一种分菌制曲、混菌发酵制备米渣蛋白酱油的方法与流程

本发明涉及食品加工领域，具体涉及一种将红曲霉和米曲霉分别单独制曲后，再接入泡菜粉混合发酵制备米渣蛋白酱油的方法。

背景技术：

酱油是以蛋白质原料为主原料，以淀粉质原料为辅原料，提供曲霉适宜的生长环境，后期发酵合成具有特殊酱香、酯香、色泽红润、体态醇厚的调味品。传统的酱油酿造中蛋白质原料多采用大豆、豆粕，但价格高、用量大，且转基因食品的安全性存在一定的不确定性。如何就地取材、变废为宝、综合利用，已成为酱油酿造行业关注的热点。米渣蛋白是优质的植物蛋白，具有低过敏性、利于消化等特性，且其氨基酸组成适合人体需求。大米经过高温淀粉酶液化水解后，再经过板框压滤机过滤除去糖类物质得到的富含蛋白质的残渣，称为米渣蛋白粉。米渣蛋白粉中蛋白质的含量高达60％左右，但是由于大米淀粉糖加工过程中高热和各种化学因子的作用，导致米渣蛋白高度聚集，使米渣蛋白发生结构改变，更加难溶，并且难以降解，因而限制了其在食品在的应用。目前米渣蛋白粉主要用于饲料，价格较为便宜，市场价格在2500-4000元/吨。将米渣蛋白粉用于酱油酿造，使淀粉糖企业、味精企业产生的大量下脚料——米渣蛋白粉得以充分利用，且新品酱油——米渣蛋白酱油可以达到GB 18186-2000特级酿造酱油的质量标准，大幅度提高了大米及米渣蛋白粉的附加值，丰富了调味品市场。但米渣蛋白酱油存在的问题是蛋白质利用率偏低，同样条件下，蛋白质利用率明显低于大豆酱油；其次，米渣蛋白酱油的颜色较为黯淡，风味稍逊于大豆酱油。

我国酱油行业普遍以沪酿3.042米曲霉为主要菌种制曲，此菌种具有生长快、产孢量大、酶系丰富、不产毒素等特点。但单菌种制曲与多菌种制曲相比，成曲酶系较为单一，不能充分的分解蛋白质及淀粉类原料，生成游离氨基酸的能力较弱，造成全氮利用率低，导致产品风味不足。采用多菌种制曲与发酵，弥补了米曲霉单一菌种所产生的酶系不全的缺陷，使酱醪中各种酶类的比例更为合理，提高酱油产品质量。因此制曲是酱油酿造中至关重要的一个环节，成曲质量的好坏直接影响到酱油的品质。目前对于多菌种制曲的研究主要在米曲霉和黑曲霉之间混合制曲，也有研究在制曲时添加根霉等，或在发酵阶段添加酵母与乳酸菌，对酱油的风味物质的形成起到重要的作用。而将红曲霉应用于酱油发酵的研究还比较少，也未见在发酵初始时直接将泡菜粉接入进行多菌种耦合发酵制备酱油的报道。

CN102187994公布了以米渣为主要原料的酱油生产工艺，是将红色红曲霉Monascus ruber先在斜面试管活化5-6天，然后接入三角瓶进行一级种子培养，培养3天。米曲霉、黑曲霉先在斜面试管活化2-3天，然后接入三角瓶进行一级种子培养，培养1-2天。取质量百分比为60％米渣、40％麸皮，控制水含量35％，用旋转式蒸锅0.2-0.4Mpa蒸料1-2小时，快速冷却至37-40℃接入5％红曲霉液体种子，30℃通风培养24小时后，每隔8小时翻曲一次，到培养第四天，再分别接种5％米曲霉和5％黑曲霉混合液体菌种，30℃通风培养2天，氨基酸态氮为0.93g/100ml。该申请先将红曲霉接入米渣培养基生长4d后，再接入米曲霉和黑曲霉，经本申请人研究发现，1)当红曲霉接入米渣蛋白粉培养基，随着培养天数的增加，水分减少，再接入米曲霉和黑曲霉，水分不足，导致生长状况不佳；2)适于米曲霉制曲的曲料水分含量并不适于红曲霉制曲，米曲霉制曲所需的水分含量明显高于红曲霉制曲，二者生长所需的水分条件有明显冲突；3)红曲霉生长、繁殖和代谢影响米曲霉和黑曲霉的生长；正因为混菌制曲中存在的问题，导致蛋白质利用率和酱油质量尚有提高的空间。另外，该申请所用红曲霉菌种为红色红曲霉Monascus ruber。

