专利名称：利用家蚕高效表达天花粉蛋白及其他有用蛋白的方法
利用家蚕高效表达天花粉蛋白及其他有用蛋白的方法基因工程技术。本发明是利用基因工程技术，通过构建的新型转移载体质粒和分离的家蚕核型多角体病毒HB毒株，在家蚕体内高效表达天花粉蛋白，进而可用于生产其他有用蛋白。
基因工程使利用重组DNA技术，在大肠杆菌、枯草杆菌、酵母及哺乳动物细胞中生产人们所需要的蛋白质及药物等成为可能。
近年来建立的杆状病毒载体表达系统，以两种昆虫病毒，即苜蓿尺蠖核型多角体病毒和家蚕核型多角体病毒为载体在昆虫培养细胞及昆虫活体内表达了数十种外源基因。并证实该系统表达的外源蛋白具备天然性质，可作为检测试剂、药物、疫苗等。
已有的研究结果表明，虽然在家蚕体内表达外源基因、生产有用蛋白的效率受多种因素的影响，但其中最关键的是用于构建重组病毒、供外源基因插入的转移载体质粒的结构。在转移载体质粒中，多角体蛋白启动基因的完整性可使表达效率相差几倍甚至几十倍。而多角体蛋白基因下游的序列对外源基因转录及翻译的终止也有影响。特别是现有的家蚕核型多角体病毒载体的转移载体质粒尚不完善。
本发明采用新兴的PCR技术，通过人工合成的寡聚核苷酸引物对所克隆的多角体蛋白基因的旁侧序列进行了定点改造，册除了全部结构基因部分，保留了完整的5′端及3′端序列，并插入了合适的多聚接头，使新构建的转移载体处于最理想状态，保证了外源基因在此完整启动子的控制下，可获得高效表达。并且在3′端下游序列中，引入了三套终止密码子TAA，无论外源基因是否含有终止密码，在本载体中表达均能有效地终止。
因而，本发明旨在通过构建理想的转移载体质粒，提高利用家蚕核型多角体病毒在家蚕体内表达外源基因的表达效率。
家蚕核型多角体病毒是家蚕血液型脓病的病原体，该病毒属于杆状病毒科的A亚组。在野外该病毒只感染家蚕、野蚕、蓖麻蚕等少数几种昆虫。野生型家蚕核型多角体病毒有许多分离株，它们的多角体形态和限制性内切酶酶切图谱不同。本发明选择能形成四方形多角体的HB分离株为材料，该分离株不仅多角体大于一般六角形多角体，而且很均整，这些特性为构建高效表达载体提供了基础。其表达载体的构建方案如下已知家蚕核型多角体病毒的多角体蛋白结构基因位于该病毒基因组EcoRⅠ 10.6kb片段内。该片段可通过构建家蚕核型多角体病毒的基因文库，从文库中筛选获得。
通过菌落原位杂交，Southern杂交等常用分子生物学实验方法可对所得到的目的片段进行分析、鉴定。进而用一系列限制性内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，可绘制出该片段的酶切图谱。在多角体蛋白结构基因上游(5′端)有一XhoⅠ位点，下游(3′端)有一BamHⅠ位点。分别位于上游1.8Kb和下游1.3Kb。包括结构基因在内，该XhoⅠ-BamHⅠ片段的大小为3.8Kb。从EcoRⅠ 10.6Kb片段中，可进一步克隆到该XhoⅠ-BamHⅠ 3.8Kb片段。
利用链终止法对多角体蛋白结构基因及上、下游区域进行序列分析，测得HB分离株的多角体蛋白结构基因的编码序列为738bp，另外从上游-196bp至下游+750bp范围内共有4bp的碱基序列发生了变化。
以上述克隆在载体质粒Bluescript的XhoⅠ/BamHⅠ位点的XhoⅠ-BamHⅠ 3.8Kb片段为模板，根据测定的多角体蛋白基因结构基因上游及下游序列合成一对引物，并以通用引物T7和T3与之相配合，分别扩增多角体蛋白结构基因的5′端1.8Kb及下游1.3Kb区域，在人工合成的引物中，分别引入了HindⅢ和XbaⅠ切点，并使原多角体蛋白基因的启始密码子ATG改为AAGCTT(HindⅢ切点);而在3′端引物XbaⅠ的下游加入了三套终止密码子TAA。经聚合酶链式反应30个循环的扩增，分别获得多角体蛋白基因上游1.8Kb片段a和下游1.3Kb片段b。将片段a和b用XhoⅠ、HindⅢ酶切;片段b用XbaⅠ和SacⅠ酶切，分别克隆于Bluescript的XhoⅠ/HindⅢ和XbaⅠ/SacⅠ切点。
