专利名称：表达系统、整合载体和由该整合载体转化的细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于生产葡萄糖氧化酶，特别是能影响细胞外生产葡萄糖氧化酶的表达系统。
本发明还涉及含该表达系统的整合载体，及由该整合载体转化的细胞。
有国际系统中，葡萄糖氧化酶被分为E.C.1.1.3.4或β-D-葡萄糖氧1-氧化还原酶。该酶催化β-D-葡萄糖转化为D-葡糖酸-δ-内酯的氧化反应，后者然后被水解成葡糖酸。该反应产生过氧化氢，然后在野生型曲霉属菌株生产的过氧化氢酶的作用下，过氧化氢被转化成氧和水。
丝状真菌的一些菌株，特别是曲霉属的菌株天然产生葡萄糖氧化酶。不幸地是，由这些曲霉属菌株生产的葡萄糖氧化酶不能被有效地分泌到这些菌株的培养基中，原因在于葡萄糖氧化酶不能通过其细胞壁(WITTEVEEN C.F.B.et al，Applied and Environmental Microbiology，1992，58(4)，P.1190-1194)。因此，从工业角度，认为葡萄糖氧化酶是一种胞内酶。在回收和纯化葡萄糖氧化酶前，必须将曲霉细胞膜破碎。在收获前另外施加强制力的细胞破膜步骤在工业上难以进行，此外，还会引起产率的明显下降。实际上，细胞破膜后得到的含水悬浮液含有葡萄糖氧化酶溶液和其它酶及多肽，但也含有许多更易溶或不太易溶的细胞组分。因此，包含数个分离操作过程的纯化步骤对于得到纯化或工业上可用的葡萄糖氧化酶是必需的。由于该原因，葡萄糖氧化酶的细胞外生产方法，即将酶分泌到培养基中的方法，已被寻找了很长时间。
此外，对于过氧化氢酶仅以微量存在于培养基中的葡萄糖氧化酶的生产方法已经研究了很长时间。其目的在于防止在葡萄糖氧化酶催化的反应中所生成的过氧化氢被培养基中的过氧化氢酶降解为氧和水。
本文完成了专利申请WO 89/12，675中提出的用质粒转化酵母方案。该质粒含酵母脱氢酶(ADH2-GAP)的启动子序列、黑曲霉葡萄糖氧化酶分泌信号序列或啤酒酵母α-接合因子分泌信号序列、黑曲霉葡萄糖氧化酶的成熟序列和酵母脱氢酶(GAP)的终止子。转化的酵母(啤酒酵母)分泌葡萄糖氧化酶。
在欧洲专利申请0，357，127中，描述了一个可用于生产牛凝乳酶的表达系统。该表达系统包含黑曲霉葡糖淀粉启动子序列、黑曲霉葡糖淀粉酶信号肽序列、牛凝乳酶编码序列和黑曲霉葡糖淀粉酶终止子序列。用含该表达系统的被转化的黑曲霉菌株能够制得牛凝乳酶。
目前，通过含该表达系统的被转化的丝状真菌菌株以便能够表达并有效的分泌葡萄糖氧化酶的表达系统还是未知的。
本发明的主要目的是提供能够在培养基中得到葡萄糖氧化酶的表达系统，其中培养含该表达系统的转化菌株。该表达系统基本上能够胞外生产并得到葡萄糖氧化酶。另外，使用该表达系统有可能得到实质上不含过氧化氢酶而含有葡萄糖氧化酶的酶组合物。
葡萄糖氧化酶是指一种能够催化β-D-葡萄糖转变为D-葡糖酸-δ-内酯之氧化反应的酶，后者然后被水解成葡糖酸。在国际系统中，该酶被分为查简编码E.C.1.1.3.4.或β-D-葡萄糖氧1-氧化还原酶。该定义包括天然酶和修饰的酶，如已用遗传工程技术或诱变技术修饰了其核苷酸或氨基酸序列的酶。
本发明的目的还在于提供整合载体和含上述表达系统的质粒。
本发明的目的还在于提供由上述整合载体或质粒转化的菌株，特别是被转化的曲霉菌株，更具体的是臭曲霉菌株，所述菌株表达葡萄糖氧化酶并以高水平的生产率将其分泌至培养基中。该被转化菌株分泌葡萄糖氧化酶基本上是胞外性的。
本发明的目的还在于提供用丝状真菌菌株生产葡萄糖氧化酶的方法，所述菌株产生大量的葡萄糖氧化酶并且几乎完全是胞外分泌的。
为止，本发明涉及可用于细胞外生产葡萄糖氧化酶的表达系统，其特征在于它至少含有-启动子序列-葡萄糖氧化酶分泌信号序列，和-成熟葡萄糖氧化酶序列。
通常，表达系统还含有终止子序列。在优选的变异体中，启动子序列是葡糖淀粉酶启动子序列。
本发明涉及可用于生产葡萄糖氧化酶的表达系统，其特征在于它至少含有
-臭曲霉葡糖淀粉酶启动子序列，-臭曲霉葡萄糖氧化酶分泌信号序列，-臭曲霉葡萄糖氧化酶的成熟序列，和-臭曲霉葡糖淀粉酶终止子序列。
表达系统是指整合于丝状真菌基因组中的并且能够为该真菌提供生物合成葡萄糖氧化酶所需之遗传信息的分子单位。
启动子是指转录启动子。刺激转录的DNA序列，如已知称为“增强子”或“上游激活序列”的序列可接在启动子之前，所述启动子由表现强转录活性的DNA序列组成。启动子含有影响融合的编码DNA表达的转录控制序列。基因启动子序列含有控制转录并参予基因表达的序列。
