专利名称：肾综合征出血热病毒的基因检测方法及检测试剂盒的制作方法
肾综合征出血热(HFRS)是由肯尼亚病毒科汉坦病毒属(HantaVirms)中某些病毒引起的人类急性传染病。汉坦病毒为单链、分L、S、M三节段的负链RNA(核糖核酸)病毒。目前该病毒的实验室诊断是用免疫萤光法(IFA)、空斑减少中和试验(PRNT)或酶标法检测出血热抗体IgG、IgM。因人体感染出血热病毒后，迅速发生免疫反应，产生抗体，免疫检测是主要病原检测手段，但此种方法，存在人为偏差因素及试剂本身的问题，常常出现假阴性、假阳性结果，导致误诊或漏诊。
近年来迅猛发展的聚合酶链式反应技术(PCR法，又称基因检测法)是从核酸水平上检测病毒。PCR法灵敏度高，特异性强，能在早期的临床标本中直接检测病原体，如肺炎杆菌、结核杆菌幽门螺杆菌、各型肝炎病毒等。各种基因诊断试剂盒进入了临床实验室，然而迄今为止，尚未有以病人血清为标本，用PCR法直接检测肾综合征出血热病毒的技术。
近年来有国内外学者应用PCR技术对HFRS病原体--汉坦病毒进行基因分型的报道。将其(血清型别)分为9种型别，而我国至少存在有汉坦型(I型)和汉城型(II型)二种血清型。国内各地区以两型混合感染者为多。汤一苇等人将76-118(野鼠型病毒株)接种于Vero-E6细胞，常规培养7-10天，待病毒大量增殖后，刮片行IFA检测，检查病毒感染状态为-的Vero-E6细胞，用酚一氯仿法提取全细胞RNA、再用反转录、PCR扩增，进行汉坦病毒的基因分型，PCR扩增引物是核苷酸位置 引物序列primer130-49CAA TCA GCA ACA TGG GGA TAprimer2 648-631 AAT ATC AAA GAT CCC ATG此法具有高度的特异性、可重复性。中国预防医学科学院病毒研究所也有文报道此方面的研究，李盈盈、杭长寿等人以中国、韩国、日本等国内外不同地区和宿主来源的25株病毒进行了基因分型，以Vero-E6细胞用于病毒的增殖和RNA提取，细胞按常规培养成单层后，感染病毒，换取含2％的小牛血清维持液，37℃培养7-14天，IFA检查感染状况。以感染状态为-的Vero-E6细胞，用4mol/L异硫氰酸胍等作为裂解液提取全细胞RNA，再反转录成cDNA，后用I型(汉坦型)和II型(汉城型)两种分型引物进行体外扩增，产物经凝胶电泳，核苷酸序列分析和打点杂交等技术证实其特异性。
免疫莹光法和空斑减少中和试验，对少量抗原的直接检测不够灵敏，现有技术中无论采用何种宿主的出血热病毒血清为标本都须先进行动物或细胞培养，再分离病毒，进行PCR分析。存在的问题是病毒细胞的培养费时、费力、实验条件代价高，操作要求严格而繁复，有危险性，不可能在一般的实验室中开展，这对于基层医院来说存在着相当的困难。HFRS的疫区范围波及欧、亚洲等世界各地，在我国是除病毒性肝炎外危害最大的一种传染病之一，上海浦东地区也是该病的高发区，如何防治HFRS，以及早诊断、早治疗对浦东的开发开放具有重要意义，为此，上海市科委在我院建立了上海市第一期医学领先学科流行性出血热特色专科，并立上PCR技术对汉坦病毒的检测研究及中西医结合治疗的科研项目。
本发明的目的在于提供一种以出血热病毒患者的血清为标本，无需以动物或细胞用于病毒增殖，而是直接从患者血清中提取RNA病毒，用PCR技术检测肾综合征出血热病毒基因的方法以及它的检测试剂盒。
本发明的目的通过如下技术实现。
在整个基因扩增过程中RNA的提取是至关重要的，我们引用汤一苇的经典方法，以酚-氯仿法提取RNA，以其对76-118病毒分型设计的一对引物进行扩增，经反复实验证实，经典的方法对于未经Vero-E6细胞培养的临床标本来说很难得到实验所需的病毒RNA。经用4M异硫氰酸胍作裂解液，用3M醋酸钠作为RNA沉淀剂，解决了RNA的提取问题。然而，在得到RNA提取液的基础上继续采用中国预防医学科学院病毒研究所提供的方法仍是无法检测出出血热病毒。