扩增的XhoⅠ/HindⅢ 1.8Kb片段含有完整的多角体蛋白基因启动子，XbaⅠ/SacⅠ 1.3Kb片段含有多角体蛋白基因转录终止信号及通过引物合成引入的三套翻译终止密码子。然后，从XhoⅠ到Bluescript的XbaⅠ切点(含片段a)切下，克隆到片段b的上游XhoⅠ/XbaⅠ位点，为完整的家蚕核型多角体病毒转移载体质粒。该载体具备(1)完整的启动子序列(2)3′端转录终止及翻译终止信号(3)可供外源基因插入的HindⅢ、EcoRⅤ、EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、SpeⅠ、XbaⅠ多聚克隆接头。
(4)多角体蛋白基因5′端及3′端旁侧序列，可作同源重组。
该转移载体质粒为最理想的家蚕核型多角体病毒转移载体质粒，可供插入各种在基因两侧含有HindⅢ、EcoRⅤ、EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、SpeⅠ、XbaⅠ等酶切位点的外源基因。
克隆在载体质粒PGEM3z(f-)HincⅡ切点的天花粉蛋白基因用HindⅢ、XbaⅠ切下，连接到上述转移载体质粒的HindⅢ、XbaⅠ位点，其方向与多角体蛋白基因启动子的转录方向一致。
插入天花粉蛋白基因的重组转移载体质粒扩增后，可用氯化铯密度梯度离心，琼脂糖凝胶(Sepharose-4B)柱层析纯化或PEG-8000沉淀等常用DNA纯化方法进行纯化。纯化的重组质粒DNA与家蚕核多角体病毒HB株DNA通过磷酸钙沉淀的方法共转染家蚕培养细胞Bm-N，进入细胞内的野生型病毒DNA在复制过程中，与重组质粒上的同源的病毒DNA序列发生同源重组，可获得含天花粉蛋白基因的重组病毒。这种重组的机会很低，仅有0.1-1%。重组病毒与野生病毒可根据有无多角体这一形态标志，用空斑法进行筛选、纯化，获得重组病毒。重组病毒用斑点杂交、Southern杂交、PCR扩增天花粉蛋白基因等方法进行鉴定。
用重组病毒感染培养的家蚕传代细胞或家蚕活体，在感染后期，插入的外源基因(天花粉蛋白基因)在多角体蛋白基因启动子的控制下大量表达。表达产物可用多种常规的蛋白质方法分离、纯化。
利用本发明所构建的转移载体质粒，除可表达天花粉蛋白这类植物来源的外源蛋白外，还可用于表达其他各种细菌、病毒、动、植物基因。
本发明选用的材料为家蚕核型多角体病毒HB分离株，其多角体形态为四方形，大而均整，该多角体蛋白基因的启动子活性高于普通家蚕核多角体病毒。
本发明所构建的转移载体质粒5′端病毒序列为1.8Kb，小于普通家蚕核多角体病毒转移载体。其启动子部分结构完整。3′端病毒序列为1.3Kb，含三套翻译终止信号TAA。中间的多聚克隆位点包含了常用的7种限制性内切酶位点。因此，本载体具有表达效率高、操作方便、适合于有或无翻译终止信号的各种外源基因的表达。
利用家蚕活体表达外源基因其成本低于培养细胞系统，而且不需特殊的仪器、设备。家蚕在我国饲养历史悠久、技术普及，因此本技术容易推广、普及。家蚕核型多角体病毒的宿主域狭，且重组的含外源基因的病毒不能形成多角体，无多角体保护的病毒在野外很易失活，因此具很好的安全性能。
实施例(1)病毒DNA的提取及多角体蛋白基因的分离收集家蚕核多角体病毒感染的家蚕血淋巴，经低速离心(5000转/分)，沉淀(为多角体)用0.1%SDS悬浮，再离心(相同条件)，如此重复5次，最后用重蒸水悬浮。在上述含多角体的悬浮液中加入等体积的0.1mol/1 Na2CO3和0.05mol/1 NaCl，置冰上1小时，使多角体溶解。而后用等体积苯酚、苯酚/氯仿/异茂醇(25∶24∶1)、氯仿/异茂醇(24∶1)各抽提一次。最后加入十分之一体积的3mol/1 KAc(PH 4.8)和2.5倍体积乙醇，置-20℃30分钟，用12000转/分离心10分钟，弃上清，加入70%乙醇洗一次，真空抽干，将沉淀溶于TE，使病毒DNA的含量为0.1μg/μl。此病毒DNA溶液可用于酶切或家蚕培养细胞的传染。
