一种富含异麦芽低聚糖糖浆的制备方法

专利名称：：一种富含异麦芽低聚糖糖浆的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种富含异麦芽低聚糖糖浆的制备方法。该方法包括固定在可重复使用载体上的酶的使用。本发明还涉及通过在所述在可重复使用载体上使用所述的固化酶得到的糖浆及其所述糖浆的用途。异麦芽低聚糖糖浆含有相当大数量的例如异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖、黑糖、曲二糖、异潘糖的支链低聚糖和高级支链低聚糖。取决于应用意图，该产品以粉状或液状形式销售。其可能应用于食品领域的例子有-调味料(蛋黄酱、醋、汤基料等)-糖食(糖果，口香糖、巧克力、冰淇淋、冰糕、糖浆、馅饼)-加工过的果蔬食品(果酱、马茉兰、果酱、腌制食品)，肉或鱼食品(火腿、香肠等)-焙烤制品(面包、蛋糕、饼干)-预煮过的食品(色拉、煮过的豆等)-罐装和瓶装食品、饮料(咖啡、果汁、密汁饮料、充气饮料、柠檬汁饮料、可乐)-方便食品(速溶咖啡、速食蛋糕基料等)。异麦芽低聚糖糖浆还可以用作动物饲料和宠物食品的配料。非食品应用领域有化妆品和药品(香烟、口红、牙膏、内科药等)。多年来人们了解到，当它们按正常日需量口服异麦芽低聚糖时，对人和动物的总的身体状况有好处。该低聚糖的主要作用在于增加大肠内双岐杆菌和乳酸杆菌的数量以及降低腐败细菌的浓度。通过形成酸或通过抗微生物活力，双岐杆菌与一些例如抑制病菌成长的改善健康的特性联系在一起。它们也与以下各种各样的效果联系在一起调整免疫系统(抗癌特性)、减少三酸甘油酯和胆固醇含量、产生维生素(B族)、减少血氨浓度、防止易位、抗生素治疗后的消化道的修复、产生消化酶、减少抗生素带来的副作用(KohmotoT_FukuiF_TakakuH_MachidaY_etal_BifidobacteriaMicroflora，7(2)(1988)，61-69；KohmotoK_TsujiK_KanekoT．ShiotaM_etal_Biosc．Biotech．Biochem_56(6)(1992)，937-940；KanekoT，KohmotoT_KikuchiH_FukuiF_etal_NipponNogeikagakuKaishi，66(8)(1992)，1211-1220，ParkJ-HJin-YoungY_Ok-HoS_Hyun-KyungS_etal_Kor．J．Appl．Microbiol．Biotechnol_20(3)，(1992)，237-242)。通过使用D-葡糖基转换酶(E．C．2．4．1．24，转葡糖苷酶，α-葡糖苷酶)的转葡糖基反应合成异麦芽低聚糖。在与α-D-葡糖低聚糖的培养下，该酶催化水解和转换反应。该转换经常发生在6-OH(葡糖分子的羟基6)，由D-葡萄糖制得异麦芽糖，或由麦芽糖制得潘糖。该酶也可以转移至D-葡萄糖的2-OH或3-OH上以形成曲二糖或黑糖，或者转回4-OH重新形成麦芽糖。转葡糖苷酶反应的结果，麦芽低聚糖转变成异麦芽低聚糖，结果使其成为含有更高比例的通过α-D-1，6葡糖糖苷键连接的葡糖部分的低聚糖级别。来自黑曲霉(A．niger)的转葡糖苷酶仅作用于具有低DP(McClearyB．V_GibsonT．S_CarbohydrateResearch185(1989)147-162；BensonC．P_KellyC．T_FogartyW．M_J．Chem．Tech．Biotechnol_32(1982)790-798；PazurJ．H_TominagaY_DeBroseC．W_JachmanL．M_CarbohydrateResearch，61(1978)279-290)的低聚糖。可以以不同方式得到异麦芽低聚糖。