专利名称：一种非还原性糖形成酶、一种海藻糖释放酶以及用这些酶制备糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种非还原性糖形成酶、一种海藻糖释放酶以及用这些酶制备糖的方法。
海藻糖是由2摩尔在其还原性残基上结合的葡萄糖所组成的二糖，并且广泛见于自然界中，例如在微生物、真菌、藻类、昆虫、甲壳类等。由于该糖长期以来被看作是基本上无还原性并具有满意的保湿功能的糖，所以预计其可用于广泛的领域。包括食品、化妆品及药品。然而，尽管其杰出的预期功能，但没有建立该糖有效的制备方法，故这限制了海藻糖的用途。因而，强烈期待能够廉价供应海藻糖。
作为对这种期待的建议，本发明者通过他们的深入研究已经建立了从原料淀粉酶促制备海藻糖的方法。该方法特征在于以下的步骤，即将还原性的部分淀粉水解物经过非还原性糖形成酶的作用，这将由还原性的部分淀粉水解物形成具有海藻糖结构作为末端单元的非还原性糖，并且还原性的部分淀粉水解物经海藻糖释放酶的作用，该酶作用于具有海藻糖结构作为末端单元的非还原性糖从而水解海藻糖结构部分与其余部分之间的位点。这些酶及其方法公开于由与本发明相同的申请者申请的日本专利公开No.143,876/95，213,283/95，322,883/95，298,880/95，66,187/96，66,188/96，73,504/96，84,586/96，和336,388/96中。因此，获得了海藻糖的廉价制备。
在研究期间，他们获得了独到的发现，即该非还原性糖形成酶可用于新制备非还原性糖，这种方法克服了传统的存在于还原性部分淀粉水解物中的缺陷。作为问题，还原性部分淀粉水解物如糊精和麦芽糖寡糖具有可用作增甜剂及能量补充糖源的优势，但作为其缺点，由于其还原性而与其他物质具有高度反应性和当与氨基酸和/或蛋白共存时易于褐变反应以及容易损坏其质量。为了克服此问题，仅仅知道用高压氢化作用方法等将还原性部分淀粉水解物转换成糖醇的方法。然而，在实际使用中，该方法需要较多的热量和鉴于使用氢的安全性考虑而建立的装备，这样便导致了更高的成本及较多的劳动力消耗。相反，前述的非还原性糖形成酶按照前面所述作用于还原性部分淀粉水解物，形成具有海藻糖结构作为末端单元的非还原性糖，并且此反应由于为酶促反应而在相对较为温和的条件下进行。利用该酶的作用，本发明者建立了用该酶制备非还原性糖的有效新方法，其可克服存在于还原性部分淀粉水解物中的传统缺陷。由于这些发现，开发海藻糖及非还原性糖的适当用途充斥于多个领域。并因此扩大了这些糖的用途且现在显著增加了这些糖在多个领域中的需求。
在这些条件下，在该领域中更加期望制备。海藻糖及具有海藻糖结构的非还原性糖的更为有效的方法。这种期望的关键是建立具有各种最佳条件的非还原性糖形成酶和海藻糖释放酶，并且提供各种可用于这些糖制备的这些酶的来源。因此，根据可与上述酶联合使用以制备所需糖的另一种酶的最佳条件以及设备和制备糖的最终用途，最佳的酶可选自各种类型的酶，从而导致有效制备这些糖。通常已知的非还原性糖形成酶可分成具有相对较低的大约40℃或更低最适温度的那些种类和具有相对较高的大约60℃或更高最适温度的那些种类。尽管通常已知的海藻糖释放酶可分成具有相对较低的大约45℃或更低最适温度的那些种类和具有相对较高的大约60℃或更高最适温度的那些种类。然而，至今还没有发现具有大约50℃适中温度范围最适温度的非还原性糖形成酶和海藻糖释放酶。
