发酵乳杆菌CQPC07及其在制备改善溃疡性结肠炎的食品或药品中的应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，涉及一种乳酸菌，还涉及该乳酸菌在制备食品或药品中的应用。

背景技术：

四川泡菜的生产过程是将新鲜的泡菜洗净，密封于坛内，在盐水中厌氧发酵浸泡的泡菜。泡菜水中含有丰富的天然乳酸菌，对泡菜风味和品质的形成起着关键作用。其使用可溶性成分(主要是糖和含氮物质)进行增殖，产生酸性物质并代谢出风味成分，使泡菜产生独特的酸脆口味。泡菜水中含有的乳酸菌主要包括发酵乳杆菌、l.短杆菌、干酪乳杆菌、发酵酵母菌、嗜酸乳杆菌等。乳酸菌种类的差异可能是由于地域、气候和生产工艺习惯等因素造成的。某些乳酸菌也被用作益生菌，对人体健康有多种益处，包括维持肠道菌群的微生态平衡、加强机体免疫功能、预防和抑制肿瘤发生、降低胆固醇、延缓机体衰老等。为了更好的利用这些微生物资源，应开展更广泛的分离和鉴定工作，积累丰富的菌种资源，开发出丰富的工业用益生菌种类。

溃疡性结肠炎是一种炎症性肠病，主要表现为腹痛、腹泻和血便，其发病机制至今尚未完全阐明。研究发现，溃疡性结肠炎患者肠黏膜上皮细胞调亡增加、肠上皮细胞间紧密连接缺损、肠上皮黏液层变薄或缺失、肠道菌群失调或易位、固有层肠黏膜免疫系统异常激活，从而导致肠道上皮黏膜通透性增加、屏障功能受损。

技术实现要素：

本发明的目的在于对泡菜水中的乳酸菌进行分离鉴定，并考察其对溃疡性结肠炎的作用效果，以丰富乳酸菌菌种资源、开发功能保健制品。

经研究，本发明提供如下技术方案：

1.发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)cqpc07，保藏编号为cgmccno.14956。

2.发酵乳杆菌cqpc07在制备改善溃疡性结肠炎的食品或药品中的应用。

优选的，所述食品为发酵食品。

优选的，所述发酵食品为乳酸菌奶饮料、发酵乳、乳粉或乳粉胶囊。

本发明对泡菜水中的乳酸菌进行了分离鉴定，将其中一株发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)命名为cqpc07，于2017年11月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.14956。

本发明的发酵乳杆菌cqpc07具有很好的抗胃酸能力，经ph3.0人工胃液处理3h后的存活率达到91.76％；在0.30％胆盐中该菌也能缓慢生长，生长效率达到无胆盐培养的11.91％。

葡聚糖硫酸钠(dss)诱导溃疡性结肠炎小鼠模型实验结果显示，发酵乳杆菌cqpc07能够抑制结肠缩短和结肠重量/结肠长度比值变大；能够很好地保护结肠粘膜的完整性，减少炎症对结肠的损伤；能够提升结肠炎小鼠血清中ss、vip和il-2的水平，同时降低et、sp和il-10水平；能够增加结肠炎小鼠体内gsh和sod的活力，降低mpo和mda的含量；能够加强小鼠结肠组织中nnos和enos的表达，同时减弱inos、il-8和cxcr2的表达；且随着cqpc07的剂量增加，上述作用也加强，接近药物柳氮磺胺吡啶的作用。由此可见，发酵乳杆菌cqpc07可以有效地改善溃疡性结肠炎。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种发酵乳杆菌cqpc07，消化道抗性较强，而且可以有效地改善溃疡性结肠炎，不仅丰富了乳酸菌菌种资源，而且扩大了发酵乳杆菌cqpc07的应用范围，有助于功能保健制品的开发，也给溃疡性结肠炎的改善带来了新的希望。