将上述病毒DNA用限制性内切酶完全酶切，然后与同样酶切的Bluescript连接，转化大肠杆菌DH5α，在选择性培养基上含插入片段的重组质粒所形成的菌落为白色。将白色菌落作菌落原位杂交，以32P-dATP标记的普通家蚕核多角体病毒多角体蛋白基因为探针，筛选获得HB株系的多角体病毒含多角体蛋白基因的EcoRⅠ片段。将杂交阳性的菌落挑出，快速制备质粒DNA，EcoRⅠ酶切检查，证实其插入片段大小为10.6Kb。对重组质粒用EcoRⅠ酶切，作Southern杂交，采用相同的探针，进一步证实在10.6Kb的插入片段中含有多角体蛋白基因。将含10.6Kb插入片段的重组质粒命名为pOCU102。
(2)多角体蛋白基因的定位及结构分析 将质粒pOCU102用EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ、PstⅠ、XbaⅠ、HindⅢ作单酶、双酶酶切，绘制插入片段的物理图谱。结果(见附图1)，与已有普通家蚕核型多角体病毒的相应片段比较，在该片中增加了一个XhoⅠ切点。进一步用XhoⅠ/BamHⅠ双酶切pOCU102，并连接，得只含XhoⅠ-BamH3.8Kb的质粒pOCUXB。进一步利用该片段内存的XbaⅠ、NdeⅠ、HindⅢ切点，制作亚克隆，得亚克隆pXUB2、pSUB22、pSUB40、pSUB-62、pSUB80、pSUB71，对它们进行序列分析，其结果得到多角体蛋白基因的全序列及5′端和3′端旁侧序列(见附图2)。在5′端启动基因范围内，有2个核苷酸发生了变化，结构基因也有2个核苷酸变化，但只有一个导致了编码的氨基酸序列的改变。
(3)PCR扩增多角体蛋白基因的上、下游序列 根据序列分析的结果，人工合成了一对寡聚核苷酸引物a和b，其序列分别为a5′TAAGCTTATTTATAGGTTTTTTTATT3′b5′TTCTGAGTGATTAAAACACTATACATTG3′另以通用测序引物T7和T3分别与a和b组合，扩增pOCUXB的多角体蛋白基因5′端和3′端序列。PCR扩增条件为模板DNA 1μg，引物25pmol，dNTP 2.4mmol/l，300mmol/l KCl，1mmol/l DTT，0.1mmol/l EDTA，67mmol/l Tris·HCl(PH8.8)和6.7mmol/l MgCl2，反应温度为退火45℃45秒;延伸反应65℃2分;变性93℃30秒。经30个循环的扩增，各得1.8Kb的上游序列a和1.3Kb的下游序列b。
(4)转移载体的构建 将扩增所得到的两个片段a和b分别用限制性内切酶XhoⅠ/HindⅢ和XbaⅠ/SacⅠ酶切，并克隆到Bluescript的相应位点，得两个中间质粒pBma和pBmb。然后作序列分析，证实扩增产物与所设计的引物的序列一致，而其余为病毒原有序列。将pBma的插入片段用XhoⅠ和XbaⅠ切下，与相同酶切的pBmb连接，即得pBmAB。该质粒具备多角体蛋白基因的上、下游序列及限制性内切酶位点HindⅢ、EcoRⅤ、EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、SpeⅠ和XbaⅠ(见附图3)。
(5)天花粉蛋白基因的插入 天花粉蛋白基因是用PCR方法从括楼基因组DNA中分离的815bp的片段，克隆在pGEM3Z(f-)的HindⅡ位点。将该基因用HindⅢ和XbaⅠ切下，定向克隆到pBmAB的HindⅢ/XbaⅠ位点。所用方法有DNA片段的回收、连接，转化等，均为分子生物学常规方法。重组质粒经限制性内切酶酶切鉴定证实天花粉蛋白基因的存在，并且方向与启动基因的转录方向一致。然后大量提取重组质粒，采用碱法抽提，用柱层析(Shepharose-4B)纯化质粒DNA，TE洗脱。纯化的质粒DNA用于共转染昆虫培养细胞。
(6)家蚕培养细胞的转染 前述病毒HB分离株DNA与重组质粒DNA以分子比1∶100混合，配置下列溶液Ⅰ、重蒸水 2.1ml家蚕核多角体病毒 DNA 50μl(5μg)重组质粒 DNA 50μl(50μg)2mol/l CaCl2300μlⅡ、50mmol/l HEPES 缓冲液(PH7.1)含
