紫檀芪在防治葡萄灰霉病和荔枝霜疫霉病中的应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及紫檀芪在防治葡萄灰霉病和荔枝霜疫霉病中的应用。
背景技术：
：葡萄和荔枝均是重要的经济作物，已成为许多农村经济发展的支柱，但两种果品都不易贮藏保鲜，发明新的保鲜剂或发展新保鲜技术以控制其采后病害在两果品的采后增值和延长供应期上将起到至关重要的作用。葡萄灰霉病是葡萄采后最重要的病害之一，病原菌为灰葡萄孢(Botrytiscinerea)，可导致葡萄在销售和低温贮运过程中果实腐烂、脱粒。由荔枝霜疫霉病菌(PeronophythoralitchiChenexKoetal.)引起的霜疫霉病是荔枝采后贮藏保鲜中最主要的病害，在温湿度适宜的条件下，病菌迅速侵染扩展，引起果皮的褐变、果肉腐烂并渗出酒酸味的汁液，严重限制了果实的采后贮运。目前对果实采后病害的控制主要以化学药剂为主，但存在使用不当造成农药残留危及人类健康及易导致病原菌产生抗药性的风险。因此，选择对人、畜和有益生物安全，对生态环境无压力的天然产物控制采后病害成为近年的研究热点之一。紫檀芪(Pterostilbene:3,5-二甲氧基-4’-羟基二苯乙烯)是一种重要的植物多酚，存在于紫檀木、越桔浆果和花生等植物中。技术实现要素：为了克服有机合成农药在防治果实采后病害上的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种天然植物代谢产物紫檀芪在水果采后病害葡萄灰霉病和荔枝霜疫霉病防治方面的新用途。本发明的一个目的是提供紫檀芪或其溶液的如下用途：本发明提供了紫檀芪或其溶液抑制荔枝霜疫霉病菌(Peronophythoralitchii)中的应用。本发明提供了紫檀芪或其溶液抑制荔枝霜疫霉病菌(Peronophythoralitchii)菌丝生长和/或孢子囊萌发中的应用。本发明提供了紫檀芪或其溶液在防治荔枝霜疫霉病(Peronophythoralitchii)中的应用；或紫檀芪或其溶液在防治采后果实感染荔枝霜疫霉病菌(Peronophythoralitchii)中的应用。上述应用中，所述防治采后果实感染荔枝霜疫霉病菌(Peronophythoralitchii)体现在降低采后果实感染荔枝霜疫霉病菌病情指数和/或褐变指数；或所述果实为荔枝。本发明提供了紫檀芪或其溶液在抑制葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)中的应用。本发明提供了紫檀芪或其溶液在抑制葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)菌丝生长和/或孢子萌发中的应用。本发明提供了紫檀芪或其溶液在防治葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)中的应用；或，紫檀芪在防治采后果实感染葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)中的应用。上述应用中，所述防治采后果实感染葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)体现在降低采后果实感染葡萄灰霉病菌发病率和或病斑直径；或所述果实为葡萄。本发明另一个目的是提供一种产品。本发明提供的产品，其活性成分为紫檀芪或紫檀芪溶液；所述产品具有如下1)-8)中至少一种功能：1)抑制荔枝霜疫霉病菌(Peronophythoralitchii)；2)抑制荔枝霜疫霉病菌(Peronophythoralitchii)菌丝生长和/或孢子囊萌发；3)防治荔枝霜疫霉病(Peronophythoralitchii)；4)防治采后果实感染荔枝霜疫霉病菌(Peronophythoralitchii)；5)抑制葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)；6)抑制葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)菌丝生长和/或孢子萌发；7)防治葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)；8)防治采后果实感染葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)。上述中，所述紫檀芪溶液的溶质为紫檀芪，溶剂为由浓度为50.0mmol/L、PH值为7.4的磷酸盐缓冲液和浓度为1.0mol/L、PH值为13的NaOH水溶液按照体积比为9:1混合得到的混合液。