蛹虫草优良菌种的选育及高产栽培方法

专利名称：蛹虫草优良菌种的选育及高产栽培方法
技术领域：
本发明涉及一种食用兼药用真菌的选育及栽培技术，一种蛹虫草优良菌种的选育及高产栽培方法。
专利号为CN88103453.3的发明专利公开了一种“冬虫夏草菌及其培养方法”，从新鲜的冬虫夏草中分离、经人工培养，取其孢子接种于人工饲养的寄生昆虫，产生子座、形成菌虫结合的复合体。实验证明，该方法不仅周期长，而且子实体难以形成，故人工栽培冬虫夏草并没有获得完全成功。蛹虫草(cor-dycepsmiLitaris(L)Link)又名北冬虫夏草，是与冬虫夏草极为相近的一个种。本菌种已于1993年4月1日保藏在北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO 0193，本发明人曾在一项发明专利中公开过“北冬虫夏草菌及其人工栽培子实体的方法”。该方法通过人工栽培得到的北冬虫夏草子实体，因其含特有的虫草菌素、虫草多糖、超氧化物岐化酶、虫草酸等，故具有抗癌、抗衰老和营养肌肤等作用，可用于治疗多种疾病和做滋补、保健食品、药品、饮料、化妆品的原料。但目前蛹虫草的菌种及其栽培方法还不够理想。例如菌种不纯、退化现象比较严重，其表现为菌丝绒毛短、紧贴培养基表面，并出现水珠，镜检分生孢子多、呈圆柱形，菌丝分枝呈直角，这样的菌种栽培后，尽管给予合适的温度、光照、湿度等条件仍不易转色，难以出现子实体。影响产品质量和产量，在栽培技术上，以往只收一茬子实体，生物转化率仅30-60%，有的甚至只有10%左右，因而造成产量低，成本高。
本发明的目的是提供一种蛹虫草的良种选育和高产栽培方法。它有效地保证选育的菌种纯正，不易退化，明显提高生物转化率，缩短生产周期，显著降低生产成本。
本发明的目的是这样实现的将新采集的蛹虫草通过常规单孢或多孢分离方法获得的原始菌株，经过人工选育和高产栽培。其选育经过三个阶段的筛选母种阶段将原始菌株接种在经灭菌的试管或培养皿中的固体培养基上，避光培养7-10天，见光后呈桔黄色，根据菌落形态和镜检挑选菌丝绒毛长，均匀一致，菌丝分枝多而长、呈钝角、分生孢子呈圆形的菌株留作母种进行第一次筛选;原种阶段将上述母种接种在经灭菌的三角瓶中的液体培养基上经振荡、避光培养5天后，再经2天静止培养，见光后呈桔黄色，按上述标准挑选菌株留作原种，进行第二次筛选;栽培种阶段将上述原种接种在经灭菌的罐头瓶中的液体培养基上，经10-12天避光培养，见光1-2天后呈桔黄色，按上述标准挑选菌株留作栽培种，进行第三次筛选。菌种提纯复壮经过三次筛选的菌种再进行3-5次重复栽培试验，最后选出栽培母种，然后将培养基增加1-5%的活蛹或幼虫体或奶粉，进行复壮。蛹虫草的高产栽培在无菌室内每个培养瓶的固体培养基上接种2毫升上述经复壮的栽培种，避光培养10-20天，长满菌丝移入栽培室，室内相对湿度85-90%，CO2 0.03-0.05%，光照2千5-2万Lux，经3-5天即可长出子实体，在子囊孢子未大量散发及时采收。采收第一茬子实体后，将培养基表面用无菌刀清理干净，露出白色菌丝，在其上扎孔或划0.5厘米深的沟，注入10-20毫升营养液，将瓶口封好，在上述同样条件下经7-10天培养可长出第二茬子实体，同样方法和条件可再连续长出第三、第四茬子实体。