经过我院二年多来的深入研究，终于摸索到肾综合征出血热病毒的基因检测方法。它包括了RNA的提取、RT、cDNA的合成、PCR扩增及电泳鉴定步骤，本方法的特征在于直接用病人血清作为分析样品，以异硫氰酸胍为裂解液，醋酸钠作为RNA沉淀剂提取RNA，经过逆转录，做第一次PCR扩增，扩增原理是基于HFRS病毒为单链，分L、S、M三节段的负链RNA病毒，M片段为型特异性序列，故选用M片段部分变异区设计一对与模板互补的引物，可作分型诊断。第一次PCR扩增引物采用核苷酸位置 引物序列primer1 30-49 CAA TCA GCA ACA TGG CGA TAprimer2648-631AAT ATC AAA GAT CCC ATG扩增片段约为600BP(BP为碱基对长度)。将第一次PCR扩增产物做巢式PCR，进行第二次PCR扩增，是本发明的重要技术特征。第二次PCR扩增的引物我们设计为核苷酸位置引物序列primer1 30-49CAA TCA GCA ACA TGG GGA TAprimer3460-443 GGC TTG CAG TAA GTG CT
扩增片段约为430BP。引物序列中的A腺嘌呤、G鸟嘌呤、C胞嘧啶、T胸腺嘧啶。
采用了上述方法，终于得到了出血热病毒的扩增产物，再以电泳鉴定，可以直接为病人确诊其是否患上出血热病。
本发明的优点十分明显。采用PCR技术对病人血清进行出血热病毒检测可以避免假阳性，杜绝误诊，但在现有技术中均须对病毒进行细胞培养，Vero-E6细胞价格昂贵。本发明提供的方法可采用病人血清直接进行检测，克服了需进行细胞培养所带来的如设备投资大、操作严，培养期长等种种缺点。根据出血热病毒的生物特性，越是早期的标本越易检测到病毒的存在，采用本方法有利于HFRS特异性诊断，因患者感染出血热病毒后，二至三天后人体产生抗体，出血热病毒以循环免疫复合物形式存在，而本法提供的裂解液有利于RNA从组织释出，故较晚期标本中也能获得阳性结果。本方法检测快速，一般24小时可得结果，又易于掌握，只要求有PCR扩增仪、高速离心机、电泳仪、紫外分析仪，一般具PCR设备的实验室均能开展此项检测，为地方中小医院开展出血热的防治、研究，提供了一个好方法。
下面以具体检测的实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
(1)RNA提取在1.5毫升离心管中，加入样品血清100ul，再加入裂解液400ul，饱和酚250ul，充分混匀，置室温5分钟后加24∶1氯仿一异戊醇250ul，充分混匀，15000转/分离心10分钟，取上清液400ul，加助沉剂3M醋酸钠100微升和无水乙醇1ml，在-20℃中至少放置2小时，15000转/分离心10分钟，弃上清液，晾干，加入10微升双蒸水溶解沉淀，即为RNA。
(2)RT-RNA逆转录为cDNA在0.5毫升离心管中依次加入逆转录缓冲液5微升，2毫摩尔dNTP5微升，引物perimer1 30-49、浓度为30P摩尔、加入量0.5微升，酶抑制剂RNasin 20国际单位，逆转录酶AMV10国际单位，已提取到的RNA样品10微升，用双蒸水补充体积至25微升，混匀，42℃保温45分钟。
引物1 核苷酸位置 引物序列perimer130--49CAA TCA GCA ACA TGG GGA TA(3)第一次PCR——第一次出血热病毒扩增用第一对引物扩增，复制cDNA，使其以2倍增。在0.5毫升离心管中依次加入PCR缓冲液5微升，引物primer1 30-49、浓度30P摩尔、0.5微升；引物primer2 648-631、浓度30P摩尔、1微升；2毫摩尔dNTP 5微升，25毫摩尔氯化镁3微升，DNA聚合酶2国际单位，再加入逆转录好的样品20微升，用双蒸水补充至体积为50微升，混匀后加液体石蜡封闭液面，然后将离心管置扩增仪中，95℃3分钟，54℃2分钟后按94℃1分钟，使之变性，DNA链解开，50℃1分钟，退火、接上引物，72℃1分钟，延伸，如此循环35次。
扩增引物 核苷酸位置 引物序列primer1 30-49 CAA TCA GCA ACA TGG GGA TAprimer2648-631AAT ATC AAA GAT CCC ATG引物1的扩增片段约为600BP。
(4)第二次PCR--—将第一次PCR产物进行再次扩增在0.5毫升离心管中依次加入10倍PCR缓冲液5微升，引物primer1 30-49，primer3 460-443 30P摩尔1微升，2毫摩尔dNTP 5微升，25毫摩尔氯化镁3微升，DNA聚合酶0.5微升，第一次PCR产物1-5微升，用双蒸水补充反应体积至50微升，混匀后加液体石蜡封闭液面，在扩增仪中95℃3分钟，54℃2分钟，然后按94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分钟，循环30-35次。