例如用葡糖淀粉酶处理60-80％的高度干燥固体浓度的葡萄糖糖浆，结果形成大部分为DP2的异麦芽低聚糖。其它例子为通过添加支链淀粉酶到液化淀粉中，支链化麦芽糖糖浆和用葡聚糖蔗糖酶处理蔗糖以实现麦芽糖转换。已有报道以不连续方式制得市售异麦芽低聚糖产品。一般制备方法(JP61-212296，ShowaSangyoCo．Ltd．)由30％ds的玉米、马铃薯或木薯淀粉的浆液用耐高温的α-淀粉酶液化达到6-10DE的液化作用开始。该液化作用在pH5和60℃下进行，并加入β-淀粉酶和转葡糖苷酶，糖化持续48-72小时。在糖化阶段结束时，用活性炭和离子交换剂过滤和精制该糖浆。该纯制品最后浓缩至约80％ds(TakakuH_HandbookofAmylasesandrelatedenzymes，Ed．TheAmylaseResearchSocietyofJapan，PergamonPress，Oxford，(1988)，215-217)。使用的该β-淀粉酶来自大豆或小麦，转葡糖苷酶主要来自真菌源，优选黑曲霉。人们已知其它制备方法，它们包括用α-淀粉酶和转葡糖苷酶的混合物转化淀粉水解液(JP41-48693，NipponComStarchKK)和使用形成DP3或DP4的α-淀粉酶并与转葡糖苷酶一起把淀粉转化成高DP3或DP4的糖浆，制得低支链的聚糖(JP31-87390、Gunei，KagakuKogyo)。人们为了制得异麦芽低聚糖已在可溶性酶体系上花费了大量精力，可以看到在固定化酶领域没有上述活性。为了制得异麦芽低聚糖糖浆，日本专利申请JP63-109790(转让给ShowaSangyoCo．)描述了使用固定化转葡糖苷酶缀合物。在转葡糖苷酶存在下，通过明胶与戊二醛的交联得到该缀合物。获得的缀合物机械稳定性低，在可能送到支持柱(holdingcolumns)之前必须经粉碎。由于反应相当不均匀，在载体物料内酶的分布也不均匀，这使得动力混乱，制得的最终产物不是最大可获得量的异麦芽低聚糖。另外的缺点是该载体不能重复使用。在酶活性耗尽后，整个缀合物必须扔掉，从经济和生态学方面考虑这是不良的溶液。欧洲专利申请EP301522涉及从葡萄糖和果糖的混合物引发制备异麦芽糖。对于该方法，其说明书没有公开使用可重复使用的载体，此外其实施例仅显示出使用非固化酶以实现该转换。美国专利US3935070涉及异构化淀粉水解液以把至少一部分葡萄糖转换成果糖。可以接着该转换在膨润土上用转葡糖苷酶进行处理。膨润土不是可重复使用的载体而且引发物为葡萄糖母液。日本专利申请JP04051899(转让给NGKInsulatorsLtd．)公开了使用固定在包括二氧化硅和氧化镁的多孔陶瓷颗粒上的酶。这些陶瓷颗粒不可重复使用。日本专利申请JP62278984(转让给DaikinKogyoKK)公开了使用包括细胞和酶的共固化物(co-immobilisate)。同样这样的制品也不可重复使用。本发明描述了一种异麦芽低聚糖糖浆的制备方法，其中通过转葡糖苷酶酶法转换淀粉水解液，该转葡糖苷酶使用用于固定转葡糖苷酶的可重复使用的载体。该淀粉水解液为具有4-70DE的糖浆，优选20-60DE。优选地，该载体为阴离子交换树脂，通过吸附转葡糖苷酶固定在其上。其它酶与转葡糖苷酶共固定为本发明又一方面，这里的其它酶为支链淀粉酶或α-淀粉酶。这些酶可以一起固定在相同载体上，但是分别固定酶也是可能的。这使两个酶转换步骤分开成为可能。本发明另一方面载体／酶的结合物通过与一个或几个交联剂反应而进一步得到加强。本发明公开了含有大于40％异麦芽低聚糖的异麦芽低聚糖糖浆的连续制备方法，优选异麦芽低聚糖含量大于45％。通过每小时至少3柱床体积的流速和至少25天的周期来实现这些值。另一方面，精制异麦芽低聚糖糖浆，即通过色谱方式或过滤进一步处理异麦芽低聚糖糖浆。本发明另一部分是，在异麦芽低聚糖糖浆的制备过程中或其后，增加其甜度。