在选育各阶段和高产栽培方法中所用培养基配方如下选育母种阶段培养基配方马铃薯21-25%、葡萄糖或蔗糖2.1-2.5%、琼脂2.1-2.5%、蛋白胨0.2-0.25%、磷酸二氢钾0.15-0.2%、磷酸氢二钾0.11-0.15%、硫酸镁0.1-0.15%、VBl 0.001-0.002%、活蚕蛹或幼虫1-5%，加土壤浸出液至100%;原种阶段培养基配方是马铃薯21-25%、葡萄糖或蔗糖2.1-2.5%、磷酸二氢钾0.15-0.2%、磷酸氢二钾0.11-0.15%、硫酸镁0.1-0.15%、VBl 0.001-0.002%、活蚕蛹或幼虫1-5%，加土壤浸出液至100%，其PH值为8-8.5;栽培种阶段培养基配方是马铃薯21-25%、葡萄糖或蔗糖2.1-2.5%、磷酸二氢钾0.15-0.2%、磷酸氢二钾0.11-0.15%、硫酸镁0.1-0.15%、VBl 0.001-0.002%、奶粉2-3%，加土壤浸出液至100%，其PH值为8-8.5;高产栽培所用固体培养基配方是大米30-50克加土豆汁1.7倍，调PH8-8.5;大米30-50克加奶粉2-5克，再加水1.6倍，调PH值8-8.5;大米30-50克加蚕蛹蛋白2-5克，再加水1.6倍，调PH8-8.5。所加营养液配方是马铃薯21-25%、葡萄糖或蔗糖2.1-2.5%、磷酸二氢钾0.15-0.2%、磷酸氢二钾0.11-0.15%、硫酸镁0.1-0.15%、VBl 0.001-0.002%、活蚕蛹或幼虫1-5%，加土壤浸出液至100%，其PH值为8-8.5。
由于本发明是对现有北冬虫夏草菌及其人工栽培子实体方法进行大量的实验研究后，确认蛹虫草的无性阶段属头孢霉属(ce-phalosporlum mitilaris kob)，所以它为蛹虫草菌种选育、提纯、复壮提供了可靠的依据。在研究中，还发现了蛹虫草存在“异核现象”，这种异核现象对子实体的产生有直接影响，经过长时间的大量栽培实验，总结出上述蛹虫草的良种选育和高产栽培方法，取得了意想不到的积极效果。该方法通过母种、原种、栽培种三个阶段的筛选和复壮后，获得种性相对稳定的纯正菌种，不易退化，该菌种在得到第一茬子实体后，在其固体培养基再追加营养液，可连续获得第二、三、四茬子实体，可使生物转化率达到150%以上，缩短生产周期20天以上，降低生产成本40%左右。
下面结合具体实施方法对本发明作进一步说明。
实施方法一优良菌种的选育母种阶段将按常规孢子分离技术获得的原始菌种接种在经灭菌的试管(或培养皿)中的固体培养基上，在20-25℃温度下避光培养7-10天后，见光1-2天呈桔黄色，根据菌落形态和镜检挑选菌丝绒毛长，均匀一致，菌丝分枝多而长，呈钝角，分生孢子呈圆形的菌株留作母种，进行第一次筛选，其余淘汰。其固体培养基配方是马铃薯210克、蔗糖25克、琼脂22克、蛋白胨2克、磷酸二氢钾1.8克、磷酸氢二钾1.2克、硫酸镁1克、VBl 10毫克、活蚕蛹10克，加土壤浸出液至1000毫升。原种阶段将上述母种接种在经灭菌的三角瓶中的液体培养基上，在20-25℃条件下，经振荡避光培养5天后，再经2天静止培养，见光后呈桔黄色，按上述标准挑选菌株留作原种，其余淘汰。其培养基配方马铃薯220克、蔗糖24克、磷酸二氢钾2克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁1.5克、VBl 15毫克、活蚕幼虫50克，加土壤浸出液至1000毫升，调PH8-8.5。栽培种阶段将上述原种接种在经灭菌的罐头瓶的液体培养基上，在20-25℃温度下经10-12天避光培养，见光1-2天后呈桔黄色，按上述标准挑选菌株留作栽培种，其余淘汰。其培养基配方是马铃薯250克、蔗糖20克、磷酸二氢钾2克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁1克、VBl 20毫克、奶粉30克，加土壤浸出液至1000毫升，调PH8-8.5，经过三次筛选获得的菌种再进行3次重复栽培试验，最后选出栽培母种，然后将其培养基增加1%的活蛹或幼虫体进行复壮。高产栽培在无菌室内将上述经复壮的栽培种2毫升接种在每个培养瓶的固体培养基上，在24±2℃温度下，空气相对湿度60-65%，CO2浓度0.05-0.1%避光培养10-20天，长满菌丝后移入栽培室，温度在21±2℃，空气相对湿度85-90%、CO2浓度0.03-0.05%，有明亮均匀的散射光照射，光照2千5-2万Lux，每天通风3-4次，每次20分钟左右，在瓶盖上扎眼防止子实体畸形，经3-5天即可长出子实体，在子囊孢子未大量散发时及时采收第一茬子实体。