CN104172094公开了一种酱油酿造工艺，面粉、麸皮按质量比3:1混合，经120-122℃、0.15-0.18Mpa蒸料灭菌，抽真空，0.04Mpa、37-38℃接0.3％米曲霉、黑曲霉、红曲霉或根霉，分开制曲，再混合发酵，发酵后再依次接入纳豆菌、乳酸菌、生香酵母发酵，总发酵时间25-30天。它是以大豆或豆粕为主原料，不同于本发明所涉及的产品，并且没有涉及每种曲霉菌的制曲方法，氨基酸态氮达到1.44g/100ml，蛋白质的利用率达到90％左右。

传统的多菌种制曲多集中在米曲霉和黑曲霉混合制曲。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种大米蛋白转化率高，并且氨基态氮、总氮、可溶性无盐固形物等酿造酱油质量指标相对较高，红色指数也较高，色泽红润、酱香醇厚，且具有红曲特定功能的制备米渣蛋白酱油的方法。

本发明目的的实现方式为，一种分菌制曲，混菌发酵制备米渣蛋白酱油的方法，是由下述方法制备的，制备的具体步骤为：

1)用红曲霉制红曲成曲

①红曲霉斜面种子活化：将红曲霉保藏菌种转接至斜面活化培养基上，斜面活化培养基为PDA马铃薯培养基，于28-30℃培养箱中活化培养7-10d；

②液体种子扩大培养：将活化的斜面红曲霉种子转接至红曲霉液体种子培养基中，于30℃、150r/min摇床振荡培养5d；液体种子可根据需要逐级扩大；

所述红曲霉液体种子培养基的成分为：7％丙三醇，3％牛肉浸膏，0.8％硝酸钠，0.8％蛋白胨，3％葡萄糖，0.1％硫酸镁；

③红曲曲料制备：先将米渣蛋白粉用水润透，再将面粉、麸皮加入，充分混匀，115℃蒸料20min，取出，冷却至35℃以下，备用；其中米渣蛋白粉、面粉、麸皮、水按质量比6:2:2:6-6.6的比例混合；

④接种：液体种子以质量百分比3-5％的接种量接入制备好的红曲曲料中，控制温度30-35℃，湿度85-90％，每隔24h翻曲一次，制曲72h得红曲成曲；

2)用米曲霉制米曲成曲

①米曲曲料制备：先将米渣蛋白粉用水润透，再将面粉、麸皮加入，充分混匀，115℃蒸料20min，取出，冷却至35℃以下，备用；其中米渣蛋白粉、面粉、麸皮、水按质量比为6:2:2:7.8的比例混合；

②接种：在米曲曲料中按质量比为2‰的接种量接入米曲霉孢子粉，控制温度30-35℃，湿度85-90％，制曲12h后翻曲，曲料温度不超过35℃；制曲16h时，第二次翻曲，调节温度，将温度控制在28-32℃，制曲36h时出曲，得米曲成曲；

3)混菌发酵：将步骤1)制得的红曲成曲与步骤2)制得的米曲成曲按质量比4:6混合，再按质量比接入0.20-0.30％的泡菜粉，然后均匀拌入2.5倍体积、浓度为15.2％的盐水，于30-35℃耦合发酵≧30天，得米渣蛋白酱油。

本发明的优点如下：

1、对照GB18186-2000酿造酱油(以大豆或豆粕为主要原料)的质量标准，选用米渣蛋白粉作为蛋白质主料发酵所得生酱油，感官质量和理化指标均可达到一级酱油标准；

2、选用蛋白酶、糖化酶活力高，适合于米渣蛋白酱油生产的红曲霉菌种Monascus anka，有利于提高米渣中难降解谷蛋白的利用率和多糖的降解率，总蛋白质利用率可达70％；

3、红曲霉经活化、液体种子扩大培养接入米渣蛋白粉固体培养基中控制温度、湿度，使红曲霉生长达到最佳，成曲蛋白酶活可达到1600U/g干曲以上、糖化酶活达到700U/g干曲以上；