这可以通过添加甜味剂或通过用葡萄糖异构酶或水解酶使葡萄糖转换成果糖的附加的酶转换来实现。该酶转换可以与转糖基作用同时或在转糖基作用之后进行。图1显示了制得的异麦芽低聚糖(=％异麦芽糖+％黑糖+％异麦芽三糖+％潘糖+％异麦芽四糖)随结合期和用于交联的戊二醛的量而变化曲线图。本发明描述了一种异麦芽低聚糖糖浆的制备方法，其中通过转葡糖苷酶或具有类似活性的酶，使用用于酶固定的可重复使用的载体，经酶法转换淀粉水解液。该淀粉水解液具有4-70的DE，优选20-60。例如通过酶或酸水解、现有技术中已知的方法得到该淀粉水解液。可以使用任何可重复使用的物料作为载体。为了达到本发明的目的，可重复使用的意思是载体可以脱去酶或酶活性，并且载体保持完整无缺。载体物料可以用酶重新装填和重复使用。例如可以通过用酸液或碱液冲洗的办法对载体进行清洗，这可以分批或在柱内进行。添加盐也是有利的。另一种可能是使用蛋白质降解酶。另外的方式是加热物料。优选地，使用的上述物料具有阴离子交换基团。这样的物料可以以纤维素为基础。其它更优选的载体为以聚丙烯酸酯或聚苯乙烯为基础的具有弱碱性基团的载体，优选是以酚醛为基础的载体，例如DuoliteTMA568(RohmandHaas)。优选地，载体为阴离子交换树脂，转葡糖苷酶通过吸附(即非共价的方式)固定在其上。这样可以容易地除去没有活性的酶，随后用新鲜的酶重新装填。在本发明实施例(见实施例11)中显示出酶可以容易地从载体中除去。载体的重新装填使得结合物的活性完全恢复。这意味着载体物料在其被替换之前可以使用相当长的时间。实施例1描述了把转葡糖苷酶固定在阴离子交换树脂上。在柱内对于30％ds麦芽糖糖浆转换的该催化剂的使用显示出，在每小时约3柱床体积的恒定流速下形成的异麦芽低聚糖的总量为约40％，并且该过程持续至少约30天。观察到单一异麦芽低聚糖的量的变化小。酶活性主要在DP2-DP6范围。在实施例2中描述了固定化转葡糖苷酶与戊二醛的交联。使用的该戊二醛是在最终浓度为1％下。结果(实施例2)显示出酶的交联提高了具有与没有交联的所得糖浆组分不同的糖浆的形成。具体地说，葡萄糖的量增加。异麦芽低聚糖的总量约为35％，5％的减少几乎可以完全归因于潘糖的减少。其它酶与转葡糖苷酶共固定为本发明的又一方面，这样的其它酶为支链淀粉酶或α-淀粉酶。支链淀粉酶或α-淀粉酶把较高DPn馏分降解成较小碎片，这样易于使转葡糖苷酶发挥作用。这些酶可以一起固定在相同载体上，但是分别固定酶也是可能的。这使两个酶转换步骤分开成为可能。α-淀粉酶和／或支链淀粉酶可以与转葡糖苷酶保持物理地分开。例如它可以放在转葡糖苷酶前面。这样处理的好处是当其中一种酶耗尽时，不必替换所有的酶，而是可能仅替换一种酶并继续使用其它未耗尽的酶。实施例10中公开了这样单个的固定法。同样在制得的结合物上用戊二醛进行处理以使固定化酶稳定。在应用于30％ds麦芽糖糖浆时的结合物内所得的转葡糖苷酶和支链淀粉酶(1∶7．5(w／w))的共固定提供了具有更低葡萄糖含量和增加了DP3含量的异麦芽低聚糖糖浆。由于支链淀粉酶的活性，DPn含量减半(实施例3)。异麦芽低聚糖开始的量约48％，然而经过一段时间该值降低许多。因此很清楚该催化剂不稳定。潘糖量约为18％。进行具有一半数量的支链淀粉酶的相似实验以提供不同异麦芽低聚糖的光谱(实施例4)。为了稳定该结合物，用不同浓度的戊二醛处理共固定酶／载体。用大于约0．1％的戊二醛使得其稳定性大大增加。异麦芽低聚糖总量在45％以上，而且当流速增加到每小时6柱床体积时仍保持在该值之上(实施例6)。实施例6和7还显示出用0．25％和1％的戊二醛都可以实现其稳定性的增加。本发明因此显示了连续制备含有大于40％异麦芽低聚糖的异麦芽低聚糖糖浆，优选大于45％。流速至少每小时3柱床体积并且持续至少25天来实现这些值。