油菜籽蛋白质分离物、包含所述分离物的食品以及作为发泡剂或乳化剂的用途的制作方法

本发明涉及可溶性天然油菜籽(rapeseed)蛋白质分离物和所述可溶性天然油菜籽蛋白质分离物在食品中的用途。

背景技术：

蛋白质是人类营养的主要特征。其可源自动物(例如肉、鱼、蛋、乳制品)或植物。一般期望减少基于动物的蛋白质的量。

卵蛋白的使用通常是不期望的。例如，由于蛋过敏问题、与蛋中胆固醇水平相关的医疗问题、宗教限制/信仰、烹饪偏好(例如素食者或纯素饮食)、蛋价格成本波动、禽类生产中抗生素和激素的使用以及与禽类相关的疾病(例如禽流感)，可期望使用替代性蛋白质。

在人类营养中使用基于植物的蛋白质是已知的，例如wo2008/094434公开了在组合物中使用小麦蛋白质分离物作为使用蛋黄蛋白的替代方案。然而，对于那些对麸质过敏的来说，使用小麦蛋白质分离物可能不是期望的。例如在wo2014/018922中也描述了使用基于大豆的蛋白代替乳清蛋白。大豆蛋白被广泛使用，但考虑到对大豆制品的某些不耐受性，需要寻找植物蛋白的其它来源。

合适的替代物包括豌豆蛋白和油菜籽蛋白质。油菜籽种子富含油且含有相当大量的蛋白质，蛋白质占种子干重的17-25％。加工油菜籽以获得供人类消费的油产生油菜籽粗粉(meal)(60％)作为副产物，其含有约30％至40％的蛋白质。用于此目的的油菜籽通常属于brassicanapus和brassicajuncea品种。这些品种仅含低水平的芥酸和硫代葡萄糖苷，也被称为加拿大油菜籽(canola)。加拿大油菜籽是加拿大和“ola”(“油低酸(oillowacid)”)的缩写，但现在是一个通用术语，其被定义为含有<2％芥酸和<30mmol/g硫代葡萄糖苷的油菜籽油。所产生的油菜籽粗粉目前被用作高蛋白动物饲料。

蛋白质可以以水解物、浓缩物和分离物的形式获得。水解物是通过将蛋白质暴露于热、酸或断开连接氨基酸的键的酶而部分分解了的蛋白质。这使得其味更苦，但也使其在消化过程中比天然(非水解的)蛋白质更快地被吸收。分离物比浓缩物更纯，这意味着其他非蛋白质组分已被部分去除以“分离”蛋白质。许多浓缩物为约80％蛋白质，这意味着：以干基计，总重量的80％是蛋白质。分离物通常为约90％蛋白质(干基)。这是使用kjeldahl方法计算的。

在油菜籽中发现的主要储藏蛋白是十字花科植物素(cruciferins)和芸苔籽蛋白(napins)。十字花科植物素是球蛋白，是种子中的主要储藏蛋白。十字花科植物素由6个亚基构成，总分子量为约300kda。芸苔籽蛋白是白蛋白，是分子量为约14kda的低分子量储藏蛋白。芸苔籽蛋白更容易溶解，例如ep1715752b1中公开了一种方法，以分离出可溶性较强的芸苔籽蛋白级分，优选达到至少85重量％。芸苔籽蛋白被主要建议用于溶解度很关键的应用中。de102014005466a1也描述了获得经纯化的十字花科植物素和芸苔籽蛋白级分的方法。在该方法中，还获得了具有55-60％芸苔籽蛋白和40-45％十字花科植物素两者的蛋白质混合物。该蛋白质混合物的溶解度为约75％。

根据以斯韦柏单位(s)计的相应沉降系数，油菜籽蛋白质也可以被分成多种级分。该系数表示大分子在离心场中的沉降速度。对于油菜籽蛋白质而言，主要报道的级分是：12s、7s和2s。十字花科植物素和芸苔籽蛋白是加拿大油菜籽/油菜籽中发现的两种主要的贮藏蛋白家族。芸苔籽蛋白是2s白蛋白，而十字花科植物素是12s球蛋白。此外，schwenke和linow(nahrung(1982)26,k5-k6)指出：来自油菜籽(brassicanapusl.)的12s球蛋白的可逆解离取决于离子强度。十字花科植物素复合物在暴露于较高离子强度(μ≥0.5ms/cm)时以300kda12s六聚体的形式存在，在暴露于低离子强度条件时可逆地解离成150kda的7s三聚体分子。

