳定性较好。
对比例1
将实施例1中的接种量，脱脂乳浓度，培养温度，发酵时间以及发酵振荡的速度逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的发酵乳粉，各组所得发酵乳粉对α-葡萄糖苷酶的抑制效果如表4所示。
表4不同方法制备所得发酵乳粉对α-葡萄糖苷酶的抑制效果
从表4所示的结果中可以得出，将所述发酵乳粉的制备方法中接种量，脱脂乳浓度，培养温度，发酵时间以及发酵振荡的速度调整到优选范围之外的时候，牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333依然可以发酵脱脂乳产生α-葡萄糖苷酶抑制剂，但是产物的α-葡萄糖苷酶抑制效果明显下降。
对比例2
参考实施例1所述方法，比较由牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333、干酪乳杆菌(L.casei)ATCC 393(购买自ATCC)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)LB340(由丹尼斯科公司提供)、嗜热链球菌(S.thermophilus)ST-BODY-3(由科.汉森公司提供)制备的发酵乳粉对α-葡萄糖苷酶的抑制效果，具体操作如下：
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：
干酪乳杆菌和保加利亚乳杆菌种子的制备：将干酪乳杆菌ATCC 393和保加利亚乳杆菌LB340的冻干粉分别用少量无菌蒸馏水溶解，各自用接种环取一环划线于MRS固体培养基(购买自Merck Co.德国)上，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mL MRS液体(购买自Merck Co.德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mL MRS液体，37℃培养24h后，培养物9,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到相应的发酵用的种子。
嗜热链球菌种子的制备：将嗜热链球菌ST-BODY-3的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于M17固体培养基(购买自Merck Co.德国)上，40℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mL M17液体(购买自Merck Co.德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，40℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mLM17液体，40℃培养24h后，培养物9,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。
(b)脱脂乳的制备：同实施例1。
(c)待测样品制备：同实施例1。
2、发酵乳及发酵乳粉的制备
将各菌株以2％(v/v)接种量无菌接种于10％(w/w)脱脂乳，分别培养(保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌37℃厌氧培养，嗜热链球菌40℃厌氧培养，牛类芽孢杆菌30℃、200rpm振荡培养)6h，获得相应的发酵乳。
将相应的发酵乳冷冻干燥制得相应的发酵乳粉。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
上述不同菌株制备的发酵乳粉对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50如表5所示：
表5不同菌株制备的发酵乳粉对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50
由表5可知，其他常规脱脂乳发酵菌株发酵脱脂乳的产物不具有α-葡萄糖苷酶的抑制活性，而牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333制备的发酵乳粉对α-葡萄糖苷酶的抑制活性非常显著。
以上对本发明所提供的发酵乳、发酵乳的制备方法以及发酵乳粉进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。