另一方面，精制异麦芽低聚糖，即通过色谱方式或过滤进一步处理异麦芽低聚糖。通过色谱技术或通过超滤或纳米过滤进一步分级分离制得的异麦芽低聚糖糖浆以除去葡萄糖馏分且以这种方式得到富含异麦芽低聚糖的糖浆。本发明另一部分是在制备异麦芽低聚糖糖浆过程中或在其后增加其甜度，这可以通过添加甜味剂或通过用葡萄糖异构酶或水解酶进行附加的酶转换来实现。在实施例8中，经葡萄糖异构酶柱转换异麦芽低聚糖糖浆以实现葡萄糖转换为果糖，而对其它低聚糖没有大的影响。提高甜度或异麦芽低聚糖含量的另一途径是用水解酶(以溶解或固定的形式)处理制得的异麦芽低聚糖糖浆，该水解酶优选或仅仅水解麦芽低聚糖，而对异麦芽低聚糖仅仅具有小的亲和力或甚至没有亲和力。这样的酶的例子为来自黑曲霉或例如曲霉种属或根酶种属(Aspergillussp．orRhizopussp．)的其它酶源的葡糖淀粉酶，它们优选水解麦芽低聚糖(ManjunathP_ShenoyB．C_RaghavendraRaoM．R_JournalofAppliedBiochemistry，5(1983)，235-260；MeagherM．M_etal_BiotechnologyandBioengineering，34(1989)，681-693；PazurJ．H_KleppeK_TheJournalofBiologicalChemistry，237(4)(1962)，1002-1006；Hirornik_NittaY_etal_BiochimicaetBiophysicaActa，302(1973)，362-37)。使用葡糖淀粉酶进行相同的处理。在这种情况下，耗费所有其它低聚糖产生大量的葡萄糖(实施例9)。也可以使用来自象嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的α-D-吡喃葡糖苷酶的酶。该酶不能水解异麦芽低聚糖，仅降解在富含异麦芽低聚糖的糖浆中存在的麦芽低聚糖(SuzukiY_ShinjiM_NobuyukiE_BiochimicaetBiophysicaActa，787(1984)，281-189)。也可以使用所谓麦芽糖酶的其它α-D-葡糖苷酶。例如来自酵母的麦芽糖酶仅水解麦芽糖，而对麦芽三糖的水解较少(KellyC．T_FogartyW．M_ProcessBiochemistry，May／June(1983)，6-12)。麦芽低聚糖水解成葡萄糖之后，通过色谱技术或通过纳米过滤或超滤，该糖浆可以富含异麦芽低聚糖。以下实施例用于解释本发明的主要方面。实验酶活性测定通过McClearyet．al．的方法(McClearyB．V_GibsonT．S_CarbohydrateResearch，185(1989)，147-162)测定转葡糖苷酶的活性。在转葡糖苷酶存在下，使甲基-α-D-吡喃葡糖苷(glucopyranoside)在pH5．0和60℃下反应10分钟，因此变成D-葡萄糖。测定D-葡萄糖，活性用国际单位表示。一国际单位(U)为每分钟打开一微摩尔配糖键所需的酶量。通过Lappalainen等人改进的方法(LappalainenA_Niku-PaavolaM-L_SuorttiT_PoutanenK_Starch，43(12)(1991)，477-482)测定支链淀粉酶活性。通过使支链淀粉与支链淀粉酶在pH5和50℃下反应15分钟来测定支链淀粉酶的活性。支链淀粉水解成低聚糖，通过DNS-试剂比色测定该低聚糖。由麦芽糖浓度和吸光度之间关系表示的标准曲线来计算酶活性。一单位为每分钟内产生一微摩尔还原基团所需的酶的量，表示麦芽糖当量。底物除实施例7和8外，所有实验中用作底物的糖浆具有以下近似组分DP1DP2DP3DP4DP5DP6DP7DP8DP9DP1DP≥0113．448．120．81．21．11．62．73．