附图说明

图1为发酵乳杆菌cqpc07的菌落形态。

图2为发酵乳杆菌cqpc07的革兰氏染色结果。

图3为发酵乳杆菌cqpc07的16srdnapcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中m为dna分子量标准，0为阴性对照，1为发酵乳杆菌cqpc07。

图4为小鼠结肠组织形态学观察。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。

一、发酵乳杆菌cqpc07的分离与鉴定

1、实验材料

采自重庆市南岸区农家自然发酵泡菜水6份，分别吸取40ml泡菜水放入无菌离心管中，置于食品采样箱内，放于实验室4℃冰箱保存备用。

2、乳酸菌的分离纯化

分别取1ml泡菜水样品，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10^-6，然后分别取10^-4、10^-5、10^-63个梯度的稀释液100μl进行平板涂布，37℃培养24-48h，观察并记录菌落形态。挑取平板上不同形态的菌落进行划线分离，经37℃培养48h后，再次挑取平板上不同形态的单菌落进行划线分离，如此重复2至3次，直至得到形态一致的纯的单菌落。

编号为cqpc07的菌株菌落形态如图1所示，菌落颜色多为白色或乳白色，形状为圆形，边缘整齐，表面湿润光滑。

3、乳酸菌的初步鉴定

挑取平板上的纯菌落接种于5mlmrs液体培养基中，37℃培养24h。取上述含菌培养基1ml于无菌离心管中，4000r/min离心10min后弃去上层培养基，菌体沉淀重悬于无菌生理盐水并进行革兰氏染色镜检，革兰氏染色镜检为阳性的初步鉴定为乳酸菌。

编号为cqpc07的菌株革兰氏染色呈现阳性，在100倍油镜下，菌株细胞形态如图2所示，细胞形态有长杆、短杆，且不存在出芽生殖。

4、乳酸菌dna提取

将已纯化的疑似目标菌株接种于mrs肉汤中，37℃培养18-24h后，采用细菌基因组dna提取试剂盒进行dna提取。提取的dna放于-20℃冰柜保藏备用。

5、基因组dnapcr扩增及琼脂糖凝胶电泳检测

取提取的dna，pcr扩增16srdna，其中上游引物27f(5'－agagtttgatcctggctcag－3'，seqidno.1)1μl、下游引物1495r(5'－ctacggctaccttgttacga－3'，seqidno.2)1μl，2×taqplusbuffer12.5μl、模板dna1μl，用无菌ddh2o将体系补足至25μl。以无菌超纯水替代模板dna作为阴性对照。扩增条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共29个循环；最后72℃延伸5min。然后取5μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖浓度为1.5％，电泳条件为110v，45min。

编号为cqpc07的菌株16srdna扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示，阴性对照组的泳道无条带，表明pcr扩增过程中未受到污染；编号为cqpc07的菌株的泳道有一条长度约为1500bp的条带，符合预期扩增片段的长度。

将编号为cqpc07的菌株的16srdna扩增产物委托北京擎科生物技术有限公司进行测序，测得序列如seqidno.3所示。使用ncbi中的blast(basiclocalalignmentsearchtool)程序对测得序列进行同源性比对分析，结果显示，编号为cqpc07的菌株为乳酸菌中的发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)，其与genebank数据库中已知乳酸菌的同源性均达99％。

6、乳酸菌体外抗性筛选

(1)耐受0.3％胆盐的能力

在mrs-thio培养基(含0.2％巯基乙酸钠的mrs肉汤)中添加猪胆盐使其浓度为0.3％，121℃灭菌15min；将活化好的5ml菌种以2％(v/v)的接种量分别接入不含胆盐(0.0％)的mrs-thio培养基和含0.3％胆盐的mrs-thio培养基中，以空白培养基(未接菌的mrs-thio培养基)为对照，37℃培养24h后，分别测定上述不同浓度培养基的od600nm值，按公式(1)计算菌株对胆盐的耐受力：