已经发现，高纯度油菜籽蛋白质分离物在食品中具有基础广泛的功能，在蛋白质性材料中是独特的。在食品中使用源自植物的蛋白质的能力使得能够在没有任何可用替代物时使用蛋清和/或动物来源蛋白质的情况下提供真正的素食食品。

油菜籽蛋白质分离物可用于蛋白质分离物的常规应用，例如加工食品的蛋白质强化、油的乳化、烘焙食品中的体形成剂(bodyformers)和截留气体的产品中的发泡剂。油菜籽蛋白质分离物还具有等电沉淀物和源材料未展示出的功能。油菜籽蛋白质分离物具有某些功能，包括能够形成蛋白质纤维和能够用作其中使用动物蛋白质或其它植物蛋白质的食品中的蛋白质替代品或增量剂。如本文所述，本文提供的油菜籽蛋白质分离物具有另外的功能。

ep1389921b1公开了一种形成食品组合物的方法，该方法包括在至少5℃的温度下用水性食品级盐溶液提取油菜籽含油种子粗粉以使蛋白质在油菜籽含油种子粗粉中溶解并形成蛋白质含量为5-30g/l、ph值为5-6.8的水性蛋白质溶液，随后通过胶团(micelles)分离出两种蛋白质级分。这么做是为了提高溶解度，因为12s级分通常被认为在不存在盐的情况下在宽ph范围内难以溶解。将所得蛋白质分离物掺入所述食物组合物中以代替蛋清、乳蛋白、全蛋、肉纤维或明胶。

wo2013/000066公开了油菜籽蛋白质产物，其具有至少约60重量％的蛋白质含量，低植酸含量，优选等份的2s和7s，伴随低含量的12s。

ep1720415公开了制备用于水产养殖饲料组合物的油菜籽蛋白质分离物的方法，所述油菜籽蛋白质分离物包含25-55重量％的2s油菜籽蛋白质、47-75重量％的7s油菜籽蛋白质和0-15重量％的12s油菜籽蛋白质。该方法需要使用高水平的盐，这在水产养殖中不是问题，但不适合人类营养。

我们发现：在我们的方法中，不需要分离出蛋白质成分，但仍能够在较广泛的ph范围内保持溶解度。

已发现：从冷压含油种子粗粉在温和条件下提取获得的包含十字花科植物素和芸苔籽蛋白二者的可溶性天然油菜籽蛋白质分离物的使用在用于完全或部分替代其它蛋白质时产生了出乎意料好的结果。

附图说明

图1示出了应用于来自不同批次的油菜籽蛋白质分离物的蓝色非变性page凝胶。将凝胶用simplyblue染色并用spotcutter扫描。

发明详述

在本发明的第一方面，提供了一种天然油菜籽蛋白质分离物，其包含40-65％的十字花科植物素和35-60％的芸苔籽蛋白，当在3-10的ph范围内在23±2℃的温度下测量时，其溶解度为至少88％；其中所述天然油菜籽蛋白质分离物包含5％-65％(基于干物质)的12s油菜籽蛋白质，其中通过蓝色非变性page验证12s的存在。优选地，天然油菜籽蛋白质分离物包含10％-65％、最优选15％-65％、特别地25％-65％、最特别地35％-65％(基于干物质)的12s油菜籽蛋白质，其中通过非变性page来验证12s的存在。如上所述，12s蛋白的某含量不一定与十字花科植物素相同，因为十字花科植物素300kda12s六聚体可解离成150kda的7s三聚体分子。

在一个实施方式中，当在3-10的ph范围内在23±2℃的温度下测量时，天然油菜籽蛋白质分离物的溶解度为至少88％、优选至少90％、更优选至少94％、最优选至少96％。这又称为可溶性固体指数(ssi)。