22．41．014．5这些底物含有很少量的异麦芽低聚糖DP麦芽异麦芽黑麦芽三潘异麦芽三异麦芽四糖异构总DPn1糖糖糖糖糖糖量3．447．01．10．020．30．50．11．22．826．5使用实施例中描述的这些底物，不排除使用类似麦芽糊精的其它底物(具有葡糖当量＜20的淀粉水解产物)，或包括不同量DP1-DP20和更高DPn的糖浆。低聚糖分析在配备有ShodexKS-801柱的HPLC上以Na+形式和RI检测进行底物和产物的特征分析。该方法提供DP1、DP2、DP3、DP4和DPn组分。用Bio-RadHPX42-A柱测定DP1-DP10组分。单个异麦芽低聚糖的量通过高效阴离子交换色谱法进行测定，即使用具有脉冲安培滴定检测的DionexCarbopacPA-1柱。实施例1固定化转葡糖苷酶用软化水冲洗10ml的DuoliteA568TM以去除微粒。该树脂随后用盐酸调整至pH3．5。加入2gTransglucosidaseL“Amano”(液状制品，11．2mg蛋白质／g酶溶液，103TGU／g酶溶液)，室温下搅拌混合物1夜。制得的结合物用软化水冲洗并放入50℃下的双层外壳玻璃柱内。30％ds麦芽糖糖浆(3．3％DP1、49．7％DP2、21．9％DP3、0．9％DP4、24．2％DP≥5)，调整到pH4．2，以3BV／h(柱床体积／小时)的流速泵送通过柱。该柱温度保持在50℃。通过HPLC分析柱出口处的产物。表1描述了通过固定化转葡糖苷酶作用的糖组分的变化</tables>表1表2描述了制得的不同异麦芽低聚糖。表2除了异麦芽低聚糖的总量约为40％外，DPn部分也含有相当多的具有DP≥5的支链化低聚糖。尽管经过一段时间异麦芽低聚糖总量保持恒定，仍可以注意到制得的单个异麦芽低聚糖的小的变化。表3描述了通过结合物转换底物后低聚糖数据的变化。表3从表3中很明显，固定化转葡糖苷酶的作用位于DP2-6的范围。所有DP2和DP3分子转换成葡萄糖和DP4-6分子。DP10+部分实际上没有变化。实施例2用戊二醛处理过的固定化转葡糖苷酶用软化水冲洗10ml的DuoliteA568TM以去除微粒。该树脂随后用0．3ml的1MNa2CO3调整。加入2gTransglucosidaseL“Amano”(液状制品，11．2mg蛋白质／g酶溶液，103TGU／g酶溶液)，室温下搅拌混合物4小时。加入5ml5％的戊二醛溶液(最终浓度1％)，室温下搅拌该树脂1夜。制得的结合物用软化水冲洗并放入50℃下的双层外壳玻璃柱内。30％ds麦芽糖糖浆(3．3％DP1、49．7％DP2、21．9％DP3、0．9％DP4、24．2％DP≥5)，调整到pH4，以3BV／h(柱床体积／小时)的流速泵送通过柱。该柱温度保持在50℃。通过HPLC分析柱出口处的产物。表4描述了通过固定化转葡糖苷酶作用的糖组分的变化:表4当与表1中出现的结果进行比较时，很明显，戊二醛改变了固定化转葡糖苷酶的作用方式。受戊二醛处理过的结合物比实施例1中描述的结合物产生更多的葡萄糖。表5描述了制得的不同的异麦芽低聚糖。表5当与未经处理的TG结合物(表2)比较时，发现异麦芽低聚糖的量减少。这直接关系到戊二醛结合物内的潘糖产生较少。实施例3共固定转葡糖苷酶／支链淀粉酶(1)用软化水冲洗10ml的DuoliteA568TM以去除微粒。该树脂随后用盐酸调整至pH3．5。加入2gTransglucosidaseL“Amano”(液状制品，11．2mg蛋白质／g酶溶液，103TGU／g酶溶液)，室温下搅拌混合物4小时。加入15g支链淀粉酶(来自GenencorInt．的OptimaxL300TM，2．6mg蛋白质／g酶溶液，400PU／g酶溶液)，整夜连续固定化。制得的结合物用软化水冲洗并放入50℃下的双层外壳玻璃柱内。30％ds麦芽糖糖浆(3．3％DP1、49．