0.28mol/l NaCl磷酸缓冲液(35mmol/l Na2HPO4，35mmol/l NaH2PO4)50μl将上述溶液Ⅰ和Ⅱ混合，可见乳白色磷酸钙沉淀，然后加入到家蚕培养细胞中，其病毒DNA与质粒DNA同时被导入细胞内。于28℃保持4小时，用培养液TC100洗一次，然后换新的培养液(TC100，含10%胎牛血清)，于28℃培养4～6天，细胞被病毒感染死亡，并形成多角体。
(7)空斑筛选及空斑纯化上述转染细胞的培养液稀释104，感染单层培养的家蚕培养细胞，并用含1%低融点琼脂糖的固体培养基培养，5日后形成空斑，在显微镜下挑选无多角体的空斑，并用同样方法进行4轮空斑纯化，得纯重组病毒。
在培养细胞中繁殖重组病毒，差速离心得病毒粒子，用蛋白酶K处理和苯酚抽提病毒DNA，用PCR方法鉴定重组病毒是否含有天花粉蛋白基因。所用引物为天花粉蛋白基因的5′端及3′端引物，亦以前述家蚕核型多角体病毒DNA为对照，进行扩增，结果重组病毒能扩增出0.8Kb的片段，而野生病毒无此片段。证实重组病毒含有天花粉蛋白基因。
(8)天花粉蛋白基因在家蚕活体内的表达用105PFU(空斑形成单位)的重组病毒注射家蚕5龄起蚕，5日后收集虫体血淋巴，并以野生病毒为对照。重组病毒和野生病毒感染家蚕的血淋巴5μl作SDS-PAGE(聚丙稀酰胺凝胶电泳)分析，结果重组病毒感染蚕血淋巴中有天花粉蛋白特异条带。用天花粉蛋白的兔抗血清作Western blotting，证实所增加的条带为表达产物。经紫外扫描积分计算，天花粉蛋白的表达量占蚕体血淋巴总蛋白量的5%左右。
图1、Ⅰ含多角体蛋白基因的家蚕核型多角体病毒EcoRⅠ 10.6kb片段的物理图谱Ⅱ上述片段中XhoⅠ-BamHⅠ 3.8kb的物理图谱Ⅲ含多角体蛋白基因及其旁侧序列的各亚克隆的结构图中字母RⅠEcoRⅠ;ph多角体蛋白基因;
HHindⅢ;XXhoⅠ;PPstⅠ;XbXbaⅠ;HpHpaⅠ;NNdeⅠ图2、家蚕核型多角体病毒HB分离株多角体蛋白结构基因及其部分旁侧序列图3、ⅠPCR扩增的XhoⅠ-BamHⅠ片段的区域Ⅱ克隆扩增产物pBma及pBmb的结构Ⅲ家蚕核型多角体病毒的转移载体质粒pBmAB的结构，大写字母为病毒图列，小写字母为载体中多聚克隆位点的序列
权利要求
本发明属于基因工程领域，是一种以家蚕核型多角体病毒为载体，利用家蚕表达天花粉蛋白及其他有用蛋白质的方法。其特征在于利用构建的新型家蚕核型多角体病毒载体质粒，通过与野生型家蚕核多角体病毒在培养细胞中进行同源重组，获得重组病毒，在家蚕体内表达自然界难以大量获得的天花粉蛋白。本方法适合于利用同样方法表达其他外源基因。权利要求为1、含有家蚕核型多角体病毒HB分离株多角体蛋白基因的EcoRI10.6kb片段及XhoI-BamHI3.8kb片段，以及由XhoI-BamHI片段引伸而来的一系列亚克隆片段。
2.PCR扩增的含多角体蛋白基因5′端序列和3′端序列的两个片段a和b。
3.家蚕核型多角体病毒转移载体质粒pBmAB。
4.插入了天花粉蛋白基因的重组家蚕核多角体病毒转移载体质粒。
5.含天花粉蛋白基因的重组家蚕核多角体病毒。
全文摘要
本发明通过基因工程技术，从家蚕核多角体病毒HB分离株中克隆了含多角体蛋白基因的片段，利用PCR定点突变法，构建了新型高效家蚕核多角体病毒转移载体质粒。该质粒的5′及3′端同源序列区小于普通转移载体质粒，适合于基因工程的操作。多角体蛋白基因启动子的结构完整，有利于高效表达。3′端引入了三套TAA终止密码，可以有效地终止外源基因的翻译。中间的多聚克隆位点适合于外源基因的插入。天花粉蛋白基因被插入到该质粒，并由些构建了含天花粉蛋白基因的重组家蚕核型多角体病毒，并在家蚕活体内表达了该基因。
文档编号C12N15/29GK1062001SQ9111046
公开日1992年6月17日 申请日期1991年11月12日 优先权日1991年11月12日
发明者储瑞银, 陈章良, 鲍一明, 林玉莲 申请人:北京大学