通过对葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)和荔枝霜疫霉病菌(Perononphythoralitchii)的体外抑菌活性实验发现紫檀芪对两种病原菌均有显著的抑菌活性，另外通过紫檀芪显著减少采后接种病原菌的葡萄和荔枝果实腐烂实验证实了紫檀芪对葡萄灰霉病和荔枝霜疫霉病的防效，从而实现了本发明的目的。实际使用时，为了使紫檀芪在葡萄或荔枝表面可以很好的粘附，紫檀芪溶液可以添加一些保鲜常用的粘附剂。本发明的实验证明，本发明的紫檀芪物质可用于葡萄和荔枝上两种采后葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)和荔枝霜疫霉病菌(Perononphythoralitchii)病害的防治，既可以单独使用，也可以与其他抗菌剂联合使用，以增强抗菌效果或降低其毒副作用，绿色、安全，有益于人体健康，符合食品安全要求，起到了防治灰霉病和霜疫霉病及对果品的保鲜作用。附图说明图1为紫檀芪对葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)和荔枝霜疫霉病菌(Peronophythoralitchii)菌丝生长的抑制作用。图2为紫檀芪对采后葡萄果实灰霉病的防治效果；A无紫檀芪处理果实并接种病菌；B用100μg/mL紫檀芪处理果实后接种病菌；C用250μg/mL紫檀芪处理果实后接种病菌；D用500μg/mL紫檀芪处理果实后接种病菌；E用1000μg/mL紫檀芪处理果实后接种病菌；F用10000μg/mL紫檀芪处理果实后接种病菌。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、紫檀芪对葡萄灰霉病菌和荔枝霜疫霉病菌的抑菌活性用菌丝生长速率法检测：供试病原菌：葡萄灰霉病菌Botrytiscinerea分离自发病的葡萄果实(RosslenbroichH,StueblerD.Botrytiscinerea-historyofchemicalcontrolandnovelfungicidesforitsmanagement[J].CropProtection.2000,19:557-561)，荔枝霜疫霉病菌Peronophythoralitchii(蔡学清，林娜，陈炜，等.荔枝霜疫霉的生物学特性[J].热带作物学报,2009,30(9):1226-1231)分离自发病的荔枝果实。主要试剂：紫檀芪购自百灵威科技有限公司，纯度＞98％。马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA用于培养葡萄灰霉病菌，胡萝卜榨汁琼脂培养基CA用于培养荔枝霜疫霉病菌。以菌丝生长速率法测定不同浓度紫檀芪对病原菌菌丝生长的抑制作用，具体操作：(1)用磷酸盐缓冲液(PBS；50.0mmol/L,PH7.4，配方：若配制100mL，取80.0mL50.0mmol/LNa2HPO4与20.0mL50.0mmol/LKH2P04混匀即可)：NaOH水溶液(1.0mol/L,PH13)(体积比为9:1)作为溶剂溶解紫檀芪配置成母液；(2)分别准确加入一定量所配制的紫檀芪母液至融化后降至50℃的PDA或CA培养基中混匀，使得培养基中紫檀芪的终浓度分别达到25、50、100和200μg/mL，每个浓度处理设置3个重复，以加入相同体积的溶剂作为对照，以15mL/皿的量倒入直径9cm培养皿；(3)用灭菌打孔器在PDA上已活化培养5d的葡萄灰霉病菌的菌落边缘或CA上已活化培养5d的荔枝霜疫霉病菌的菌落边缘打菌龄一致的菌饼(d＝6mm)，并将菌饼反接入含有上不同浓度紫檀芪的培养基平板中央，置于22℃(葡萄灰霉病菌)或25℃(荔枝霜疫霉病菌)恒温培养箱中培养；(4)定期观察记录实验结果。结果见图1，紫檀芪对葡萄灰霉病菌和荔枝霜疫霉病菌均有显著的抑菌效果，当紫檀芪浓度达到200μg/mL时，对葡萄灰霉病菌和荔枝霜疫霉病菌的抑菌率分别达到57.9％和70.1％。实施例2、紫檀芪对葡萄灰霉病菌和荔枝霜疫霉病菌的抑菌活性孢子萌发法：病原菌孢子/孢子囊悬浮液的制备：分别将葡萄灰霉病菌和荔枝霜疫霉病菌于PDA或CA培养基上培养5d，然后在平板中加入无菌水5mL进行冲洗和振荡，配制孢子/孢子囊悬浮母液。向葡萄灰霉病菌孢子悬浮母液中加入马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)，得到稀释后葡萄灰霉病菌孢子悬浮液；向荔枝霜疫霉病菌孢子囊悬浮液中加入无菌水，得到稀释后荔枝霜疫霉病菌孢子囊悬浮液；稀释病原菌的孢子/孢子囊悬浮液至浓度为105个/mL。