7％DP2、21．9％DP3、0．9％DP4、24．2％DP≥5)，调整到pH4．2，以3BV／h(柱床体积／小时)的流速泵送通过柱。该柱温度保持在50℃。通过HPLC分析柱出口处的产物。表6描述了通过固定化转葡糖苷酶／支链淀粉酶结合物的糖组分的变化表6与实施例1中制备的固定化转葡糖苷酶结合物相比，产生较少的葡萄糖，而特别是DP3很高。而且由于固定化支链淀粉酶的作用Dpn部分减半。经过一段时间注意到葡萄糖的形成降低，这表示该结合物不具有高的稳定性。表7描述了制得的不同的异麦芽低聚糖。表7从表7中很明显，经过一段时间异麦芽低聚糖含量减少。实施例4共固化转葡糖苷酶／支链淀粉酶(2)与实施例3描述的结合物不同，变换转葡糖苷酶活性／支链淀粉酶活性的比例，以提供给酶载体。用软化水冲洗10ml的DuoliteA568TM以去除微粒。该树脂随后用盐酸调整至pH3．5。加入2gTransglucosidaseL“Amano”(液状制品，11．2mg蛋白质／g酶溶液，103TGU／g酶溶液)，室温下搅拌混合物4小时。加入7．5g支链淀粉酶(来自GenencorInt．的OptimaxL300TM，2．6mg蛋白质／g酶溶液，400PU／g酶溶液)，整夜连续固定化。制得的结合物用软化水冲洗并放入50℃下的双层外壳玻璃柱内。30％ds麦芽糖糖浆(3．3％DP1、49．7％DP2、21．9％DP3、0．9％DP4、24．2％DP≥5)，调整到pH4，以3BV／h(柱床体积／小时)的流速泵送通过柱。该柱温度保持在50℃。通过HPLC分析柱出口处的产物。表8描述了通过固化转葡糖苷酶／支链淀粉酶结合作用的糖组分的变化。表8也很清楚，象实施例3描述的结合物，随时间的推移转葡糖苷酶／支链淀粉酶结合疏松。表9描述了制得的不同的异麦芽低聚糖。表9表9描述的结果显示该结合物产生的异麦芽低聚糖量随时间推移而降低。因此可以总结出该结合物是不稳定的。实施例5用不同浓度的戊二醛处理的共固化转葡糖苷酶／支链淀粉酶用软化水冲洗10ml的DuoliteA568TM以去除微粒。该树脂随后用0．3ml的1MNa2CO3调整。加入2gTransglucosidaseL“Amano”(液状制品，11．2mg蛋白质／g酶溶液，103TGU／g酶溶液)，室温下搅拌混合物4小时。接着，加入15g支链淀粉酶(来自GenencorInt．的OptimaxL300TM，2．6mg蛋白质／g酶溶液，400PU／g酶溶液)，连续固化4小时。然后分别加入5ml的5％、2．5％、1．0％、0．5％或0．1％的戊二醛溶液以分别提供1％、0．5％、0．2％、0．1％或0．02％的戊二醛溶液，室温下搅拌该树脂1夜。制得的结合物用软化水冲洗并放入50℃下的双层外壳玻璃柱内。30％ds麦芽糖糖浆(3．3％DP1、49．7％DP2、21．9％DP3、0．9％DP4、24．2％DP≥5)，调整到pH4．2，以3BV／h(柱床体积／小时)的流速泵送通过柱。该柱温度保持在50℃。通过HPLC分析柱出口处的产物。图1显示了异麦芽低聚糖(=％异麦芽糖+％黑糖+％异麦芽三糖+％潘糖+％异麦芽四糖)产品随结合期而变化的图。从图1清楚地看出戊二醛处理具有使转葡糖苷酶／支链淀粉酶结合物性能稳定的效果。实施例6用0．2％最终浓度的戊二醛处理的共固化转葡糖苷酶／支链淀粉酶按照实施例5制得转葡糖苷酶／支链淀粉酶结合物。用0．2％最终浓度的戊二醛实现其交联。30％ds麦芽糖糖浆，调整到pH4．2，以3BV／h(柱床体积／小时)的流速泵送通过柱。该柱温度保持在50℃。通过HPLC分析柱出口处的产物。表10描述了通过固化转葡糖苷酶作用的糖组分的变化表10注意到，随时间推移观察到仅少量葡萄糖减少。表11描述了制得的不同的异麦芽低聚糖。表11表11显示的结果证实用这种结合物以3BV／h可以获得46％稳定的异麦芽低聚糖产品。