通常，启动子序列来自丝状真菌。一般它来自曲霉属菌株。它较好来自黑曲霉、臭曲霉、泡盛曲霉或米曲霉菌株。特别优选的是来自黑曲霉或臭曲霉菌株。作为葡糖淀粉酶启动子序列之来源的黑曲霉菌株和臭曲霉菌株是已知的，如，具体的是黑曲霉菌株NRRL 3(AGRICULTURAL RESEARCH SERVICE CULTURE COLLECTION(NRRL)，1815，North University Street，Peoria，Illinois 61604，USA)，黑曲霉菌株ATCC 13496(AMERICAN TYPECULTURE COLLECTION，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852-1776，USA)，黑曲霉菌株ATCC 22343，黑曲霉菌株ATCC 46890，臭曲霉菌株ATCC 10254和臭曲霉菌株ATCC 14916。葡糖淀粉酶启动子序列较好来自臭曲霉菌株。作为特定优选方案，它来自臭曲霉菌株SE4。含核苷酸序列SEQ ID No7的DNA分子编码臭曲霉菌株SE4启动子。
本发明还涉及臭曲霉葡糖淀粉酶启动子。更具体地说，本发明涉及含核昔酸序列SEQ ID NO7的DNA分子，该序列编码臭曲霉SE4葡糖淀粉酶启动子。
葡萄糖氧化酶分泌信号序列是指相应于与成熟葡萄糖氧化酶序列的氨基末端天然可操作相连之氨基酸序列的DNA序列。已经克隆和定序了编码葡萄糖氧化酶的基因，由此推断的氨基酸序列表明存在具有某些信号肽特征的前序列，但更为复杂(WHITTINGTONH.et al，Curr.Genet.，18(1990)，P.531-536)。鉴于此，在本申请中，将编码假定之信号肽的结构基因部分称为“葡萄糖氧化酶分泌信号序列”，将编码这种葡萄糖氧化酶的结构基因部分称为“成熟葡萄糖氧化酶序列”。
通常，葡萄糖氧化酶分泌信号序列通常来自丝状真菌菌株。一般是来自曲霉属菌株或青霉属菌株。它较好来自曲霉属菌株，例如，具体的是黑曲霉、臭曲霉、泡盛曲霉或米曲霉菌株。特别优选的是它来自黑曲霉菌株或臭曲霉菌株。用黑曲霉菌株NRRL 3(AGRICULTURAL RESEARCH SERVICE CULTURE COLLECTION (NRRL)，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604，USA)的葡萄糖氧化酶分泌信号序列已得到了良好的结果。在The Journal of Biological Chemistry，1990，265(7)，P.3793-3802中公开了该序列。用臭曲霉菌株ATCC 14916(AMERICAN TYPECULTURE COIIECTION，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland20852-1776，USA)的葡萄糖氧化酶分泌信号序列也已得到了良好的结果。
根据本发明的表达系统含有成熟葡萄糖氧化酶序列。成熟葡萄糖氧化酶序列是指可以被转译为活性蛋白质的部分序列，也就是说葡萄糖氧化酶编码序列相应于没有分泌信号序列的葡萄糖氧化酶结构基因。编码序列(结构基因)包含分泌信号序列和成熟葡萄糖氧化酶序列。
通常，成熟葡萄糖氧化酶序列来源于丝状真菌的菌株。它一般是来自曲霉属菌株或青霉属菌株。它较好是来自曲霉属菌株，如具体的有黑曲霉、臭曲霉，泡盛曲霉或米曲霉菌株。特别优选的是它来自黑曲霉菌株或臭曲霉菌株。用黑曲霉菌株NRRL 3的成熟葡萄糖氧化酶序列已得到了良好的结果。已在The Journal of Biological Chemistry，1990，265(7)，P.3793-3802中公开了该序列。用臭曲霉菌株ATCC14916(AMERICAN TYPE CUITURE COIIECTION)的成熟葡萄糖氧化酶也已得到了良好的结果。
在本发明优选的变异体中，葡萄糖氧化酶分泌信号序列和成熟葡萄糖氧化酶序列来自相同的丝状真菌。用本发明的表达系统已得到很好的结果，所述表达系统含有臭曲霉菌株ATCC 14916的葡萄糖氧化酶分泌信号序列和臭曲霉菌株ATCC 14916的成熟葡萄糖氧化酶序列。用本发明的表达系统已得到很好的结果，该表达系统含有黑曲霉菌株NRRL 3的葡萄糖氧化酶分泌信号序列和黑曲霉菌株NRRL 3的成熟葡萄糖氧化酶序列。
终止子是指转录终止子。基因的终止子序列是起终止该基因转录作用的DNA序列。终止子序列还含有稳定mRNA的聚腺苷酸化信号。
通常，终止子序列来源于丝状真菌。在本申请中，任何在丝状真菌中有功能的终止子都可以使用。终止子是本领域专业人员熟知的。作为已知的真菌来源终止子，可提到的有trpC终止子，葡糖淀粉酶、淀粉酶、α-淀粉酶、天冬氨酸蛋白酶、酸性磷酸酶、脂酶、纤维素酶、糖酵解酶、葡聚糖酶、水解酶和脱氢酶的终止子，且特别是构巢曲霉trpC终止子、黑曲霉葡糖淀粉酶终止子、黑曲霉α-淀粉酶、米赫毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉酸性磷酸酶和构巢曲霉醇脱氢酶的终止子。通常，终止子序列来自曲霉菌株、较好来自黑曲霉、臭曲霉、泡盛曲霉或米曲霉菌株。特别优选的是它来自黑曲霉菌株或臭曲霉菌株。在优选的方案中，终止子是葡糖淀粉酶终止子序列。葡糖淀粉酶终止子序列较好来源于臭曲霉菌株。特别优选的是它来自臭曲霉菌株SE4。含核苷酸序列SEQ ID NO8的DNA分子编码臭曲霉菌株SE4终止子。
