本发明涉及天然黄酮提取技术领域，具体的涉及一种五桠果中黄酮色素的提取工艺。
背景技术：
食用黄酮作为一种重要的食品添加剂，在食品工业中应用十分广泛。食用黄酮主要分为天然黄酮与人工合成黄酮，天然黄酮主要来源于动物、微生物和植物；人工合成黄酮是指用化学合成方法制得的黄酮[diacu.e.colors:propertiesanddeterminationofsyntheticpigments[j].encyclopediaoffoodandhealth,2016,9(1):284-290；刘梅森,何唯平.食用色素特性及发展趋势[j].中国食品添加剂,2003,(04):67-70.]。人工合成黄酮稳定性较好，但可能具有潜在毒性；天然食用黄酮色调更接近天然物的颜色，同时具有一定的营养作用，但其稳定性较差，限制了天然黄酮的应用。因此研究天然食用黄酮资源的开发利用意义重大。
五桠果(dilleniaindicalinn)是五桠果科五桠果属常绿乔木，又名第伦桃、桠果木，主要分布于云南省南部。也见于印度、斯里兰卡及印度尼西亚等地。该属具有较多的化学成分和药理作用[李霞,崔承彬.五桠果属植物化学成分与药理活性研究进展[j].国际药学研究杂志,2008,(05):325-329+348]。目前关于五桠果黄酮的提取研究未见报道。
目前关于五桠果的研究较少，部分只对五桠果中的主要化学成分进行粗略研究，并未研究其提取工艺优化以及抗氧化性。因此，本发明通过研究五桠果中黄酮的提取优化及体外抗氧化活性，为五桠果的开发利用提供理论依据。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种五桠果中黄酮色素的提取工艺，对五桠果中黄酮色素初步定性确定提取溶剂和最大吸收波长，五桠果中黄酮色素初步定性为槲皮素类黄酮，以单因素实验为基础，采用响应面试验设计，对五桠果中黄酮的提取工艺进行优化，并进行体外抗氧化活性测定；为五桠果中黄酮色素的提取优化提供了科学依据，也为五桠果的开发利用提供了新思路。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：
一种五桠果中黄酮色素的提取工艺，包括以下步骤：
1)五桠果原材料的预处理；
2)黄酮色素初步定性确定最佳浸提溶剂和最大吸收波长；
3)单因素实验确定提取时间、提取温度、液料比和提取次数对色素提取率的影响；
4)响应面试验设计；
五桠果中黄酮色素初步定性为槲皮素类黄酮，五桠果中黄酮色素最佳提取工艺为：提取溶剂80％乙醇，提取时间39min，提取温度67℃，液料比16.4:1(ml/g)，提取次数2次。
优选的，所述步骤4)通过单因素实验，采用box-behnken中心组合实验设计实验方法，如下：以x1(温度)、x2(时间)、x3(料液比)为自变量，以黄酮化合物的吸光度为响应值，设3因5水平响应面分析实验，实验数据使用design-expert7.0软件进行分析。
本发明还提出一种由上述工艺提取的五桠果中黄酮色素的体外抗氧化活性的测定，包括以下步骤：1)黄酮色素提取溶液的制备；2)dpph自由基清除能力测定；3)铁离子还原/抗氧化能力测定(frap)；4)总抗氧化能力测定(teac)；5)还原能力测定；6)过氧化氢(h2o2)清除活性测定。
本发明的有益效果为：本发明对五桠果中黄酮色素初步定性确定提取溶剂和最大吸收波长，五桠果中黄酮色素初步定性为槲皮素类黄酮，以单因素实验为基础，采用响应面试验设计，对五桠果中黄酮的提取工艺进行优化，并进行体外抗氧化活性测定；五桠果中黄酮色素最佳提取工艺为：提取溶剂80％乙醇，提取时间39min，提取温度67℃，液料比16.4:1(ml/g)，提取次数2次；该黄酮具有抗氧化活性；本发明为五桠果中黄酮色素的提取优化提供了科学依据，为天然黄酮提取提出新的思路，也为五桠果的开发利用提供了新思路。
