油酸在促进动物乳腺发育方面的应用的制作方法

本发明属于动物繁殖发育技术领域，具体涉及一种长链单不饱和脂肪酸—油酸促进动物乳腺上皮细胞增殖、乳腺发育及其在动物乳腺发育中的应用。

背景技术：

乳腺器官具有分泌乳汁的功能，可为子代新生儿的生长、发育和健康提供充足的营养物质。在生产中，母猪过肥，乳房内发生脂肪浸润，从而影响乳腺发育，对其后期泌乳功能也会造成不良影响，同时母猪产奶量不足会导致仔猪生长缓慢，甚至引起死亡。研究发现，母猪在哺乳期补充膳食脂质具有改善乳脂分泌的作用，但是对乳腺发育结构和功能的研究较少。因此，研究乳腺发育及其调控对于提高动物泌乳性能及其后代生长发育具有重要意义。

出生后动物乳腺的发育包括青春期（初情期）、妊娠期、哺乳期和退化期等不同的阶段，初情期是乳腺导管和终末乳芽（terminalendbuds,teb）发育的重要时期，teb在妊娠期发育成腺泡是评价乳腺发育的重要指标。乳腺发育受到生长激素、雌激素和类胰岛素增长因子-1（insulin-likegrowthfactorgene1,igf-1）等多种激素的调节，而营养也可通过影响激素水平进而调控乳腺发育。如高脂日粮抑制初情期小鼠乳腺发育，但其内在机制尚不清楚。此外，目前有关单一脂肪酸对小鼠初情期乳腺发育的影响的报道也很少。

油酸（oleicacid,oa）是18碳-9-烯酸的长链单不饱和脂肪酸，是橄榄油的主要脂肪酸（约占70～80%），其被认为是营养价值较高的脂肪酸。研究报道表明油酸对免疫调节、治疗和预防不同类型的疾病，如心血管或自身免疫性疾病、代谢紊乱、皮肤损伤和乳腺癌有积极的作用。研究报道，母猪妊娠后2个月（妊娠早期）的日粮中添加橄榄油，母猪妊娠56d时橄榄油组母猪血浆中油酸（oa）和花生四烯酸（arachidonicacid,aa）的比例升高，同时母猪的初乳以及第3d、第21d的乳汁和血浆中的二十二碳六烯酸（docosahexaenoicacid,dha）含量升高。综合看来，目前的研究均显示，油酸对于养猪业中存在的猪乳成分的改善这一问题具有很好的积极意义。

但是，目前有关油酸对乳腺发育的结构和功能问题，特别是乳腺初情期的发育方面的研究尚属空白，无相关技术报道，影响了油酸的进一步推广应用。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有动物乳腺发育结构和功能的研究不足以及油酸的应用不足，提供油酸在促进动物乳腺发育中的应用，拓宽油酸的应用范围的同时，使动物乳腺的发育性能显著提高，为油酸在促进乳腺发育方面的应用提供有力的技术理论基础。

本发明的第二个目的是提供油酸在作为或制备促进动物乳腺发育的饲料添加剂，或在制备促进动物乳腺发育的饲料方面的应用。

办发明的第三个目的是提供一种促进动物乳腺发育的制品。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明提供了油酸在促进动物乳腺发育方面的应用。

本发明还提供了油酸在作为或制备促进动物乳腺发育的饲料添加剂，或在制备促进动物乳腺发育的饲料方面的应用。

优选地，所述应用为将油酸作为促进乳腺发育的活性成分添加于动物饲料、食品或药品中，所述动物饲料、食品或药品中油酸的添加量为质量比0.5%～5.0%。

本发明利用细胞mtt测试、edu荧光检测表明油酸显著促进动物乳腺上皮细胞增殖，检测p21以及cyclind1表达量，表明油酸能够通过调控增殖相关蛋白表达促进乳腺上皮细胞的增殖；通过westernblot方法检测油酸对乳腺上皮细胞信号通路pi3k/akt以及相关周期蛋白的调控作用，并通过wholemount染色分析油酸对初情期小鼠乳腺发育的影响，初步探讨油酸对动物乳腺上皮细胞增殖与乳腺发育的调控机理。本发明为油酸在促进乳腺发育方面的应用提供了技术理论基础，为提高动物的繁殖性能提供参考。

优选地，所述促进动物乳腺发育是指促进乳腺上皮细胞增殖、提高乳腺导管分支和/或提高乳腺终末乳芽数量。

优选地，将所述油酸应用于促进动物乳腺上皮细胞增殖和/或促进p-pi3k、p-akt、cyclind1蛋白表达、抑制p21蛋白表达方面。

优选地，应用对象为雌鼠、母猪或奶牛。

本发明还提供了一种促进动物乳腺发育的制品，所述制品中含有油酸。

优选地，所述制品为饲料、食品或药品。

优选地，所述油酸的质量百分含量为0.5%～5.0%。

更优选地，所述油酸的质量百分含量为2.0%。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过动物饲养试验证明，在动物饲料中添加少量的油酸能显著提高初情期小鼠乳腺导管分支和终末乳芽的数量，另通过细胞培养试验证明，适当浓度的油酸能显著促进动物乳腺上皮细胞增殖，显著提高hc11细胞处于细胞分裂期中的s期的比例，极显著提高p-pi3k、p-akt、cyclind1蛋白的表达，抑制p21蛋白的表达，使动物乳腺的发育性能显著提高。