流速增加到～6BV／h制得的葡萄糖含量减少，而制得的异麦芽低聚糖的量保持恒定。流速进一步增加到～9BV／h制得的异麦芽低聚糖的量减少。表12给出了随时间推移制得的糖浆的低聚糖分布的变化。表12表12证实制得的糖浆中大多数低聚糖在DP6-7以下的区域被发现，与底物相反，其大部分(23．5％)低聚糖具有高于6的DP。当与实施例1(表3)描述的结合物比较时，很明显，共固定支链淀粉酶的作用大大地减少DP10+部分。实施例7用1．0％最终浓度的戊二醛以不同流速处理共固化转葡糖苷酶／支链淀粉酶用软化水冲洗10ml的DuoliteA568TM以去除微粒。该树脂随后用0．3ml的1MNa2CO3调整。加入2gTransglucosidaseL“Amano”(液状制品，11．2mg蛋白质／g酶溶液，103TGU／g酶溶液)，室温下搅拌混合物4小时。接着，加入15g支链淀粉酶(来自GenencorInt．的OptimaxL300TM，2．6mg蛋白质／g酶溶液，400PU／g酶溶液)，连续固化4小时。然后加入5ml5．0％的戊二醛溶液以提供1％的戊二醛溶液，室温下搅拌该树脂1夜。制得的结合物用软化水冲洗并放入50℃下的双层外壳玻璃柱内。30％ds麦芽糖糖浆(3．3％DP1、48．4％DP2、20．8％DP3、1．3％DP4、26．2％DP≥5)，调整到pH4．2，以10BV／h(柱床体积／小时)的流速泵送通过柱。该柱温度保持在50℃。通过HPLC分析柱出口处的产物。表13说明经固化的转葡糖苷酶作用后糖组份的变化。表13由表13很显然看出，以3BV／h制得大量葡萄糖，而DPn部分相对于底物减少很多。流速增加到6-9BV／h，葡萄糖产量减少，同时残余DPn含量增加。表14显示出固化转葡糖苷酶作用后糖组分的变化</tables>表14表14显示的数据证实，以3BV／h可以获得约45-46％的异麦芽低聚糖。当流速增加到6BV／h时，异麦芽低聚糖的量没有降低。在9BV／h，注意到异麦芽低聚糖降低。实施例8通过葡萄糖异构酶转化作用增加异麦芽低聚糖糖浆的甜度该实施例描述了通过把可获得的部分葡萄糖转变成果糖来增加异麦芽低聚糖糖浆甜度的方法。以3-4．5BV／h运送富含异麦芽低聚糖的糖浆(pH7．8，60％ds，200ppmMg2+)通过固化葡萄糖异构酶结合物(50℃的恒温)。表15给出了异构化结果表15表15中结果证实，容易制得9％果糖变体的异麦芽低聚糖糖浆。自然也可获得具有其它果糖百分比的异麦芽低聚糖糖浆。表16证实，在异构化过程中异麦芽低聚糖组分几乎没有变化。表16实施例9通过水解酶转换增加异麦芽低聚糖糖浆甜度该实施例描述在来自黑曲霉的葡糖淀粉酶存在的情况下，水解酶在异麦芽低聚糖糖浆上的作用。以～1BV／h运送富含异麦芽低聚糖的糖浆(80％ds，PH4)通过固化葡糖淀粉酶结合物。表17给出了低聚糖光谱的变化表17很清楚，制得了葡糖，而低聚糖量降低。表18显示出异麦芽低聚糖含量的变化。表18表18证实，相当大量的麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖和DPn部分分解为葡萄糖。自然也可以在例如30％ds的低ds下进行水解反应，示于表19。表19表19清楚地显示出，流速降低使得DPn部分进一步降解。这也例证于表20中表20通过调整流速，可以降解最大量的DPn部分，而没有水解太多的异麦芽低聚糖(表21)。表21实施例10固化转葡糖苷酶伴随着的固化支链淀粉酶A)固化支链淀粉酶的制备用软化水冲洗5ml的DuoliteA568以去除微粒。该树脂随后用0．15ml的1MNa2CO3调整。加入7．5gOptimaxL300(Genencor)，接着加入0．008ml戊二醛溶液(25％w／v)／ml的上清液。室温下整夜缓慢搅拌该混合物。