附图说明
图1为本发明实施例所述五桠果黄酮色素在各溶剂中的吸收波长示意图；
图2为本发明实施例所述提取时间对黄酮色素提取效果的影响曲线图；
图3为本发明实施例所述提取温度对黄酮色素提取效果的影响曲线图；
图4为本发明实施例所述液料比对黄酮色素提取效果的影响曲线图；
图5为本发明实施例所述提取次数对黄酮色素提取效果的影响曲线图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种五桠果中黄酮色素的提取工艺，包括以下步骤：
1、五桠果原材料的预处理
采摘自云南省红河州绿春县的五桠果，将五桠果果实带皮磨碎后，密封放入-18℃冰箱备用。
2、黄酮色素初步定性确定最佳浸提溶剂和最大吸收波长
准确称量5份样品，每份1g，置于烧杯中，分别加入10ml配好60％乙醇、80％乙醇、蒸馏水、无水乙醇、石油醚。振荡，过滤，分别用不同的提取溶剂定容于50ml容量瓶中，在200nm-1000nm范围内测定吸光度，确定其最大吸收波长；
通过图1可知，五桠果中的黄酮在石油醚中不溶，在蒸馏水中微溶，在乙醇溶剂中较易溶解。而且乙醇溶剂提取的黄酮溶液的吸光度大，说明该黄酮是水溶性黄酮色素，用80％的乙醇提取的吸光度最大，故选80％乙醇作为最佳提取溶剂。同时可以看出，在349nm处出现波峰，故黄酮的最大吸收波长为349nm。通过查阅文献，将此类黄酮定性为槲皮素类黄酮。
3、单因素实验确定提取时间、提取温度、液料比和提取次数对色素提取率的影响
时间对黄酮提取效果的影响
准确称量5份样品，每份1g，以最佳提取溶剂，料液比为1:10(g:ml)，在室温下分别提取10、20、30、40、50min，提取次数为2次，定容于50ml容量瓶中，在最大吸收波长测定吸光度，将实验结果绘制成曲线图；
如图2所示：提取时间不断的增加，黄酮溶液的吸光度表现出先升高然后下降的趋势。并且峰值在30min时出现，吸光度为0.570，说明时间对黄酮提取效果影响较大。当提取时间达到30min时，可将大部分黄酮提取完毕，吸光度达到最高值。当时间超过30min后，黄酮含量几乎不再变化，但是光线、氧气等可能对黄酮具有降解作用，导致吸光度降低。所以选择提取时间为30min。
温度对黄酮提取效果的影响
准确称量5份样品，每份1g，置于烧杯中，加入10ml最佳提取溶剂，分别在20、30、40、50、60、70、80℃下进行提取，时间为20min，次数为1次，然后定容至50ml容量瓶中，于最大吸收波长处测定吸光度，将实验结果绘制成曲线图；
如图3所示，随着提取温度升高，五桠果黄酮溶液的吸光度呈现先升高后下降的趋势。在50℃时达到最大，吸光度为0.551，说明温度对黄酮提取效果影响也很大。温度增加，会提高黄酮分子的扩散速度和溶出速率，增加提取效率。但温度过高可能会使黄酮降解，导致吸光度下降，所以将50℃选取为提取温度。
液料比对黄酮提取效果的影响
准确称量5份样品，每份1g，置于烧杯中，温度为室温，次数为1次，然后分别加入5，10，15，20，25ml的最佳提取溶剂，在室温下提取20min，然后定容至50ml容量瓶，于最大吸收波长测定吸光度，将实验结果绘制成曲线图；
如图4所示，随液料比值的增加，黄酮溶液的吸光值逐渐增大，液料比大于20:1(ml/g)后，吸光度增加减缓。适当提高液料比，可增大黄酮的提取率。但是液料比变大，会提高溶剂用量和回收难度。从节约试剂、保护环境和浓缩工程等方面考虑，选择20:1(ml/g)的液料比是较优的。