本发明还涉及臭曲霉葡糖淀粉酶终止子。更具体地说，本发明涉及含核昔酸序列SEQ ID NO8的DNA分子，该序列编码臭曲霉SE4葡糖淀粉酶终止子。
在本发明的优选方案中，葡糖淀粉酶启动子序列和葡糖淀粉酶终止子序列来源于相同的丝状真菌。用本发明含臭曲霉菌株葡糖淀粉酶启动子序列和臭曲霉菌株葡糖淀粉酶终止子序列的表达系统，已得到了良好的结果。用本发明含臭曲霉菌株SE4葡糖淀粉酶启动子序列和臭曲霉菌株SE4葡糖淀粉酶终止子序列的表达系统已得到了很好的结果。
优选的是，在本发明的表达系统中，启动子序列位于分泌信号序列的上游，后者本身位于成熟序列的上游，该成熟序列则位于终止子序列的上游。在适当条件下，以在转录信号即启动子和终止子的控制下，允许表达葡萄糖氧化酶的方式选定这些位置。
优选的是，表达系统中包括的序列是经操作相连的。启动子序列经操作与葡萄糖氧化酶分泌信号序列相连。葡萄糖氧化酶分泌序列与成熟葡萄糖氧化酶序列可操作地相连。成熟葡萄糖氧化酶序列与终止子序列可操作地相连。
本发明还涉及制备表达系统的方法，该表达系统至少含有启动子序列、葡萄糖氧化酶分泌信号序列、成熟葡萄糖氧化酶序列和终止子序列。该方法包括-从产生该葡萄糖氧化酶的微生物的基因组DNA中分离葡萄糖氧化酶分泌信号序列和成熟葡萄糖氧化酶序列，以及-将葡萄糖氧化酶分泌信号序列和成熟葡萄糖氧化酶序列导入含启动子序列和终止子序列的载体中，在选择的位点完成该导入以便使定位的序列在所述启动子和所述终止子的控制下完成葡萄糖氧化酶的表达。本发明还涉及含上述表达系统并能够表达葡萄糖氧化酶的整合载体。
本发明的原则也适用于含有如上限定的表达系统，并能够允许表达葡萄糖氧化酶的表达载体。
整合载体是指含有完整的基因表达单位的任何DNA序列。完整的基因表达单位是指结构基因和启动子区域及调节转录和转译所需的区域。结构基因是指用于转录成RNA并能使宿主合成蛋白质的编码序列。
该整合载体较好是质粒。已用质粒pFGOD得到了良好的结果。
本发明还涉及用上述整合载体转化的被转化细胞(宿主细胞)。选择转化的细胞以使在表达系统所包括的启动子序列和终止子序列可以被该被转化细胞识别，即它们对于该被转化细胞来说是相容而且可发挥功能的，表达系统中所包括的启动子序列和终止子序列对于被转化细胞可以完成其作为启动子和终止子的相应转录信号功能。
通常，被转化细胞是丝状真菌细胞。被转化细胞一般是曲霉属细胞。特别优选的是被转化细胞是黑曲霉、臭曲霉、泡盛曲霉或米曲霉细胞。用转化的黑曲霉细胞，特别是用转化的黑曲霉菌株NRRL 3细胞已得到了良好的结果。用转化的臭曲霉细胞，特别是用转化的臭曲霉菌株SE4细胞已得到了很好的结果。
在本发明优选的方案中，用整合载体转化的细胞得自启动子序列和/或终止子序列，表达系统中所包含的序列由之来源的菌株。用转化的臭曲霉SE4细胞已得到了很好的结果。用整合载体转化的所述细胞含本发明的表达系统，该表达系统含有臭曲霉SE4启动子序列和臭曲霉SE4终止子序列，更具体地说是臭曲霉SE4葡糖淀粉酶启动子序列和臭曲霉SE4葡糖淀粉酶终止子序列。用由整合载体pFGOD转化的细胞已得到了最好的结果。
丝状真菌是指包括真菌门所有丝状形式的真核微生物。该门中包括接合菌、子囊菌、担子菌和包括丝孢菌属在内的半知真菌。该门中包括下列属曲霉属、木霉属(Trichoderma)，链孢菌属，束柄霉属(Podospora)，疫病霉属，旋孢霉属，Pyricularia，青霉属和腐质霉属。
本发明还涉及纯化和分离的臭曲霉菌株SE4tr。由菌株SE4得到该被转化的菌株SE4tr。它与菌株SE4的不同在于其基因组中整合有质粒pFGOD的一个或多个拷贝。
由臭曲霉菌株ATCC 14916经诱变得到臭曲霉菌株SE4，并基于改善的葡糖淀粉酶生产率筛选之。
名称臭曲霉是与枸橼曲霉同义的(ATCC Names of Indurtrial Fungi，1994，P.120，American Type Culture Collection出版)。
本发明还涉及细胞外生产葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于它包括下列步骤-在允许葡萄糖氧化酶表达和分泌的条件下，用含上述表达系统的整合载体转化细胞，-在适当的培养基中培养被转化的细胞，以及-回收所分泌的葡萄糖氧化酶。
培养转化细胞后得到的发酵培养基含大量的葡萄糖氧化酶。事实上，被转化菌株基本上将葡萄糖氧化酶都分泌至培养基中。由本发明方法得到的葡萄糖氧化酶是细胞外的。
培养转化的细胞后得到的发酵培养基实质上不含过氧化氢酶。这使得含葡萄糖氧化酶的酶组合物基本上没有过氧化氢酶。