第一茬子实体采收后，将其培养基取出用无菌刀将培养基表面清理干净，露出白色菌丝，然后放回栽培瓶中，在其表面扎眼或划0.5厘米深的沟，根据其含水量多少加入10-20毫升营养液，将瓶口封好，放在24±2℃温度下，空气相对湿度60-65%，CO2浓度0.05-0.1%，避光培养5-7天，长满菌丝后，移入栽培室，温度在21±2℃，相对湿度85-90%，CO2浓度0.03-0.05%，光照2千5-2万Lux，经过3-5天即可长出子实体，在子囊孢子未大量散发时及时采收第二茬子实体，按照同样方法和条件可连续采收第三、第四茬子实体。第一茬子实体的培养基配方是大米30克，加1.7倍的土豆汁，PH8-8.5，第2-4茬的固体培养基上所加营养液配方是马铃薯250克、蔗糖20克、磷酸二氢钾1.6克、磷酸氢二钾1.4克、硫酸镁1克、VBl 20毫克、活蚕蛹30克，加土壤浸出液至1000毫升，PH8-8.5。
实施方法二蛹虫草优良菌种选育采用如实施方法一相同的方法步骤和相同的良种标准，经过母种阶段、原种阶段、栽培种阶段，再经过复壮获得种性相对稳定的栽培种。各阶段的培养基配方是母种阶段马铃薯250克、蔗糖20克、琼脂25克、蛋白胨2.5克、磷酸二氢钾2克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁1.5克、VBl 20毫克、活蚕蛹或幼虫50克，加土壤浸出液至1000毫升;原种阶段马铃薯240克、蔗糖25克、磷酸二氢钾1.8克、磷酸氢二钾1.2克、硫酸镁1.5克、VBl 15毫克、活蚕蛹30克，加土壤浸出液至1000毫升;栽培种阶段马铃薯230克、葡萄糖20克、磷酸二氢钾1.6克、磷酸氢二钾1.4克、硫酸镁1.2克、VBl 10毫克、奶粉30克，加土壤浸出液至1000毫升，PH8-8.5，选取的栽培母种，将其培养基加5%的奶粉进行复壮。高产栽培方法步骤条件同实施方法一，其第一茬子实体培养基配方是大米50克，加2-5克的奶粉(或蚕蛹蛋白)，再加1.6倍的水，调PH8-8.5，第2-4茬培养基所加营养液配方是马铃薯220克、葡萄糖25克、磷酸二氢钾2克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁1.5克、VBl 10毫克、活蚕蛹或幼虫50克，加土壤浸出液至1000毫升，PH8-8.5。
权利要求
1.一种蛹虫草优良菌种的选育及高产栽培方法，蛹虫草(cordycepsmilitaris(L)link)又名北冬虫夏草，本菌种已于1993年4月1日保藏在北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO0193，包括将新采集的蛹虫草通过常规单孢或多孢分离方法获得的原始菌株，进行人工选育和高产栽培，其操作步骤如下1.1、蛹虫草优良菌种的选育将原始菌种经过母种阶段、原种阶段和栽培种阶段三次筛选后，进行复壮；1.1.1、母种阶段先将原始菌株接种在经灭菌的试管或培养皿中的固体培养基上，避光培养7-10天，见光后呈桔黄色，根据菌落形态和镜检挑选菌丝绒毛长，均匀一致，菌丝分枝多而长、呈钝角、分生孢子呈圆形的菌株留作母种进行第一次筛选；1.1.2、原种阶段将上述母种接种在经灭菌的三角瓶中的液体培养基上经振荡、避光培养5天后，再经2天静止培养，见光后呈桔黄色，按上述标准挑选菌株留作原种，进行第二次筛选；1.1.3、栽培种阶段将上述原种接种在经灭菌的罐头瓶中的液体培养基上，经10-12天避光培养，见光1-2天后呈桔黄色，按上述标准挑选菌株留作栽培种，进行第三次筛选；1.1.4、菌种提纯复壮经过三次筛选的