4、由于红曲霉与米曲霉制曲条件和时间差异很大，互相冲突，将二者分开制曲，可分别获得两种高质量的成曲；

5、通过发酵试验研究，确定红曲成曲与米曲成曲按4:6的质量比充分混合均匀，并接入0.20-0.30％的泡菜粉，发酵制得的米渣蛋白生酱油氨基态氮、总氮、可溶性无盐固形物等酿造酱油质量指标相对较高，风味怡人，红色指数也较高。

附图说明

图1为泡菜粉发酵米渣生酱油的氨基态氮含量(g/100mL)图，

图2为泡菜粉发酵米渣生酱油的总氮含量(g/100mL)图，

图3为泡菜粉发酵米渣生酱油的电子舌主成分分析图。

具体实施方式

本发明是将润水浸透的米渣蛋白粉与面粉、麸皮混合均匀，原料配比为米渣蛋白粉：面粉：麸皮：水质量比为6:2:2:6-6.6，然后蒸料、冷却，得曲料，备用。红曲霉用马铃薯培养基活化，然后将活化的红曲霉种子在红曲霉液体种子培养基中摇床振荡培养，再以质量百分比为3-5％的接种量接入曲料中，控制温度30-35℃，湿度85-90％，制曲72h得红曲成曲。采用以上条件，使红曲霉生长达到最佳，成曲酸性蛋白酶活、糖化酶活均较高。润水浸透米渣蛋白粉与面粉、麸皮混匀、蒸料、冷却，接入米曲霉，制曲、翻曲，得米曲成曲；红曲与米曲按质量比4:6混合，并接入0.20-0.30％的泡菜粉，拌入2.5倍、浓度为15.2％的盐水于30-35℃耦合发酵至少30天，得米渣蛋白酱油。混菌发酵阶段，每隔3-5d通气搅拌一次。

本发明从大量实验中得出结论：当红曲成曲与米曲成曲按4:6的质量比充分混合均匀，并接入0.20-0.30％的泡菜粉耦合发酵，使氨基态氮、总氮、可溶性无盐固形物等酿造酱油质量指标相对较高，风味怡人，红色指数也较高。故红曲成曲与米曲成曲选择质量比为4:6。

本发明步骤1)中所用红曲霉菌种为Monascus anka、Monascus ruber和Monascus purpureus。优选出更适合于米渣蛋白酱油生产的红曲霉菌种Monascus anka)，红曲霉菌种Monascus anka的特点是酸性蛋白酶活、糖化酶活力高，红曲霉单独制曲成曲色价也较高。

PDA马铃薯培养基的配制方法是：将200g去皮土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，加热至沸腾，维持20-30min，8层纱布过滤，弃滤渣；继续加热，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g，补充水分到1000ml。

本申请人做了接入质量比P1-P9分别为0％,0.05％,0.10％,0.15％,0.20％,0.25％,0.30％,0.35％,0.50％的泡菜粉后耦合发酵后所得米渣蛋白酱油，氨基态氮含量(g/100mL)、总氮含量(g/100mL)、电子舌主成分分析实验起结果见图1、2、3，从图1、2、3可见，P5、P6、P7氨基态氮、总氮、风味及感官质量均明显优于对照，按质量比接入0.20-0.30％的泡菜粉较好，优选的是按质量比接入0.20-0.25％；更优选的是按质量比接入0.25％的泡菜粉。

本申请人做了接入质量比P1-P9分别为0％,0.05％,0.10％,0.15％,0.20％,0.25％,0.30％,0.35％,0.50％的泡菜粉后耦合发酵后所得米渣蛋白酱油游离氨基酸及含量(mg/100ml)实验，实验结果见下表。

续表

从上表可见，按质量比接入0.20-0.30％的泡菜粉游离氨基酸及含量较好，优选的是按质量比接入0.20-0.25％；更优选的是按质量比接入0.25％的泡菜粉。

下面将结合具体实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

1)用红曲霉Monascus anka制红曲成曲

①红曲霉Monascus anka斜面种子活化：将红曲霉保藏菌种转接至斜面活化培养基上，斜面活化培养基为PDA马铃薯培养基，于28-30℃培养箱中活化培养7-10d。