本发明还涉及由上述被转化细胞生产的葡萄糖氧化酶。
葡萄糖氧化酶有许多工业应用，如用于食品工业，药品工业和化学工业。
特别是可用其检测血葡萄糖水平，可以将其掺入用于该目的的诊断药盒中。由于未受到过氧化氢酶的污染，根据本发明得到的葡萄糖氧化酶在该应用方面具有其优点。
可以用葡萄糖氧化酶检测葡萄糖和氧浓度。
可以用葡萄糖氧化酶作为抗氧化剂除去氧或葡萄糖特别是某些食品或饮料中的氧或葡萄糖。
也可将葡萄糖氧化酶掺入牙膏中以防止龋齿。
将葡萄糖氧化酶掺入染料中以防止腐蚀。
图1是质粒pUCGOD的限制图谱。
图2是质粒pFGA1的限制图谱。
图3是质粒pFGA2的限制图谱。
图4是质粒pFGA2MUT的限制图谱。
图5是质粒pFGOD的限制图谱。
图6(图6a和图6b)是编码臭曲霉SE4葡糖淀粉酶启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO7)。
图7是编码臭曲霉SE4葡糖淀粉酶终止子的核苷酸序列(SEQ ID No8)。
表1中解释了这些图中所用的符号和缩写符号。
表1
用下列实施例举例说明本发明。
实施例1分离臭曲霉ATCC 14916葡萄糖氧化酶编码序列在含2%(重量/体积)麦芽提取物，0.1%(重量/体积)胨(DIFCO)和2%(重量/体积)葡萄糖的ACM(“曲霉属完全培养基”)液体营养培养基中制备臭曲霉菌株ATCC 14916的培养物。32℃保温48小时后收获菌丝体。
按照GARBER，R.C.and YODER，O.L.，Anal.Biochem.135(1983)，P.416-422中描述的技术分离臭曲霉菌株ATCC 14916基因组DNA。
制备下列混合物蒸馏水 62μlPCR缓冲液(10X) 10μldNTPs(各2.5mM) 8μl寡核苷酸 SEQ ID NO1(20μM) 5μl寡核苷酸 SEQ ID NO2(20μM) 5μl基因组DNA(稀释度10-1到10-4) 10μlTaq聚合酶(5U/μl) 0.2μlPCR缓冲液，称为“(10X)反应缓冲液组合物”，缩写字dNTPs是指所有核苷酸dATP，dTTP，dGTP和dCTP，在以商品名称“GENEAMP DNA AMPLIFICATION REAGENT KIT With AMPLITAQ Recombinant Taq DNA Polymerase”(PERKIN ELMER CETUS)出售的药盒说明书中描述了产品Taq聚合酶。
在该混合物中以1μg/μl的浓度使用从臭曲霉菌株ATCC 14916中分离的基因组DNA。
按PCR技术(在SAIKI，R.K.et al.，SCIENCE，239(1988)，P.487-491中描述了“聚合酶链反应技术”)分离臭曲霉ATCC 14916葡萄糖氧化酶编码序列。
在该研究中所用的合成寡核苷酸序列如下 序列SEQ ID NO2是序列SEQ ID NO3的互补序列。
寡核苷酸SEQ ID NO1的序列包含有BamHI和NotI限制性位点的信息、SE4葡糖淀粉酶非转译5′区和葡萄糖氧化酶编码序列起始区的信息。
寡核昔SEQ ID NO2及其互补链，寡核苷酸SEQ ID NO3的序列含有相应于葡萄糖氧化酶编码序列之末端的核苷酸及Hind Ⅲ限制性位点的附加信息。
BEAUCAGE，S.L.et al.，(1981)，Tetrahedron Letters，22，P.1859-1882中描述了用于在BIOSEARCH CYCLONE SYNTHESIZER装置中使用β-氰乙基磷酰胺酸酯构建合成寡核苷酸的技术。
PCR条件如下95℃2分钟，然后30个循环的95℃1分钟、60℃1分钟和72℃2分钟;然后是72℃10分钟，再保持在20℃。该PCR使用的所有其它参数参照以名称“GENEAMP DNA AMPLIFICATION REAGENT KIT with AMPLITAQ Recombinant Taq DNA Polymerase”(PERKIN ELMER CETUS)出售的药盒说明书中的描述。
按上述方法分离约1.8kb的DNA片段(1kb＝1000个碱基对)。用限制性分析技术(参见Molecular Cloning-a Laboratory manual-MANIATIS et al.，(Cold Spring Harbor Laboratory)1982，P.374-379)与The Journal of Biological Chemistry，1990，265(7)，P.3793-3802中公开的序列比较。未发现实质性区别。
用限制酶BamHI和Hind Ⅲ消化由此得到的DNA片段，然后按Molecular Cloning-a laboratory manual-SAMBROOK et al.，2th Edition，1989，P1.68-1.69中的描述连接技术，与预先在BamH I和Hind Ⅲ位点消化过的质粒PUC18(CLONTECH Laboratories，No.6110-1)相连。由此得到载体PUCGOD(图1)。