第二次PCR中所采用的引物3是我院设计的核苷酸位置 引物序列perimer3 460-443GGC TTG CAG TAA GTG CT扩增片段约为430BP。
(5)电泳鉴定吸第二次PCR扩增产物的下层水相10微升与3微升溴酚兰染色液混匀，在2％琼脂糖凝胶上点样(凝胶含0.5微克/毫升溴乙锭)，经TAE电泳缓冲液电泳20-30分钟，电压为5V/cm，再在暗室中用紫外透视仪检测结果。如果标本扩增带与阳性参照物扩增带同一位置上出现光带，则可判定标本为阳性，显示血液中有出血热病毒，反之则无。阳性参照物可以采用(1)病人血清，(2)市场购到的PCR maker，(3)出血热病毒的克隆，目前我院采用的是美国进口的PCR maker。至于出血热病毒的克隆及其应用另案申请专利。
为方便上述的PCR检测，特制成一种肾综合征出血热病毒的检测试剂盒，该盒包含有下列试剂(1)提取RNA的试剂①裂解液裂解贮存液250克异硫氰酸胍加双蒸水293毫升0.75M柠檬酸钠17.6毫升10％十二烷基谷氨酸钠26.4毫升裂解应用液应用时每10毫升贮存液中加0.07毫升二巯基乙醇②饱和酚③24∶1氯仿一异戊醇④3M醋酸钠⑤无水乙醇(2)RT试剂①RT缓冲液250mM二羟甲基氨基甲烷PH8.3250mM氯化钾50mM氯化镁50mM1∶4二硫代苏糖醇②逆转录酶AMV③酶抑制剂RNasin，(promega，普洛麦格公司生产)④2mMdNTP(脱氧核苷酸，N由9种不同碱基代人)dATP 20微升 dGTP 20微升dCTP 20微升 dTTP 20微升加双蒸水920微升(3)PCR试剂①PCR缓冲液配方为100mM三羟甲基氨基甲烷PH8.350mM氯化钾15mM氯化镁0.1％琼脂糖②25mM氯化镁③2mMdNTP④Taq，即DNA聚合酶(promega生产)⑤液体石蜡⑥引物primer1 30-49，CAA TCA GCA ACA TGG GGA TAprimer2 648-631，AAT ATC AAA GAT GCC ATG扩增片段约为600BPprimer3 460-443，GGC TTG CAG TAA GTG CT扩增片段约为430BP(4)电泳试剂①50×电泳缓冲液 配方为三羟甲基氨基甲烷 242.2g冰醋酸57.1ml0.5M乙二胺四乙酸 PH8.0100ml双蒸水加至1000ml应用时作1∶50倍稀释即可②溴酚兰6×缓冲液配方为0.25％溴酚兰，40％(W/V)蔗糖③2％凝胶④溴乙锭(10mg/ml)(5)阳性参照物市售PCR marker
权利要求
1.肾综合征出血热病毒的基因检测方法，包括RNA的提取，RT、cDNA的合成，PCR扩增及电泳鉴定，其特征在于直接用病人血清作为分析样品，以异硫氰酸胍为裂解液、醋酸钠作为RNA沉淀剂，经过逆转录，做第一次PCR扩增，扩增引物是核昔酸位置 引物序列primer130-49 CAA TCA GCA ACA TGG GGA TAprimer2 648-631AAT ATC AAA GAT CCC ATG扩增片段约为600BP，将第一次PCR扩增产物做巢式PCR，进行第二次PCR扩增，第二次PCR的扩增引物是核昔酸位置 引物序列primer130-49CAA TCA GCA ACA TGG GGA TAprimer3 460-443 GGC TTG CAG TAA GTG CT扩增片段约为430BP。