本发明明确了不同浓度的油酸对乳腺发育的影响，提示油酸通过激活pi3k/akt信号通路促进增殖相关蛋白的表达，最终促进乳腺发育，为油酸在促进乳腺发育方面的应用提供有力的技术理论基础，为提高动物的育种工作提供参考。

本发明所述的油酸作为营养调控物质，添加量少，可以直接加入动物饲料、食品或药品中，发挥的生理活性高，安全、有效、不会引起毒副作用，在促进动物乳腺发育方面具有良好的推广应用前景。

附图说明

图1是不同浓度油酸对猪原代乳腺上皮细胞增殖表型的影响。

图2是不同浓度油酸对小鼠乳腺上皮细胞hc11增殖表型的影响；其中，图b和图c是edu检测100μm油酸对hc11细胞增殖的影响。

图3是100μm油酸对hc11细胞增殖相关蛋白表达量的影响。

图4是100μm油酸对hc11细胞内pi3k/akt信号通路的影响。

图5是日粮中添加2%油酸对初情期小鼠乳腺导管分支和teb数量的影响。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1油酸促进猪原代乳腺上皮细胞增殖

1、为研究油酸（oa）对乳腺上皮细胞增殖的影响，试验首先以猪原代乳腺上皮细胞为研究对象：

（1）采用含有10%胎牛血清的dmem-f12培养基培养猪原代乳腺上皮细胞；

（2）分别用油酸（5、10、20、50、100μm）处理猪原代乳腺上皮细胞；其中，不同浓度油酸的溶剂为无水乙醇。

（3）收集细胞，利用mtt检测细胞增殖表型。

2、结果如附图1所示。结果表明，5～100μm的油酸均可显著（p<0.05）促进猪乳腺上皮细胞的增殖。

实施例2油酸促进小鼠乳腺上皮细胞增殖

1、为进一步研究油酸（oa）对乳腺上皮细胞增殖的影响，试验以乳腺上皮细胞hc11为研究对象，采用含有10%胎牛血清的rpmi-1640培养基培养hc11细胞。用不同浓度的油酸（12.5、25、50、100、200μm），处理上述hc11细胞。

（1）采用mtt检测方法，测定油酸对乳腺上皮细胞增殖的影响。

结果如附图2a所示。结果表明油酸以剂量依赖性促进hc11细胞增殖，在100μm和200μm时促进细胞增殖的效果最佳。

（2）使用100μm油酸处理hc11细胞4天，利用edu检测hc11细胞在s期的细胞的比例。

结果如附图2b、2c所示。结果表明100μm油酸极显著促进hc11细胞处于细胞分裂期中的s期的比例，最终促进乳腺上皮细胞增殖。

2、为研究油酸（oa）对乳腺上皮细胞hc11增殖相关蛋白表达的影响，hc11细胞被接种在1块经多聚赖氨酸包被过的6孔板中，分为2个组（对照组和1个处理组），经100μm油酸对hc11细胞进行处理4天。测定100μm油酸对乳腺上皮细胞cyclind1及p21蛋白表达量的影响。

（1）结果如附图3所示。结果表明100μm油酸处理hc11细胞4天，可极显著（p<0.01）促进hc11细胞cyclind1蛋白的荧光强度及极显著（p<0.01）抑制p21蛋白的荧光强度，说明100μm油酸能够通过调控增殖相关蛋白表达来促进乳腺上皮细胞的增殖。

3、为研究油酸对乳腺上皮细胞hc11信号通路pi3k/akt的影响，将细胞接种于六孔板，分为4组，分别为对照组、100μm油酸处理组、100nmwortmannin（wt，pi3k阻断剂）组、100μm油酸和100nmwt共处理组，处理hc11细胞4天。westernblot检测四个不同组别中100μm油酸对小鼠乳腺上皮细胞p-pi3k、p-akt、cyclind1及p21蛋白表达量的影响。

（1）结果如附图4a所示。结果表明100nmwt逆转了100μm油酸促进hc11细胞增殖的作用。

（2）结果如附图4b、4c所示。结果表明100μm油酸极显著（p<0.01）促进p-pi3k、p-akt、cyclind1蛋白的表达，且极显著（p<0.01）抑制p21蛋白的表达；100nmwt逆转了100μm油酸对信号通路蛋白和增殖相关蛋白表达的作用。

实施例3日粮中添加2%油酸对初情期小鼠乳腺发育的影响

1、实验方法

（1）动物饲养条件：1只/箱，单养；饲养温度与湿度：20～26℃，40～70%；采用12h:12h昼夜间断照明；饲养室条件始终保持稳定，以保证试验结果的可靠性。自由进食饮水，饲料和饮用水均由广东省医学实验动物中心提供；检疫：对购入spf级c57bl/6j小鼠预饲7d。期间每日检查动物一次。

（2）动物分组及处理：将4周龄大的小鼠随机分为正常对照组、油酸组、每组10只，共2组。正常对照组小鼠饲喂正常日粮，油酸组小鼠饲喂普通日粮添加2%的油酸日粮，小鼠饲喂5周后采样。

（3）组织样品的采集：试验结束当天，颈椎脱臼处死小鼠，摘取5只小鼠乳腺左侧组织平铺于载玻片上，以便进行下一步的wholemount染色，分析油酸对小鼠乳腺发育的影响。

2、结果如附图5所示。日粮中添加2%油酸可以极显著（p<0.01）促进乳腺导管分支和teb的数量。结果提示，油酸可通过增加乳腺导管分支和teb数量，促进乳腺发育。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。