次数对黄酮提取效果的影响
准确称量5份样品，每份1g，加10ml最佳提取溶剂，提取时间为20min/次，在室温下分别提取1、2、3、4、5次，定容在50ml容量瓶中，于最大吸收波长处测定吸光度，将实验结果绘制成曲线图；
如图5所示，提取次数增多，黄酮溶液吸光值也不断增大。增加提取次数会提高黄酮的溶出数量，当达到一定次数后，黄酮基本溶出完全，同时提取次数过多，会导致溶剂用量增加和浪费时间。当提取2次后，吸光度增加不再明显。从降低成本和节约时间等方面考虑，选择提取次数2次为宜。
4、响应面试验设计
通过单因素实验，采用box-behnken中心组合实验设计实验方法，如下：以x1(提取温度)、x2(料液比)、x3(提取时间)为自变量，以黄酮化合物的吸光度为响应值，设计3因素5水平响应面实验。结果如下表：
表2因素水平表
表3响应面试验设计方案及结果
用designexpert软件对表3数据进行分析，得到回归模型：
y＝0.656605+0.116368x1+0.062699x2+0.003362x3-0.04099x12-0.01465x22+0.045096x32-0.00325x1x2-0.04275x1x3-0.00275x2x3.
表4方差分析表
根据表4可知，拟合检验p＝0.0026<0.01，达到显著水平，失拟检验p＝0.5423>0.05，表现出不显著水平，说明方程与真实情况拟合较好，能够预测黄酮色素提取效果与时间、液料比和温度的关系。
design-expert7.0软件分析，从方差分析结果可以看出，模型的f＝7.08且prob>f<0.05,表明该模型是显著的。黄酮化合物最适提取条件为：提取温度67℃、提取时间39min、液料比16.4:1，其理论吸光度为0.8161。经过三次验证实验，在该提取条件下，五桠果果实中黄酮化合物的实际吸光度为0.8251，与预测值基本符合。
通过本实施例可知：五桠果中黄酮色素初步定性为槲皮素类黄酮，五桠果中黄酮色素最佳提取工艺为：提取溶剂80％乙醇，提取时间39min，提取温度67℃，液料比16.4:1(ml/g)，提取次数2次。
实施例2
由实施例1所述工艺提取的五桠果中黄酮色素的体外抗氧化活性的测定，包括以下步骤：
1、黄酮提取溶液的制备
准确称取1g鲜五桠果，在最优条件下进行黄酮色素提取，然后定容于50ml容量瓶备用。
2、dpph自由基清除能力测定
吸取1ml黄酮色素溶液与4mldpph甲醇溶液混合，涡旋振摇后，室温下暗处放置10min，于517nm进行比色测定，并根据标准曲线计算dpph自由基的清除能力。利用阿魏酸绘制标准曲线，标准方程为y＝0.9406x+28.698(r2＝0.969)
自由基清除能力(％)＝[(a0-a1)/a0]×100
a0为对照吸光度
a1为样品吸光度
每g鲜五桠果中，黄酮色素自由基清除能力表示为阿魏酸当量(μgferulicacidequivalents/g)。
结果：dpph自由基清除能力为826143.44μgfae/g。
3、铁离子还原/抗氧化能力测定(frap)
frap溶液制备：准确吸取10ml乙酸溶液(300mmol/l，ph3.6)、1mlfecl3·6h2o(20mmol/l)和1mltptz溶液(10mmol/l)，充分混匀，制备成frap溶液。
将100μl黄酮色素溶液和3mlfrap溶液，混匀后在37℃下放置4min，在593nm处测定吸光度，并计算frap自由基的清除能力。利用硫酸亚铁绘制标准曲线，标准方程为y＝6.24x+0.0005(r2＝
0.9984)
自由基清除能力(％)＝[(a0-a1)/a0]×100
a0为对照吸光度