实施例2构建质粒pFGA2MUT质粒pFGA2MUT(图4)含臭曲霉SE4葡糖淀粉酶基因，其中已在启动子和葡糖淀粉酶基因的编码部分之间产生了一个NotⅠ克隆位点，并在葡糖淀粉酶基因的编码部分和终止子之间产生了一个Hind Ⅲ克隆位点。这两个克隆位点，即NotⅠ和Hind Ⅲ是按下述诱变技术产生的。
按下述方法分离臭曲霉SE4葡糖淀粉酶基因。按实施例1中描述的GARBER等人的技术分离臭曲霉菌株SE4染色体DNA。用限制酶Sau ⅢA部分消化该分离的染色体DNA。按AUSUBEL，F.M.等人(1989)在Current Protocols in Molecular Biology(John WILLEY and Sons)，P5.3.2-5.3.8中描述的技术，用蔗糖梯度(15-40%)分离并纯化8到10kb的片段。然后将这些分离并纯化的片段导入预先用限制酶BamHⅠ消化过的质粒pBR322(CLONTECH LABORATORIES catalogue No.6210-1)中。然后，转化E.coli菌株DH5α(由HANAHAN，D.，J.Mol.Biol.(1983)166 P557-580描述并由BETHESDA REASEARCH LABORATORIES(BRL)出售，B.R.L.Focus(1986)8，P.9)。
使用下列合成的寡核苷酸(SEQ ID NO4)借助杂交技术(SAMBROOK et al.，P.9.52-9.55)筛选约15，000个转化的E.coli克隆5′-GATTCATGGTTGAGCAACGAAGCGA-3′选择是以BOEL等人(EMBO J.3(1984)，P.1097-1102)公开的葡糖淀粉酶核苷酸序列为基础的。
分离与该寡核苷酸杂交的菌落。分析限制性位点，发现该菌株含有完整的葡糖淀粉酶基因，即启动子、终止子、编码区以及分泌信号。
按上述方法将8.7kb片段导入质粒pBR322的BamHⅠ位点。
由此产生含8.7kb曲霉属DNA插入片段的载体pFGA1(图2)。该插入片段只在质粒pBR322和载体pFGA1之间有区别。
按下列步骤构建得自载体pFGA1并含有比载体pFGA1者较小的插入片段的质粒。用限制酶EcoRⅠ消化载体pFGA1，然后按ZHU等人(1985)描述的方法，从该消化产物中分离含臭曲霉SE4葡糖淀粉酶启动子、编码区和终止子的大小约5kb的EcoRⅠ片段。
然后将该EcoRⅠ片段插入预先用限制酶EcoRⅠ消化过的质粒pUC18中。由此得到载体pFGA2(图3)。
用SANGER等人(1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，P5463-5467)的双脱氧核苷酸链终止法测定臭曲霉SE4葡糖淀粉酶启动子和终止子的核苷酸序列。
该序列分析表明存在启动子和终止子。鉴定编码臭曲霉SE4葡糖淀粉酶启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO7)。鉴定编码臭曲霉SE4葡糖淀粉酶终止子的核苷酸序列(SEQ ID NO8)。
图6显示编码臭曲霉SE4葡糖淀粉酶启动子的核苷酸序列。
图7显示编码臭曲霉SE4葡糖淀粉酶终止子的核苷酸序列。
用BEAUCAGE等人(1981，Tetrahedron Letters 22，P.1859-1882)的方法合成用于以T7 DNA聚合酶开始延长反应的合成寡核苷酸。按定序药盒(PHARMACiA)供应商提供的方法完成序列测定，然后用NaOH处理使双链DNA变性。
SAMBROOK(1989，P13.15和13.17)描述了序列测定策略。按SAMBROOK(1989，P.13.45-13.58)描述的技术制备聚丙烯酰胺序列测定凝胶。
按下述方法构建得自质粒pFGA2并含有臭曲霉SE4葡糖淀粉酶基因的质粒，所述基因中的启动子和终止子是由NotⅠ和Hind Ⅲ限制位点与编码部分分开的。由此在含启动子和终止子的质粒pFGA2中产生两个限制性位点，NotⅠ和Hind Ⅲ。由NotⅠ和Hind Ⅲ限制位点将臭曲霉SE4葡糖淀粉酶启动子和终止子分开，所述位点是按照诱变药盒(BIORAD)“MUTA-GENE PHAGEMID in Vitro Mutagenesis Kit”技术说明书中描述的方法经两次定点诱变而产生的。
该方法中所用的合成寡核苷酸分别是下列SEQ ID NO5和SEQ ID NO6 由此得到载体pFGA2MuT，它含有位于葡糖淀粉酶基因5′非转译区开始处的NotⅠ限制位点和位于终止密码子后并在葡糖淀粉酶3′非转译区中的Hind Ⅲ裂解位点。