结果显示，编号为cqpc07的菌株在0.3％胆盐中能够缓慢生长，生长效率达到无胆盐培养的11.91±0.20％。

(2)人工胃液耐受性试验

人工胃液的配制：由0.2％nacl和0.35％胃蛋白酶组成，用1mol/lhcl调节ph为3.0，再用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌备用。

在超净工作台中吸取5ml培养好的含菌培养基于10ml无菌离心管中，经3000r/min离心10min，弃去上层培养基并收集菌体，加入5ml无菌生理盐水混匀制成菌悬液，然后取1ml菌悬液与9mlph3.0的人工胃液混匀，取1ml混合液作为人工胃液处理0h的样品，剩余9ml混合液置于恒温水浴摇床(37℃，150r/min)中培养3h。0h和3h的样品分别经10倍梯度稀释，选择合适梯度采用平板涂布的方法测定活菌数，在mrs固体培养基上37℃培养48h，按公式(2)计算存活率(％)。

结果显示，编号为cqpc07的菌株具有很好的抗胃酸能力，经ph3.0人工胃液处理3h后的存活率达到91.76±7.92％。

二、发酵乳杆菌cqpc07对溃疡性结肠炎的改善作用

1、实验动物

spf级6周龄雄性昆明小鼠50只，购于重庆医科大学实验动物中心。饲养于室温25±2℃、相对湿度50±5％、12h光照/12h黑暗的标准化实验室中，适应性喂养一周后开始实验。

2、实验方法

50只小鼠随机分为5组，每组10只，分别为正常组、模型组、cqpc07高剂量组、cqpc07低剂量组和柳氮磺胺吡啶(主治炎症性肠病即crohn病和溃疡性结肠炎的药物)组。整个实验周期为5周，正常组和模型组每天灌胃生理盐水；cqpc07高、低剂量组每天灌胃发酵乳杆菌cqpc07菌悬液，高剂量组浓度为1.0×10⁹cfu/ml，低剂量组浓度为1.0×10⁸cfu/ml；柳氮磺胺吡啶组每天按20mg/kg灌胃柳氮磺胺吡啶水溶液；每组小鼠灌胃体积均为0.1ml/10g.bw；第3周对实验小鼠进行结肠炎造模，造模方法如下：各组小鼠除正常灌胃外，正常组小鼠每天自由饮用无菌蒸馏水，模型组、cqpc07高、低剂量组和柳氮磺胺吡啶组小鼠每天自由饮用5％dss溶液，造模期间每隔2天换用新鲜的无菌水和5％dss溶液，总共造模7天。整个实验结束后，所有小鼠禁食不禁水24h，通过摘眼球取血收集全血，4℃、4000r/min离心10min，收集上层血清，分装后于-80℃超低温冰箱保藏备用；然后脱颈处死小鼠，解剖取出结肠，称量重量，测量长度；取0.5cm左右的结肠组织，立即放于10％福尔马林溶液中固定48h，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后进行he染色；其余结肠经液氮冷冻后置-80℃超低温冰箱中保藏备用。

3、小鼠结肠长度测量和结肠重量/结肠长度比值计算

dss诱导小鼠结肠炎会导致结肠缩短和结肠重量/结肠长度比值变小，所以结肠长度和结肠重量/结肠长度比值是评价结肠炎小鼠炎症严重程度的重要指标之一。

各组小鼠的结肠长度和结肠重量/结肠长度比值见表1，正常组小鼠的结肠长度最长、结肠重量/结肠长度比值最小；模型组小鼠的结肠长度最小、结肠重量/结肠长度比值最大，和正常组存在显著差异(p<0.05)，说明结肠炎造模成功；与模型组相比，cqpc07低剂量组、高剂量组和柳氮磺胺吡啶组小鼠的结肠长度均显著增加(p<0.05)、结肠重量/结肠长度比值均显著减小，且高剂量cqpc07的效果优于低剂量cqpc07，接近柳氮磺胺吡啶的作用。以上实验结果说明，发酵乳杆菌cqpc07能够抑制结肠缩短和结肠重量/结肠长度比值变大的情况。