为了用于人类食物消费，天然油菜籽蛋白质分离物优选包含低水平的盐。这可通过测量电导率来确定。优选地，天然油菜籽蛋白质分离物在2-12的ph范围内在2重量％水溶液中的电导率小于9000μs/cm。更优选地，天然油菜籽蛋白质分离物在2.5-11.5的ph范围内在2重量％水溶液中的电导率小于4000μs/cm。为了比较，5g/l氯化钠水溶液的电导率为约9400μs/cm。

在另一个实施方式中，天然油菜籽蛋白质分离物的植酸盐(phytate)水平低于0.4重量％、更优选低于0.3重量％、最优选低于0.15重量％。

在另一个实施方式中，基于干重计，天然油菜籽蛋白质分离物的蛋白质含量为至少90重量％(以kjeldahlnx6.25计算)、更优选地至少94重量％、最优选地至少96重量％、特别地至少98重量％。

优选地，天然油菜籽蛋白质分离物是基本上未水解的。基本上未水解的是指未有意水解蛋白质。

优选地，所述油菜籽蛋白质分离物是在包括以下步骤的方法中获得的：

i)将冷压油菜籽油粗粉与水性液体在45-65℃的温度下混合；

ii)从步骤i)获得的混合物中分离水性液体；

iii)将步骤ii)获得的水性液体脱脂(decreaming)；

iv)通过加入酸或碱将步骤iii)中获得的脱脂水性液体的ph调节至中性，并与沉淀剂混合以获得沉淀物；

v)除去步骤iv)中获得的沉淀物以获得水性液体；

vi)浓缩并洗涤步骤v)中获得的水性液体；

vii)通过干燥的方式从步骤vi)中获得的经浓缩和洗涤的水性液体中分离天然油菜籽蛋白质分离物。

如上所述，由冷压油菜籽压榨粗粉(油菜籽油生产的副产物)产生油菜籽蛋白质分离物。

该方法从提取步骤i)开始，其中将油菜籽粗粉与水性盐溶液(例如0-5％氯化钠)在4-75℃、更优选20-75℃、最优选45-65℃的温度下组合。优选地，在步骤i)中，进行所述混合使得所述冷压油菜籽油粗粉与所述水性液体之间的比值为1:2至1:30(w/w)。优选地，粗粉与水的比值为1:5至1:40、更优选1:5至1:20。

在5分钟至2小时的时间段之后，在分离步骤ii)中将富含蛋白质的溶液与不溶性物质分离。富含蛋白质的溶液在下文中被称为提取物。

优选地，将提取物的ph调节至中性，并进一步处理提取物以澄清材料并除去非蛋白质物质。在脱脂步骤iii)中，通过固/液分离步骤(例如过滤或离心)除去残留的脂肪和形成的沉淀物。优选地，通过离心进行步骤iii)中的脱脂。

然后在超滤/渗滤(uf/df)步骤vi)中浓缩并洗涤提取物。uf/df步骤的目的是浓缩蛋白质并除去抗营养因子(例如多酚、残留植酸盐、硫代葡萄糖苷)。步骤vi)中的浓缩和洗涤优选通过超滤和渗滤进行。

最后，在步骤vii)中，可以将经洗涤的浓缩物在合适的干燥器(例如入口温度为150-200℃且出口温度为50-100℃的喷雾干燥器(单级或多级))中干燥，从而产生了油菜籽蛋白质分离物。

优选地，油菜籽蛋白质分离物是在这样的方法中获得的，所述方法不包括用于分离出十字花科植物素和芸苔籽蛋白的分级步骤。

优选地，油菜籽蛋白质分离物是在这样的方法中获得的，其中保持芸苔籽蛋白和十字花科植物素的水平基本恒定(即，不有意提高芸苔籽蛋白(2s)和十字花科植物素(12s)的水平)。