实施例3构建整合载体用两种限制酶NotⅠ和Hind Ⅲ消化按实施例1中所述方法得到的质粒pUCGOD后，按ZHU J.D.等人(BIO/TECHNOLOGY，3，1985，P.1014-1016)所述的技术分离含有臭曲霉SE4葡糖淀粉酶基因的葡萄糖氧化酶编码序列和5′非转译区的片段。
按SAMBROOK等人(1989，Chapters 5.28-5.32)描述的技术用限制酶部分和完全消化该质粒。
将该片段导入按实施例2所述方法得到的质粒pFGA2MuT的NotⅠ-Hind Ⅲ克隆位点中。该质粒含有由NotⅠ和Hind Ⅲ克隆位点分开的臭曲霉SE4葡糖淀粉酶基因的启动子和终止子，其中所述位点是经定点诱变产生的。因此以葡萄糖氧化酶编码部分取代了葡糖淀粉酶编码部分。
由此得到载体pFGOD(图5)。该载体pFGOD含有其在臭曲霉葡糖淀粉酶转录信号控制下的葡萄糖氧化酶编码序列，后者包括其自己的分泌信号。该载体含有包括下列序列的表达系统-臭曲霉SE4葡糖淀粉酶启动子序列，-臭曲霉ATCC 14916葡萄糖氧化酶分泌信号序列，-臭曲霉ATCC 14916葡萄糖氧化酶的成熟序列，和-臭曲霉SE4葡糖淀粉酶终止子序列。
实施例4转化臭曲霉菌株SE4臭曲霉菌株SE4得自臭曲霉菌株ATCC 14916。
首先按PONTECORVO，G.，ROPER，J.A.，HEMMONS，L.M.MACDONALD，K.D.and BUFTON，A.W.J.，Adυances in Genetics5(1953)，P.141-238中描述的技术，用紫外光诱变处理臭曲霉菌株ATCC 14916。
将处理过的菌株放在加有淀粉(5%重量/体积)的琼脂营养培养基POTATO DEXTROSE AGAR (DIFCO)上。32℃温育48小时后，取出有最大淀粉水解晕环的菌落，然后在琼脂营养培养基上再培养之。分离生产大量葡糖淀粉酶的菌株。该菌株称为SE4，具有淡棕色分生孢子。按CARREZ等人(GENE，94(1990)，P.147-154)中描述的技术，经共转化将载体pFGOD导入臭曲霉菌株SE4中。
用含构巢曲霉乙酰胺酶基因(amds)的质粒p3SR2作为选择标志。
在Hynes，M.J.，Corrick，C.M.，and King，J.A.，Mol.Cell.Biol.，3(1983)，P.1430-1439中描述了质粒p3SR2。按KELLY，J.M.和HYNES，M.J.(EMBO J.4(1985)，P.475-479)描述的方法用该质粒进行转化。
用等摩尔量的质粒p3SR2和pFGOD转化臭曲霉菌株SE4。
得到约350个转化菌株。在含ABTS(BOEHRINGER)的琼脂培养基A上选择这些转化菌株以检测葡萄糖氧化酶的产生。在32℃温育2小时后，在也将葡萄糖氧化酶分泌至培养基中的转化菌株之菌落周围环绕-绿色晕环。
培养基A由CZAPEK DOX AGAR培养基(DIFCO)组成，其中加有10%(重量/体积)葡萄糖，0.05%(重量/体积)ABTS(2，2′-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐))(BOEHRINGER)和8mg/l辣根过氧化物酶(46红酚单位/mg，SIGMA)。
约40%的转化菌株分泌葡萄糖氧化酶，因此，它们在其基因组中已有整合的可选择载体p3SR2和整合载体pFGOD。
实施例5分离并纯化转化的菌株分离出呈现有最大晕环的转化菌株，然后在琼脂培养基POTATO DEXTROSE AGAR(DIFCO)中次培养之。在该培养基上，于32℃培养50个已转化的菌株直到孢子形成。
收获孢子，在生理溶液中稀释，然后铺在琼脂培养基A上，以便得到单个菌落。在琼脂培养基POTATO DEXTROSE AGAR上再培养来自单个孢子并有大晕环的菌落。在该琼脂培养基上于32℃培养这些菌落直到孢子形成。
收获并贮存被转化菌株的纯化分生孢子。这些臭曲霉的转化菌株被定名为SE4tr。
实施例6由转化的菌株臭曲霉SE4tr产生葡萄糖氧化酶在含麦芽提取物(DIFCO)(2%重量)，胨(DIFCO)(0.1%重量)，水解淀粉(10%重量)和碳酸钙(3.5%重量)的富集液体培养基中培养基中培养实施例5中得到的纯化的分生孢子。加入氨水将培养基的pH调至pH6。于32℃搅拌培养并监测5天。
然后将得到的培养物以5，000rpm离心15分钟(BECKMAN JA-10)。按FIEDUREK，J.等人(Enzyme Microb.Technol.8(1986)，P.734-736)描述的方法，经磨碎用液氮冷冻过的生物量，以破碎细胞后，测量生物量(所谓细胞内生产)和上清液(所谓细胞外生产)的酶(葡萄糖氧化酶)活性。
将得到的酶促活性的结果与未转化的臭曲霉(菌株SE4)的进行比较。转化菌株(菌株SE4tr)细胞内生产的葡萄糖氧化酶是未转化菌株(菌株SE4)的5到10倍，细胞外生产量为5000到10，000倍。