表1各组小鼠结肠长度和结肠重量/结肠长度比值

注：标有相同英文字母(a-e)的组之间不存在显著差异，标有不同英文字母(a-e)的组之间存在显著差异(p<0.05)。

4、小鼠结肠组织切片观察

取he染色的小鼠结肠组织切片，在光学显微镜下观察组织形态变化。结果如图4所示，正常组小鼠结肠粘膜上皮细胞完整，隐窝正常，腺体排列整齐有序，且无溃疡存在；与正常组相比，模型组小鼠结肠粘膜糜烂严重，隐窝几乎全部被破坏，杯状细胞急剧减少，固有层细胞浸润严重，腺体排列紊乱，而且可见严重溃疡灶；cqpc07低剂量组小鼠结肠粘膜存在糜烂现象，杯状细胞有所减少，可见少量溃疡灶，但损伤程度明显轻于模型组；cqpc07高剂量组和柳氮磺胺吡啶组小鼠结肠粘膜未出现明显糜烂，而且隐窝完整，腺体排列整齐，杯状细胞完整，与正常组结肠组织形态接近。以上实验结果表明，发酵乳杆菌cqpc07能够很好地保护结肠粘膜的完整性，减少炎症对结肠的损伤。

5、小鼠血清中et、ss、sp和vip水平测定

et是一种持久且有效的血管活性物质，et引起血管收缩会导致结肠粘膜糜烂，严重情况下会引起溃疡，在溃疡性结肠炎的发病机制中起着关键作用。ss是一种重要的胃肠激素，能抑制胃酸和其他胃肠液的分泌。ss减少会加剧胃肠液的分泌，加重胃肠道炎症。p物质是一种具有免疫调节作用的神经物质。p物质对神经系统和免疫系统的调节可能在结肠炎的调节中起作用。p物质的大量积累可能加剧结肠炎。同时，p物质可诱导结肠炎，拮抗动物p物质后结肠炎的炎症程度减轻。vip水平与结肠炎程度密切相关，vip水平的降低直接导致溃疡性结肠炎的免疫调节紊乱和炎症加重。

按照常规生化试剂盒说明书测定小鼠血清中et、ss、sp和vip的含量。结果见表2，与其它组相比，正常组小鼠血清中ss、vip水平最高，et、sp水平最低；模型组呈现出相反的趋势，小鼠血清中ss、vip水平最低，et、sp水平最高；发酵乳杆菌cqpc07和柳氮磺胺吡啶都能够提升结肠炎小鼠血清的ss、vip水平，同时降低et、sp水平，且高剂量cqpc07的效果优于低剂量cqpc07，接近柳氮磺胺吡啶的作用。

表2各组小鼠血清中et、ss、sp和vip水平

注：标有相同英文字母(a-e)的组之间不存在显著差异，标有不同英文字母(a-e)的组之间存在显著差异(p<0.05)。

6、小鼠血清中il-2和il-10水平测定

il-2是th2细胞分泌的细胞因子，与结肠炎直接相关。il-2通过抑制th2细胞和减轻结肠炎的程度起到抑制炎症的作用。il-10是treg细胞分泌的细胞因子，具有免疫抑制作用。il-10在结肠炎的炎症中具有促炎作用，可加重结肠炎。

采用elisa试剂盒测定小鼠血清中il-2和il-10的水平。结果见表3，与正常组相比，模型组小鼠血清中il-10水平显著升高(p<0.05)，il-2水平显著下降(p<0.05)；与模型组比较，cqpc07高、低剂量组均能显著降低小鼠血清中il-10水平(p<0.05)，同时显著提升il-2水平(p<0.05)，而且随着cqpc07剂量的增加，炎症因子的改变越显著。