菌种再进行3-5次重复栽培试验，最后选出栽培母种，然后将培养基增加1-5%的活蛹或幼虫体或奶粉，进行复壮；1.2、蛹虫草的高产栽培；1.2.1、在无菌室内每个培养瓶的固体培养基上接种2毫升上述经复壮的栽培种，避光培养10-20天，长满菌丝移入栽培室，室内相对湿度85-90%，CO20.03-0.05%，光照2千5-2万lux，经3-5天即可长出子实体，在子囊孢子未大量散发及时采收；1.2.2、采收第一茬子实体后，将培养基表面用无菌刀清理干净，露出白色菌丝，在其上扎孔或划0.5厘米深的沟，注入10-20毫升营养液，将瓶口封好，在上述同样条件下经7-10天培养可长出第二茬子实体，同样方法和条件可再连续长出第三、第四茬子实体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是选育母种阶段培养基配方马铃薯21-25%、葡萄糖或蔗糖2.1-2.5%、琼脂2.1-2.5%、蛋白胨0.2-0.25%、磷酸二氢钾0.15-0.2%、磷酸氢二钾0.11-0.15%、硫酸镁0.1-0.15%、VBl 0.001-0.002%、活蚕蛹或幼虫1-5%，加土壤浸出液至100%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是选育原种阶段培养基配方是马铃薯21-25%、葡萄糖或蔗糖2.1-2.5%、磷酸二氢钾0.15-0.2%、磷酸氢二钾0.11-0.15%、硫酸镁0.1-0.15%、VBl 0.001-0.002%、活蚕蛹或幼虫1-5%，加土壤浸出液至100%，其PH值为8-8.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是选育栽培种阶段培养基配方是马铃薯21-25%、葡萄糖或蔗糖2.1-2.5%、磷酸二氢钾0.15-0.2%、磷酸氢二钾0.11-0.15%、硫酸镁0.1-0.15%、VBl 0.001-0.002%、奶粉2-3%，加土壤浸出液至100%，其PH值为8-8.5。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是高产栽培所用固体培养基配方是大米30-50克加土豆汁1.7倍，调PH8-8.5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是高产栽培所用固体培养基配方是大米30-50克加奶粉2-5克，再加水1.6倍，调PH值8-8.5。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是高产栽培所用固体培养基配方是大米30-50克，加蚕蛹蛋白2-5克，再加水1.6倍，调PH8-8.5。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是高产栽培追加营养液的配方是马铃薯21-25%、葡萄糖或蔗糖2.1-2.5%、磷酸二氢钾0.15-0.2%、磷酸氢二钾0.11-0.15%、硫酸镁0.1-0.15%、VBl 0.001-0.002%、活蚕蛹或幼虫1-5%，加土壤浸出液至100%，其PH值为8-8.5。
全文摘要
本发明涉及一种蛹虫草的良种选育及高产栽培方法。将通过常规单孢或多孢分离方法获得的原始菌株经过母种、原种、栽培种三次筛选，获得优良菌种。通过增加培养基营养成分复壮，使其菌种种性相对稳定、纯正、不易退化。该良种通过对培养基追加营养液，可连续采收3—4茬子实体，其生物转化率可达150％以上，缩短了生产周期20天以上，显著降低生产成本40％左右。
文档编号C12N1/14GK1094091SQ9411006
公开日1994年10月26日 申请日期1994年2月5日 优先权日1994年2月5日
发明者李春燕 申请人:李春燕