观察到细胞外葡萄糖氧化酶生产量的有很大的提高。实际上，转化的菌株将其生产的几乎所有葡萄糖氧化酶均分泌至培养基中。未转化的菌株生产的葡萄糖氧化酶则几乎不能分泌到培养基中。因此，未转化菌株的细胞破碎步骤对于葡萄糖氧化酶的回收是必需的，而根据本发明对于转化菌株则没有必要。已转化菌株SE4tr的葡萄糖氧化酶生产基本上是细胞外的。
此外，在培养已转化菌株SE4tr后得到的发酵培养基上清液中，几乎检测不到过氧化氢酶。
实施例7pH对已转化菌株SE4tr产生葡萄糖氧化酶之活性的影响在缓冲液中并于25℃下，不同的pH值(3.5到9.0)下测量葡萄糖氧化酶的酶促活性。适用条件同实施例6中所述。
使用实施例6中得到的上清液。根据pH和酶活性在蒸馏水中稀释该上清液，然后对于pH3.5到5.5的条件用0.1M柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液，对于pH6.0到9.0用0.1M KH2PO4/K2HPO4缓冲液。
在25℃将2.5ml底物水溶液加到50μl稀释的上清液中。底物的水溶液含10%(重量/体积)葡萄糖，0.05%(重量/体积)ABTS和12mg/l辣根过氧化物酶。对于pH3.5到5.5用0.1M柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液或对于pH6.0到9.0用0.1M KH2PO4/K2HPO4缓冲液调整底物水溶液的pH。
温育2分钟后，在420nm处测吸光率。
结果列于表2中。
在该试验中，对在25℃和pH约5.5条件下的样品测到了最大酶促活性。通过定义，指定该样品为100%的相对活性。
该实施例表明，在约4.0和约7.0之间的pH下，于25℃测到的葡萄糖氧化酶表现出最佳酶促活性。
pH对已转化菌株产生的葡萄糖氧化酶活性的影响程度与对未转化菌株产生的葡萄糖氧化酶，即天然酶促活性的影响相似。
实施例8温度对已转化菌株SE4tr产生的葡萄糖氧化酶促活性的影响在0.1M KH2PO4/K2HPO4(pH6.0)缓冲液中，于不同温度(从20至50℃)下测定葡萄糖氧化酶的酶促活性。使用实施例6中描述的条件。
用实施例6中得到的上清液。根据pH和酶促活性在蒸馏水中，然后在0.1M KH2PO4/K2HPO4缓冲液中稀释上清液。将2.5ml底物水溶液加到50μl稀释的上清液中。底物水溶液含10%(重量/体积)葡萄糖，0.05%(重量/体积)ABTS和12mg/l辣根过氧化物酶。用0.1M KH2PO4/K2HPO4缓冲液将底物水溶液的pH调至6.0。在混合前，将底物水溶液和稀释的上清液加热至所需的温度。
温育2分钟后，在420nm测吸光度。
结果列于表3中。
在该试验中，在约pH6.0和35℃条件下的样品中测到最大酶促活性。因此指定该样品为100%的相对活性。
本实施例表明，在约pH6.0和约20到50℃之间的温度下测到的葡萄糖氧化酶表现有最佳酶促活性。
温度对已转化菌株生产的葡萄糖氧化酶的影响程度与对未转化菌株生产的葡萄糖氧化酶，即天然酶的影响相似。
实施例7和8表明已转化菌株生产的葡萄糖氧化酶的特征与未转化菌株生产的葡萄糖氧化酶的特征相似。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人(A)名称SOLVAY(socⅠé Té Anonyme)(B)街道rue du Prince Albert，33(C)城市布鲁塞尔(E)国家比利时(F)邮政编码1050(G)电话(02)509.61.11(ⅱ)发明题目表过系统、整合载体和由该整合载体转化的细胞(ⅲ)序列数目8(ⅳ)计算机可读形式(A)介质类型盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOSMS-DOS(2)SEQ ID NO1的资料(ⅰ)序列特征(A)长度63个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(合成寡核苷酸)
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1 (2)INFORMATTON FOR SEQ ID NO2SEQ ID NO2的资料(ⅰ)序列特征(A)长度51个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(合成的寡核苷酸)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2TCGATGAAGC TTCACTCACT GCATGGAAGC ATAATCTTCC AAGATAGCAT C 51(2)SEQ ID NO3的资料(ⅰ)序列特征(A)长度51个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(合成的寡核苷酸)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3