表3各组小鼠血清中il-2和il-10水平

注：标有不同英文字母(a-e)的组之间存在显著差异(p<0.05)。

7、小鼠结肠组织中mpo、gsh、mda和sod活力的测定

已有研究表明氧自由基在结肠炎发病过程中具有重要作用。机体正常情况下，氧自由基的生成和清除处于平衡状态，当炎症发生时，机体局部缺氧导致氧自由基大量生成，从而导致细胞凋亡或者损伤。结肠炎发生后，中性粒细胞聚集在炎症组织中开始下降，更多中性粒细胞流入组织，mpo活性急剧增加。结肠组织被氧化破坏后，结肠组织中gsh活性显著降低。mda是脂质过氧化的产物，它能引起dna损伤、酶及激素失活。sod是一种抗氧化酶，能特异性清除机体内的超氧阴离子，并把超氧化自由基分解为对机体无害的水和氧分子。

按照常规生化试剂盒说明书测定小鼠结肠组织中mpo、gsh、mda和sod的含量。结果见表4，与其它组相比，模型组小鼠结肠组织中mpo、mda的含量最高，gsh、sod的含量最低，而正常组的趋势与其完全相反；与模型组相比，cqpc07低剂量组、高剂量组和柳氮磺胺吡啶组小鼠结肠组织中mpo、mda的含量均显著降低(p<0.05)，gsh、sod的含量均显著升高(p<0.05)。以上结果说明，发酵乳杆菌cqpc07能够增加结肠炎小鼠体内gsh和sod的活力，降低mpo和mda的含量，从而减少氧自由基对结肠炎小鼠造成的氧化损伤。

表4各组小鼠结肠组织中mpo、gsh、mda和sod活力

注：标有相同英文字母(a-e)的组之间不存在显著差异，标有不同英文字母(a-e)的组之间存在显著差异(p<0.05)。

8、小鼠结肠组织中nnos、enos、inos、il-8和cxcr2mrna表达水平检测

按照trizol(invitrogen公司)说明书提取结肠总rna，用超微量分光光度计测定总rna的纯度和浓度，将每个样本的rna浓度调整到同一水平(1μg/μl)。然后取1μg/μl的rna样品1μl，加入(oligo)primerdt1μl和无菌超纯水10μl，混合，65℃反应5min，再加入ribolockrnaseinhibitor1μl、100mmdntpmix2μl、5×reactionbuffer4μl和revertaidm-mu/vrt1μl，混匀，在42℃、60min和70℃、5min条件下合成cdna。接着对目标基因进行反转录和扩增(所用引物序列见表5)。反应条件为：95℃变性15min，60℃退火1h，95℃延伸15min，总共40个循环。以gapdh作为持家基因，通过2^-δδct计算目标基因的相对表达量。

表5引物序列

控制nos可以调控no的产生，从而维持结肠组织的正常状态。enos对结肠炎引起的结肠损伤有重要的控制作用；inos可转化大量的no，过量的no对结肠组织的损伤有提升作用；nnos可以控制组织中的no浓度并保护组织免受过量no的影响，也可以控制inos过表达和抑制炎症。

小鼠结肠组织中nnos、enos和inos的mrna表达水平见表6，与其它组相比，模型组小鼠结肠组织中nnos、enos的表达最弱，inos的表达最强，灌胃发酵乳杆菌cqpc07可加强小鼠结肠组织中nnos、enos的表达同时减轻inos的表达，且随着cqpc07的剂量增加，作用也加强。

表6各组小鼠结肠组织中nnos、enos和inosmrna表达

注：标有相同英文字母(a-e)的组之间不存在显著差异，标有不同英文字母(a-e)的组之间存在显著差异(p<0.05)。

il-8是中性粒细胞趋化和激活因子，介导多种途径诱导的炎症反应，包括介导结肠炎。chic-1是il-8家族中的中性粒细胞趋化因子，cxcr2是chic-1的受体。cxcr2在调节器官相互作用中起中介作用。降低组织中cxcr2含量，有助于减少结肠炎引起的结肠损害。