出乎意料地发现：获得本发明第一方面的低微生物浓度并不需要在浓缩前对提取物进行细菌过滤。此外，浓缩物显示出良好的微生物稳定性。虽然在通过离心去除非蛋白质物质之前材料的微生物水平高于1*10⁵cfu/ml，但在去除后，优选在沉淀和离心以除去沉淀的物质后，水平降至低于1*10²cfu/ml。这意味着不需要进一步处理以减少微生物计数，例如通过微滤。

本发明方法的特征在于它非常适合于大规模应用。因此，在一个实施方式中，该方法以至少500kg、优选500-10000kg或1000-5000kg的规模在2-10小时的时间期间进行。

在本发明的另一个实施方式中，提供了获得食品级可溶性天然油菜籽蛋白质分离物的方法以及食品级可溶性天然油菜籽蛋白质分离物在食品中的用途。

在第二方面，天然油菜籽蛋白质分离物可用于任何人类营养食品应用，包括作为发泡剂以替代蛋清，作为乳化剂以替代例如蛋黄酱中的蛋黄，以及简单地作为提供优异氨基酸谱的营养成分。因此，本发明提供了根据本发明第一方面的天然油菜籽蛋白质分离物作为食品的发泡剂或作为食品的乳化剂的用途。

在第三方面，本发明提供了食品或宠物食品，其包含根据本发明第一方面的天然油菜籽蛋白质分离物。

在一个实施方式中，对于某些食品应用，期望在保持风味的同时增加蛋白质含量。例如，在us4,493,853中，描述了一种巧克力产品，其通过添加加工乳酪而具有增加的蛋白质含量。虽然这种方法有一些缺点，例如使用相对大量昂贵的加工乳酪，但显然存在增加巧克力中蛋白质含量的需要。类似地，基于植物的蛋白质棒现在越来越受欢迎并且可获得具有约20％基于植物的蛋白质含量的几种基于植物的蛋白质棒。此类棒由诸如坚果、坚果酱、南瓜子、脆豌豆和大米等成分制成，并任选地蘸有和淋上巧克力。这些棒旨在作为便携的健康蛋白质零食以提供持久的能量和饱腹感。

本发明的油菜籽蛋白质分离物可用作食品(例如棒、巧克力等)中的蛋白质添加剂。

在另一个实施方式中，本发明提供了乳剂在宠物食品中的用途，所述宠物食品包含以宠物食品的重量计为5％-35％、优选25％-30％的天然油菜籽蛋白质分离物。天然油菜籽蛋白质分离物可被用作宠物食品中的麸质替代成分，这是有利的，因为一些宠物可能对麸质敏感。术语“宠物食品”是指旨在由宠物消耗的任何组合物。肉或鱼宠物食品可以是具有逼真的肉样或鱼样形像的肉或鱼乳剂产品。可以在肉或鱼材料被乳化之前和/或之后将油菜籽蛋白质分离物加入肉或鱼材料中，如例如wo2015/114543中所述。宠物可以是任何合适的动物，例如禽鸟、牛、犬、马、猫、山羊、狼、鼠、绵羊或猪动物。

实施例

试验方法

蛋白质含量

根据aoac官方方法991.20牛奶中的(总)氮(aoacofficialmethod991.20nitrogen(total)inmilk)通过kjeldahl方法来测定蛋白质含量，使用换算因数6.25来确定蛋白质的量(％(w/w))。

电导率

使用电导率仪hachsension+ec71测量天然油菜籽蛋白质分离物在2重量％水溶液中的电导率。

溶解度试验

以下溶解度试验改编自morr等人(j.foodsci.(1985)50,1715-1718)，不同之处在于使用水代替0.1m氯化钠。

将足以提供0.8g蛋白质的蛋白质粉末称量到烧杯中。向粉末中加入少量脱矿质水，并搅拌混合物直至形成光滑的糊状物。然后加入另外的脱矿质水以使总重量为40g(产生2％w/w的蛋白质分散体)。使用磁力搅拌器缓慢搅拌分散体至少30分钟。然后测定ph并用氢氧化钠或盐酸将ph调节至期望水平(2、3、4等)。测量分散体的ph并在60分钟的搅拌期间定期校正ph。搅拌60分钟后，保留蛋白质分散体的等份用于蛋白质含量测定(kjeldahl分析)。将另一部分样品以20000g离心2分钟。离心后分离上清液和沉淀。也通过kjeldahl分析确定蛋白质含量。