GATGCTATCT TGGAAGATTA TGCTTCCATG CAGTGAGTGA AGCTTCATCG A 51(2)SEQ ID NO4的资料(ⅰ)序列特征(A)长度25个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(合成的寡核苷酸)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4GATTCATGGT TGAGCAACGA AGCGA 25(2)SEQ ID NO5的资料(ⅰ)序列特征(A)长度49个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(合成的寡核苷酸)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5GCCTGAGCTT CATCCCCAGC GCGGCCGCAT CATTACACCT CAGCAATGT 49
(2)SEQ ID NO6的资料(ⅰ)序列特征(A)长度50个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(合成的寡核苷酸)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6TGACTGACAC CTGGCGGTGA AAGCTTCAAT CAATCCATTT CGCTATAGTT 50(2)SEQ ID NO7的资料(ⅰ)序列特征(A)长度2045个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7
(2)SEQ ID NO8的资料(ⅰ)序列特征(A)长度1035个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8
权利要求
1.可用于细胞外生产葡萄糖氧化酶的表达系统，其特征在于它含有-启动子序列，-葡萄糖氧化酶分泌信号序列，-成熟葡萄糖氧化酶序列，和-终止子序列。
2.根据权利要求1的表达系统，其特征在于所述启动子序列是葡糖淀粉酶启动子序列且所述终止子序列是葡糖淀粉酶终止子序列，这些序列都来源于丝状真菌菌株。
3.根据权利要求1或2的表达系统，其特征在于葡萄糖氧化酶分泌信号序列和成熟葡萄糖氧化酶序列都来源于丝状真菌菌株。
4.根据权利要求2或3的表达系统，其特征在于丝状真菌菌株是曲霉属菌株。
5.根据权利要求4的表达系统，其特征在于所述曲霉属菌株是臭曲霉菌株。
6.根据权利要求1的表达系统，其特征在于所述葡糖淀粉酶启动子序列和葡糖淀粉酶终止子序列来源于臭曲霉菌株SE4。
7.根据权利要求1的表达系统，其特征在于所述葡萄糖氧化酶分泌信号序列和成熟葡萄糖氧化酶序列来源于臭曲霉菌株ATCC14916。
8.含有根据前述权利要求之任一项的表达系统，并且允许表达葡萄糖氧化酶的整合载体。
9.根据权利要求8的整合载体，其特征在于它是一种质粒。
10.质粒pFGOD。
11.由权利要求8或9的整合载体或权利要求10的质粒转化的细胞。
12.根据权利要求11的被转化细胞，其特征在于它是丝状真菌细胞。
13.根据权利要求12的被转化细胞，其特征在于所述丝状真菌细胞是曲霉属细胞。
14.根据权利要求13的被转化细胞，其特征在于所述曲霉属细胞是臭曲霉细胞。
15.细胞外生产葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于它包括下列步骤-在允许表达和分泌葡萄糖氧化酶的条件下，用含有根据权利要求1到7中任一项的表达系统的整合载体转化细胞，-在适当的培养基中培养已转化细胞，和-回收分泌的葡萄糖氧化酶。
16.分离并纯化的臭曲霉菌株SE4tr。
17.臭曲霉葡糖淀粉酶启动子。
18.含有核苷酸序列SEQ ID No7的DNA分子，该序列编码臭曲霉SE4葡糖淀粉酶启动子。
19.臭曲霉葡糖淀粉酶终止子。
20.含有核苷酸序列SEQ ID No8的DNA分子，该序列编码臭曲霉SE4葡糖淀粉酶终止子。
21.由根据权利要求11，12，13和14中任一项的已转化细胞生产的葡萄糖氧化酶。
全文摘要
本发明涉及可用于细胞外生产葡萄糖氧化酶的表达系统，该系统包括启动子序列、葡萄糖氧化酶分泌信号序列、成熟葡萄糖氧化酶序列及终止子序列。本发明还涉及含有该表达系统的整合载体及用该载体转化的细胞。
文档编号C12N15/80GK1111676SQ9510267
公开日1995年11月15日 申请日期1995年1月28日 优先权日1994年1月28日
发明者D·卡雷茨, J·卢斯 申请人:索尔维公司