小鼠结肠组织中il-8和cxcr2的mrna表达水平见表7，与其它组相比，模型组小鼠结肠组织中的il-8和cxcr2表达最强，灌胃发酵乳杆菌cqpc07可减弱小鼠结肠组织中il-8和cxcr2的表达，且随着cqpc07的剂量增加，使il-8和cxcr2表达减弱的作用也加强。

表7各组小鼠结肠组织中il-8和cxcr2mrna表达

注：标有相同英文字母(a-e)的组之间不存在显著差异，标有不同英文字母(a-e)的组之间存在显著差异(p<0.05)。

实施例3、利用发酵乳杆菌cqpc07制备发酵食品

发酵乳杆菌cqpc07原始菌种的保存：在温度-75℃下以30wt％甘油悬液形式保存，或在温度4℃下以冷冻干燥菌粉的形式保存。

发酵乳杆菌cqpc07工作发酵剂的制备，采用下述两种方法中的任意一种：

第一种方法：将发酵乳杆菌cqpc07的原始菌种接种于经110℃灭菌10min的12wt％脱脂乳中，37℃培养14-16h至凝乳，连续培养活化两代，用作母发酵剂；然后将母发酵剂按3-5vol％接种于灭菌乳中，培养14-16h至凝乳，凝乳中的活菌数约10⁹cfu/ml，用作工作发酵剂。

第二种方法：将发酵乳杆菌cqpc07的原始菌种接种于mrs液体培养基中，37℃培养12-16h进行活化，连续活化两代，然后将活化培养物按2-4vol％接种于mrs培养基中，培养16-18h，4℃、4000r/min离心15min，去除上清夜，细胞沉淀用无菌脱脂乳制成悬浮液，用作工作发酵剂。

1、制备乳酸菌奶饮料

将原料乳(选自脱脂奶、鲜奶和复原奶中的一种或多种)在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，冷却到4℃，加入发酵乳杆菌cqpc07工作发酵剂使其浓度达到10⁶cfu/ml以上，即得到含发酵乳杆菌cqpc07的乳酸菌奶饮料，4℃冷藏保存。

2、制备发酵乳

将原料乳(选自脱脂奶、鲜奶和复原奶中的一种或多种)在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，冷却到37℃，按照原料乳体积的4％加入发酵乳杆菌cqpc07工作发酵剂，37℃发酵16h，即得到发酵乳杆菌cqpc07发酵乳，4℃冷藏保存。

或者，将原料乳(选自脱脂奶、鲜奶和复原奶中的一种或多种)在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，冷却到37℃，按照原料乳体积的4％加入发酵乳杆菌cqpc07工作发酵剂，再按照原料乳体积的4％加入其它可共生的制备发酵乳的商业发酵剂(如保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)，混匀，37℃混菌发酵至滴定酸度以乳酸计为0.6-0.7％，即得到混菌发酵乳，4℃冷藏保存。

3、制备乳粉

将原料乳(选自脱脂奶、鲜奶和复原奶中的一种或多种)在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，冷却到37℃，按照体积比3：1加入发酵乳杆菌cqpc07发酵乳，均质，真空浓缩，喷雾干燥，即得到含发酵乳杆菌cqpc07的乳粉。

4、制备乳粉胶囊

将含发酵乳杆菌cqpc07的乳粉装入胶囊壳中，即得到乳粉胶囊。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>重庆第二师范学院

<120>发酵乳杆菌cqpc07及其在制备改善溃疡性结肠炎的食品或药品中的应用

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>发酵乳杆菌cqpc07(lactobacillusfermentumcqpc07)

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

cagctgggctgtacaaacctt21

<210>9

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

cattggaagtgaagcgtttgg21

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

ctaggcatcttcgtccgtcc20

<210>11

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<400>11

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<210>12

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<400>14

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<400>15

gatgcagggatgatgttc18