孢子萌发法测定的具体操作：(1)用磷酸盐缓冲液(PBS；50.0mmol/L,PH7.4)：NaOH水溶液(1.0mol/L,PH13)(体积比为9:1)作为溶剂溶解紫檀芪配置成母液；(2)分别准确加入一定量配制的紫檀芪母液至稀释后的孢子/孢子囊悬浮液中充分混匀，使得孢子液中紫檀芪的终浓度分别达到10、20、30和40μg/mL，以加入相同体积的溶剂作为对照；(3)将各处理孢子液置于22℃(葡萄灰霉病菌)或25℃(荔枝霜疫霉病菌)的条件下培养；(4)定期观察孢子/孢子囊的萌发情况，每个浓度处理设置3个重复，每个重复计数3个视野区域共约100个孢子/孢子囊，统计孢子/孢子囊的萌发率。试验结果见表1所示：表1紫檀芪对葡萄灰霉病菌孢子和荔枝霜疫霉病菌孢子囊萌发的抑制作用表1结果表明，紫檀芪对葡萄灰霉病菌孢子和荔枝霜疫霉病菌孢子囊萌发的抑制效果明显高于对照组，在10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL和40μg/mL的紫檀芪浓度下对葡萄灰霉病菌孢子萌发的抑制率分别达到20.4％、43.4％、93.3％和100％，对荔枝霜疫霉病菌孢子囊萌发的抑制率达到70.4％、100％、100％和100％，均呈现极强的抑菌活性。实施例3、紫檀芪对采后葡萄灰霉病(B.cinerea)的防效实验供试材料：供试葡萄品种“马奶”，购自市场。将单粒葡萄果实人工分离，留有果蒂，选取大小、形状、成熟度一致的健康果粒于质量百分含量2％的次氯酸钠水溶液中消毒2min，然后用无菌水冲洗2次，晾干后分组处理。具体操作：(1)用无菌接种针在果实赤道位置刺出一个深度2mm，直径为1.5mm的伤口；(2)在每个果实的伤口处分别接入10μL浓度为100、250、500、1000、10000μg/mL的紫檀芪溶液(磷酸盐缓冲液(PBS；50.0mmol/L,PH7.4)：NaOH水溶液(1.0mol/L,PH13)(体积比为9:1)作为溶剂)，每个浓度处理设置3个重复，共接种60颗果实，以接入相同体积的溶剂作为对照；(3)室温放置30min晾干果实后，在每颗果实的伤口处接种10μL浓度为5×104个/mL的葡萄灰霉病菌孢子悬浮液(配制方法同实施例2)；(4)将各浓度处理的果实分别置于塑料保鲜盒中，喷雾保湿，置于22℃贮藏；(5)贮藏6d和9d后，观察并记录果实的发病率及病斑直径。实验结果如表2和图2所示：表2紫檀芪对采后葡萄果实灰霉病的防治效果实验结果表明：紫檀芪对葡萄灰霉病有很好的防效，且随着浓度的升高防效提高。供试浓度为500μg/mL时，贮藏9d后对果实发病率的抑制率达到36.12％，对病斑直径的抑制效果高达51％。当紫檀芪的浓度为10000μg/mL时即能完全抑制葡萄灰霉病的发生。实施例4、紫檀芪对荔枝采后霜疫霉病(P.litchii)的活体防效实验供试材料：供试荔枝品种“淮枝”，采自广东省从化市，采后即时运回实验室进行处理。剪取果实并保留果蒂，选取大小、成熟度一致的健康果实进行实验。具体操作：(1)用2％的次氯酸钠溶液对荔枝果实进行表面消毒2min，用无菌水冲洗2次，晾干后分组处理；(2)将荔枝果实分别浸泡于200、400、800和1600μg/mL的紫檀芪溶液中，处理10min后取出室温自然晾干，每个浓度处理设置3个重复，共接种60颗果实，以相同体积的溶剂处理果实作为对照；(3)在荔枝果皮的赤道位置接种10μL浓度为2×104个/mL的霜疫霉孢子囊悬浮液(配制方法同实施例2)；(4)将果实分别放入保鲜盒中喷雾保湿，置于25℃下培养；(5)观察并记录果实的病情指数和褐变指数。果实发病等级计算的标准为：0无明显感染；1感染面积为果实的≤5％；3感染面积为果实的6％-15％；5感染面积为果实的16％-25％；7感染面积为果实的26％-49％；9感染面积为果实的≥50％。病情指数＝Σ(发病等级×相应果实数量)/(9×果实总数量)×100。果实褐变等级计算的标准为：1无褐变；2轻微褐变；3褐变面积为果实的＜1/4；4褐变面积为果实的1/4–1/2；5感染面积为果实的＞1/2。褐变指数＝Σ(发病等级×相应果实数量)/果实总数量。实验结果如表3所示：表3紫檀芪对荔枝采后霜疫霉病的防治效果紫檀芪浓度(μg/mL)病情指数褐变指数对照64.263.1220055.562.7540042.222.6080033.332.53160028.152.20实验结果表明：紫檀芪对荔枝霜疫霉病有较好的防效，且随着紫檀芪浓度的升高防效提升。贮藏6d后，对照处理的果实整体病情指数高达64.26，紫檀芪浓度为200、400、800和1600μg/mL时，对荔枝果实发病的防效分别达到13.54％、34.30％、48.13％和56.19％。另外，紫檀芪能够减缓果皮的褐变，延长果实的保鲜，提高其品质(以上材料方法中已列举出褐变等级的划分，理论上若降低了荔枝果皮的褐变，则一定程度上提高了果实的保鲜和品质)。当前第1页1 2 3