2.根据权利要求1所述的肾综合征出血热病毒的基因检测方法，其特征在于它的检测步骤如下(1)RNA提取在1.5ml离心管中加入样品血清100ul，再加入裂解液400ul，饱和酚250ul，充分混匀，置室温5分钟后加24∶1氯仿一异戊醇250ul，充分混匀，15000rpm离心10′，取上清液400ul加助沉剂3N醋酸钠100ul和无水乙醇1ml，在-20℃至少放置2小时，15000rpm离心10′，弃上清液，晾干，加入10ul双蒸水溶解沉淀；(2)RT在0.5ml离心管中依次加入5×RT缓冲液5ul，2mMdNTP5ul，30pmol perimer130-49、0.5ul，RNasin 20U，AMV 10U，RNA样品10ul，双蒸水补充体积至25ul，混匀，42℃保温45分钟；(3)第一次PCR在0.5ml离心管中依次加入PCR缓冲液5ul，30pmol primer，30-49 0.5ul，30pmol，primer2 648-631 1.0ul，2mMdNTP5ul，25mM mgcl23ul，DNA聚合酶2U，再加样品-—经RT的产物20ul，用双蒸水补充体积为50ul，混匀后，加液体石蜡封闭液面，将离心管置扩增仪中，95℃3′，54℃2′后按94℃1′，50℃1′，72℃1′，循环35次进行复制；(4)第二次PCR在0.5ml离心管中依次加入10X PCR缓冲液5ul，30pmolprimer1 30-49、1ul，30pmol primer3 460-443、2mMdNTP5ul，25mM Mgcl23ul，Taq 0.5ul，第一次PCR产物1--5ul，用双蒸水补足体积至50ul，混匀后加液体石蜡封闭液面，置95℃3′，54℃2′后按94℃1′，50℃1′，72℃1′循环35次进行复制；(5)电泳鉴定；吸第二次PCP扩增产物的下层水相10ul与3ul溴酚兰染色液混匀，在2％的琼脂醣凝胶上点样，经TAE电泳缓冲液电泳20′--30′，电压为5V/cm，再在暗室中用紫外透视仪检测结果。
3.肾综合征出血热病毒的基因检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包含有下列试剂(1)提取RNA的试剂①裂解液裂解贮存液250克异硫氰酸胍加双蒸水293毫升0.75M柠檬酸钠17.6毫升10％十二烷基谷氨酸钠26.4毫升裂解应用液应用时每10毫升贮存液中加0.07毫升二巯基乙醇②饱和酚③24∶1氯仿一异戊醇④3M醋酸钠⑤无水乙醇(2)RT试剂①RT缓冲液250mM 二羟甲基氨基甲烷PH8.3250mM 氯化钾50mM 氯化镁50mM 1∶4二硫代苏糖醇②逆转录酶AMV③酶抑制剂RNasin，(promega，普洛麦格公司生产)④2mM dNTP(脱氧核苷酸，N由9种不同碱基代入)dATP 20微升dGTP 20微升dCTP 20微升dTTP 20微升加双蒸水920微升(3)PCR试剂①PGR缓冲液配方为100mM三羟甲基氨基甲烷PH8.350mM氯化钾15mM氯化镁0.1％琼脂糖②25mM氯化镁③2mMdNTP④Taq，即DNA聚合酶(promega生产)⑤液体石蜡⑥引物；primer1 30-49，CAA TCA GCA ACA TGG GGA TAprimer2 648-631，AAT ATC AAA GAT CCC ATG扩增片段约为600BPprimer3 460-443，GGC TTG CAG TAA GTG CT扩增片段约为430BP(4)电泳试剂①50×电泳缓冲液 配方为三羟甲基氨基甲烷 242.2g冰醋酸57.1ml0.5M乙二胺四乙酸 (PH8.0)100ml双蒸水加至1000ml应用时作1∶50倍稀释即可②溴酚兰6×缓冲液配方为0.25％溴酚兰，40％(W/V)蔗糖③2％凝胶④溴乙靛(10mg/ml)(5)阳性参照物市售PCR marker
全文摘要
肾综合征出血热病毒的基因检测方法及检测试剂盒。本法以病人血清为样品，以异硫氰酸胍为裂解液，醋酸钠为RNA沉淀剂，提取RNA，经过逆转录，做第一次PCR扩增，引物是primer1、30-49；primer2、648-631，在扩增仪中循环35次，再做巢式PCR，进行第二次扩增，引物是primer1、30-49；primer3、460-443，再循环35次，然后用凝胶电泳加以检测。为实施上述方法而设计的试剂盒包括RNA提取试剂、RT试剂、PCR及电泳试剂和阳性参照物。本法无需进行细胞培养，检测特异、快速，易于掌握，有利于早期诊断，为基层医院的出血热防治、研究提供了一个好方法。
文档编号C12Q1/68GK1148176SQ9611639
公开日1997年4月23日 申请日期1996年6月20日 优先权日1996年6月20日
发明者储峰, 季青, 严润民, 王霞明 申请人:上海市南汇县南华医院