制得的结合物用软化水冲洗并放入50℃下的双层外壳玻璃柱内。30％ds麦芽糖糖浆，调整到pH4．2，以6BV／h(柱床体积／小时)的最初流速泵送通过柱。该柱温度保持在50℃。结合物脱支链化活性清楚显示在表22中。送脱支链的麦芽糖糖浆通过B)中描述的固化转葡糖苷酶结合物。表22B)固化转葡糖苷酶的制备用软化水冲洗5ml的DuoliteA568以去除微粒。该树脂随后用0．15ml的1MNa2CO3调整。加入1gTransglucosidaseL“Amano”，接着添加0．08ml葡糖苷戊二醛溶液(25％w／v)。室温下整夜缓慢搅拌该混合物。制得的结合物用软化水冲洗并放入50℃下的双层外壳玻璃柱内。由支链淀粉酶结合物制得的糖浆以6BV／h(柱床体积／小时)的最初流速泵送通过柱。该柱温度保持在50℃。异麦芽低聚糖糖浆产品显示在表23中。表23实施例11树脂的再生和用酶重新装填A)用软化水冲洗10ml的DuoliteA568TM以去除微粒。该树脂随后用0．3ml的1MNa2CO3调整。加入1gTransglucosidaseL“Amano”’(液状制品，11．2mg蛋白质／g酶溶液，103TGU／g酶溶液)，室温下搅拌混合物4小时。接着，加入15g支链淀粉酶(来自GenencorInt．的OptimaxL300TM，2．6mg蛋白质／g酶溶液，400PU／g酶溶液)，连续固化4小时。加入5ml1．0％的戊二醛溶液以提供0．2％的戊二醛溶液，室温下搅拌该树脂1夜。制得的结合物用软化水冲洗并放入50℃下的双层外壳玻璃柱内。30％ds麦芽糖糖浆，调整到pH4．2，以10BV／h(柱床体积／小时)的流速泵送通过柱。该柱温度保持在50℃。以3BV／h持续30天运行该结合物制得43-45％的异麦芽低聚糖。B)接着把该结合物送入一烧杯，用水冲洗以去除糖和微粒。树脂的pH调到1．5，在60℃下搅拌该树脂1小时。然后用NaOH使其pH升到12．5，连续搅拌1小时同时保持pH在12．5。然后用软化水冲洗该结合物以去除微粒。C)对该再生过的树脂重复进行步骤A)。固定相同量的酶，以A中描述的相同流速用新的结合物制得43-45％异麦芽低聚糖糖浆。权利要求1．一种含有异麦芽低聚糖的糖浆的制备方法，其中通过转葡糖苷酶酶法转换淀粉水解液，并且使用可重复使用的载体以固定转葡糖苷酶。2．根据权利要求1的方法，其中淀粉水解液具有4-70的DE，优选20-60DE。3．根据权利要求1的方法，其中载体为阴离子交换树脂，通过吸附把转葡糖苷酶固定在其上。4．根据权利要求1的方法，其特征在于其它酶与转葡糖苷酶共固定，所述的其它酶选自支链淀粉酶和α-淀粉酶，其中所述的共固定由一种或多种分开的载体实现。5．根据权利要求1的方法，其特征在于载体／酶结合物通过与交联剂反应进一步得到强化。6．根据权利要求5的方法，其特征存于交联剂为戊二醛。7．根据权利要求1的方法，其特征在于异麦芽低聚糖含有大于40％，优选大于45％的异麦芽低聚糖，这些值由至少每小时3柱床体积的流速和至少25天的周期来实现。8．根据上述权利要求中任意之一的方法，其中进一步通过例如色谱方式或过滤来精制异麦芽低聚糖糖浆。9．根据权利要求1的方法，其中在异麦芽低聚糖糖浆的制备过程中或之后通过添加甜味剂或者通过附加葡萄糖异构酶或水解酶的附加酶转换增加其甜度。全文摘要本发明描述了一种异麦芽低聚糖糖浆的制备方法。该方法包括固定在可重复使用载体上的酶的使用。该载体优选阴离子交换剂。用于转变淀粉水解液的酶为转葡糖苷酶和支链淀粉酶,优选共固化这些酶。通过交联进一步强化载体/酶的结合。文档编号C13K13/00GK1205843SQ9810877公开日1999年1月27日申请日期1998年5月2日优先权日1997年5月2日发明者R·L·M·维考特伦,V·S·恩古尹,H·W·W·勒珀申请人:塞里斯塔控股有限公司