PDA马铃薯培养基，配制方法为将200g去皮土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，加热至沸腾，维持20-30min，8层纱布过滤，弃滤渣。继续加热，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g，补充水分到1000ml。

②液体种子扩大培养：将活化的斜面红曲霉种子转接至红曲霉液体种子培养基中，于30℃、150r/min摇床振荡培养5d；液体种子可根据需要逐级扩大。

所述红曲霉液体种子培养基的成分为：7％丙三醇，3％牛肉浸膏，0.8％硝酸钠，0.8％蛋白胨，3％葡萄糖，0.1％硫酸镁。

③红曲曲料制备：先将米渣蛋白粉用水润透，再将米渣蛋白粉、面粉、麸皮加入，充分混匀，115℃蒸料20min，取出，冷却至35℃以下，备用。其中米渣蛋白粉、面粉、麸皮、水按质量比6:2:2:6的比例混合。

④接种：液体种子以体积质量百分比3％的接种量接入制备好的红曲曲料中，控制温度30-35℃，湿度85-90％，每隔24h翻曲一次，制曲72h得红曲成曲。

测得红曲成曲蛋白酶活可达1600U/g干曲以上，糖化酶活可达700U/g干曲以上。

2)用米曲霉制米曲成曲

①米曲曲料制备：先将米渣蛋白粉用水润透，再将米渣蛋白粉、面粉、麸皮加入，充分混匀，115℃蒸料20min，取出，冷却至35℃以下，备用。其中米渣蛋白粉、面粉、麸皮、水按质量比为6:2:2:7.8的比例混合。

②接种：在米曲曲料中按质量比为2‰的接种量接入米曲霉孢子粉，控制温度30-35℃，湿度85-90％，制曲12h后翻曲，曲料温度不超过35℃；制曲16h时，第二次翻曲，调节温度，将温度控制在28-32℃，制曲36h时出曲，得米曲成曲；

3)混菌发酵：将步骤1)制得的红曲成曲与步骤2)制得的米曲成曲按质量比4:6混合，并接入0.25％的泡菜粉，均匀拌入2.5倍体积、浓度为15.2％的盐水，于30-35℃耦合发酵至少30天，得米渣蛋白酱油。

实施例2、同实施例1，不同的是，

1)红曲霉Monascus purpureus斜面种子活化：将红曲霉保藏菌种转接至斜面活化培养基上，斜面活化培养基为PDA马铃薯培养基，于28-30℃培养箱中活化培养7-10d。

测得红曲霉Monascus purpureus成曲蛋白酶活可达800U/g干曲以上，糖化酶活可达600U/g干曲以上。蛋白酶活力低于实施例1，曲料红色较浅。

实施例3、同实施例1，不同的是，

1)红曲霉Monascus ruber斜面种子活化：将红曲霉保藏菌种转接至斜面活化培养基上，斜面活化培养基为PDA马铃薯培养基，于28-30℃培养箱中活化培养7-10d。

测得红曲霉Monascus ruber的成曲蛋白酶活与Monascus anka相近，但糖化酶活力明显低于Monascus anka和Monascus purpureus。

从例1、2、3说明采用三种红曲霉(Monascus anka、Monascus purpureus、Monascus ruber)均能制得质量良好的红曲，但以红曲霉Monascus anka为最优，蛋白酶活、糖化酶活力均较高，成曲色价高。

实施例4、同实施例1，不同的是，

1)用红曲霉Monascus anka制红曲成曲

①红曲霉Monascus anka斜面种子活化：将红曲霉保藏菌种转接至斜面活化培养基上，斜面活化培养基为PDA马铃薯培养基，于28-30℃培养箱中活化培养8d。

③红曲曲料制备：米渣蛋白粉、面粉、麸皮、水按质量比6:2:2:6.6的比例混合。

④接种：液体种子以体积质量百分比3％的接种量接入制备好的红曲曲料中。

测得红曲成曲蛋白酶活可达1600U/g干曲以上，糖化酶活可达700U/g干曲以上。

从例1、4说明米渣蛋白粉、面粉、麸皮、水按质量比6:2:2:6-6.6的比例混合，红曲成曲的蛋白酶活、糖化酶活值最高，故本发明选择米渣蛋白粉、面粉、麸皮、水按质量比6:2:2:6-6.6的比例混合。