a1为样品吸光度
每g鲜五桠果中，黄酮色素铁离子还原/抗氧化能力表示为fe2+当量(mmolfe2+equivalents/g)。
结果：铁离子还原/抗氧化能力为1183.50mmolfe/g。
4、总抗氧化能力测定(teac)
abts·+工作液制备：将abts(17mmol/l)与过硫酸钾(2.45mmol/l)两种溶液按1:1混合。
吸取50μl黄酮色素溶液，添加3.8ml稀释后的abts+·工作液，室温下放置6min，于734nm测定吸光度，并根据标准曲线计算teac自由基的清除能力。利用trolox绘制标准曲线，标准方程为y＝0.0538x-0.0335(r2＝0.9997)。
自由基清除能力(％)＝[(a0-a1)/a0]×100
a0为对照吸光度
a1为样品的吸光度
每g鲜五桠果中，黄酮色素自由基清除能力表示为trolox当量(μgtroloxequivalents/g)。
结果：abts·+自由基清除能力为605337.17μgte/g。
5、还原能力测定
吸取1ml黄酮色素溶液，分别加入铁氰化钾溶液(1％，w/v)2.5ml、磷酸盐(0.2mol/l，ph6.6)2.5ml，混合物于50℃下反应20min，加入10％tca溶液2.5ml，在4000g离心10min；取出上清液并加入fecl3溶液(0.1％(w/v))和蒸馏水，在700nm处测吸光度，并根据标准曲线计算其还原能力。利用抗坏血酸绘制标准曲线，标准方程为y＝0.0455x+0.115(r2＝0.9916)。
自由基清除能力(％)＝[(a0-a1)/a0]×100
a0为对照吸光度
a1为样品吸光度
每g鲜五桠果中，黄酮色素还原能力表示为抗坏血酸当量(μgascorbicacidequivalents/g)。
结果：还原能力为635.83μgaae/g
6、过氧化氢(h2o2)清除活性测定
取0.6ml黄酮色素溶液，分别加入0.9mlh2o2(40mmol/l)溶液和1.5ml磷酸钠缓冲溶液(45mmol/l，ph7.4)，30℃暗处反应40min，于230nm测定吸光度，并根据标准曲线计算h2o2清除能力。利用阿魏酸绘制标准曲线，标准方程为y＝0.6571x-11.119(r2＝0.99431)。
自由基清除能力(％)＝[(a0-a1)/a0]×100
a0为对照吸光度
a1为样品的吸光度
每g鲜五桠果中，黄酮色素自由基清除能力表示为阿魏酸当量(μgferulicacidequivalents/g)。
结果：h2o2清除能力为226795.58μgfae/g。
dpph自由基清除能力为826143.44±357.15μgfae/g，铁离子还原/抗氧化能力为1183.50±57.61μmolfe/g，还原能力为635.83±76.22μgaae/g，h2o2清除能力为226795.58±394.73μgfae/g，abts·+自由基清除能力为605337.17±551.91μgte/g。
表5色素的抗氧化能力测定
本发明对五桠果中黄酮色素初步定性确定提取溶剂和最大吸收波长，五桠果中黄酮色素初步定性为槲皮素类黄酮，以单因素实验为基础，采用响应面试验设计，对五桠果中黄酮的提取工艺进行优化，并进行体外抗氧化活性测定；五桠果中黄酮色素最佳提取工艺为：提取溶剂80％乙醇，提取时间39min，提取温度67℃，液料比16.4:1(ml/g)，提取次数2次；该黄酮具有抗氧化活性；本发明为五桠果中黄酮色素的提取优化提供了科学依据，为天然黄酮提取提出新的思路，也为五桠果的开发利用提供了新思路。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。