蛋白质溶解度(％)＝(上清液中的蛋白质/总分散体中的蛋白质)×100。

用于测定溶解度的替代方法是可用的，在某些情况下使用缓冲剂，如wo2011/057408中的硼酸盐-磷酸盐缓冲剂。然而，例如值与在本申请中获得的在没有缓冲剂的情况下测定的值不能比较。

通过蓝色非变性page测定mw

在非变性page的情况下，蛋白质电荷对电泳迁移率有影响。在蓝色非变性page的情况下(与清澈(clear)非变性page相反)，考马斯亮蓝染料为蛋白质复合物提供电泳分离所需的电荷。将蛋白质溶解在500mm氯化钠中。由于高盐浓度与电泳分离不相容，所以将样品用水稀释10倍(最终盐浓度：50mm)。使用g-250(simplyblue^tm,thermofischerscientific)，并利用exquest^tmspotcutter(biorad)扫描凝胶。观察进行蓝色非变性page之后产生的条带。预计约14kda的条带指示2s，约150kda的条带指示7s，300kda的条带指示12s蛋白质。

十字花科植物素/芸苔籽蛋白(c/n)比值

通过尺寸排阻色谱(sec)分析来确定c/n比值。将样品溶解在500mm氯化钠盐溶液中并使用与流动相相同的溶液通过hp-sec进行分析。通过测量280nm处的uv吸光度来进行检测。按照每种蛋白质的峰面积相对于两个峰面积总和的比值来计算十字花科植物素和芸苔籽蛋白的相对贡献(％)。

植酸盐水平

基于ellis等人(anal.biochem.(1977)77,536-539)，使用方法qd495在eurofins测量植酸盐。

实施例1

从冷压油菜籽含油种子粗粉制备油菜籽蛋白质分离物

由冷压油菜籽含油种子粗粉制备油菜籽蛋白质分离物，所述冷压油菜籽含油种子粗粉的含油量基于干物质计小于15％，清洁并在75℃之下处理。

在提取步骤中，将冷压油菜籽含油种子粗粉与水性盐溶液(1-5％氯化钠)在40-75℃的温度下混合。粗粉与水性盐溶液的比值在1:5至1:20的范围内。约30分钟至1小时后，将富含蛋白质的溶液(提取物)与不溶物质分离。将提取物的ph调节至中性，并进一步处理提取物以澄清材料并除去非蛋白质物质。在脱脂步骤中，利用离心通过液/液分离步骤除去残留的脂肪。通过在使植酸盐沉淀的盐(例如氯化钙)的存在下将材料的ph调节至中性来除去非蛋白质物质。通过固/液分离步骤(例如膜压滤机或离心)除去形成的沉淀物，其中杂质以固体盐形式(例如植酸钙)被除去。然后在超滤/渗滤(uf/df)步骤中浓缩并洗涤提取物。最后，将经洗涤的浓缩物在入口温度为150-200℃且出口温度为50-100℃的喷雾干燥器中干燥，从而产生了油菜籽蛋白质分离物。准备几个批次并检测。

所产生的天然油菜籽蛋白质分离物在2.5-11.5的ph范围内在2％溶液中的电导率小于4000μs/cm。

蓝色非变性page：观察到了大致约300kda的主要条带，在242kdamw标记和480kdamw标记之间(图1)。一些染色可见曳尾(smear)，因为分子量较低(150kda及以下)。在150kda处没有观察到清晰的条带。基于这些结果，油菜籽产物含有12s形式的十字花科植物素。

所产生的天然油菜籽蛋白质分离物包含40-65％的十字花科植物素和35-60％的芸苔籽蛋白。

所产生的天然油菜籽蛋白质分离物含有少于0.26重量％的植酸盐。

当在3-10的ph范围内在23±2℃的温度下测量时，所产生的天然油菜籽蛋白质分离物的溶解度为至少88％，如下表中关于两个批次所示。