在用于从淀粉原料制备糖的糖相关性酶中，主要的一组酶具有适中温度范围的最适温度。在制备前述海藻糖和非还原性糖的方法中需要这些酶；至今还没有建立具有适中温度范围的最适温度的非还原性糖形成酶和海藻糖释放酶，从而还没有认识到用这2种酶中任意一种或同时用此二者以及上述糖相关性酶以充足的产量制备这些糖的方法。根据用于制备这些糖的设备及其最终用途，需要有在其酶促反应中具有适中温度范围的最适温度的酶。还远不能说已经建立了用非还原性糖形成酶和海藻糖释放酶以满意的高产量制备糖的方法。如上述，还强烈需要建立具有适中温度范围的最适温度的非还原性糖形成酶和海藻糖释放酶和用于制备包括非还原性糖在内的糖的方法。
鉴于此，本发明的第一个目的是提供具有适中温度范围的最适温度的非还原性糖形成酶。
本发明的第二个目的是提供编码该非还原性糖形成酶的DNA。
本发明的第三个目的是提供用于制备该非还原性糖形成酶的方法。
本发明的第四个目的是提供具有适中温度范围的最适温度的海藻糖释放酶。
本发明的第五个目的是提供编码该海藻糖释放酶的DNA。
本发明的第六个目的是提供用于制备该海藻糖释放酶的方法。
本发明的第七个目的是提供能够产生非还原性糖形成酶和/或海藻糖释放酶的微生物。
本发明的第八个目的是提供用该非还原性糖形成酶和/或海藻糖释放酶制备包括非还原性糖的糖的方法。
为了达到上面的目的，本发明者广泛地筛选了土壤中能够实现这些目的的微生物。结果，他们发现，一种从日本Ako-Shi，Hyogo的土壤中新分离的微生物，产生的酶能够解决上面的问题。本发明者从该微生物中单独分离出了所需的非还原性糖形成酶和海藻糖释放酶，并鉴定了其特性，揭示这两种酶均具有适中温度范围的最适温度。对该微生物的鉴定证实其为节杆菌属的一种新的微生物，命名为节杆菌属的种S34。该微生物于1998年8月6日保藏于国立工业科技与人类技术研究所，Higashi 1-1-3，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本，并被接受且以许可号FERM BP-6450由该研究所保存。
本发明者继续研究，从该微生物，节杆菌属的种S34，FERMBP-6450中分离编码上面鉴定酶的DNA，破译核苷酸序列，并测定该酶的氨基酸序列。本发明者证实节杆菌属的种S34，FERM BP-6450以及其中以常规方式导入了上面所得DNA的转化子产生了所需量的酶。同时证实，这样得到的酶可有利地用于在适中温度范围内制备包含海藻糖和具有海藻糖结构的非还原性糖的糖类。本发明根据这些发现得以完成。
本发明的第一个目的是通过新的非还原性糖形成酶加以解决，该酶可以从还原性部分淀粉水解物形成具有海藻糖结构作为末端单元，并具有适中温度范围的最适温度。
本发明的第二个目的是通过编码非还原性糖形成酶的DNA加以解决。
本发明的第三个目的是通过制备非还原性糖形成酶的方法加以解决，该方法特征在于包括培养能够产生该酶的微生物和从培养物中收集所产生的酶的步骤。
本发明的第四个目的是通过一种新的海藻糖释放酶加以解决，该酶特异性地水解具有海藻糖结构作为末端单元并且在海藻糖部分和其余部分之间的一个位点葡萄糖聚合程度至少为了的非还原性糖，并且具有适中温度范围内的最适温度。
本发明的第五个目的是通过编码海藻糖释放酶的DNA解决。
本发明的第六个目的是通过制备海藻糖释放酶的方法解决，该方法的特征在于包括培养能够产生该酶的微生物和从培养物中收集所产生的酶的步骤。
本发明的第七个目的是通过选自节杆菌属的种S34，FERM BP-6450及其突变体的微生物加以解决。
本发明的第八个目的是通过制备糖的方法加以解决，包括以下步骤，即让上面2种酶中任意一种或2种作用于还原性部分淀粉水解物以制备非还原性糖，并收集非还原性糖或具有相对较低还原性且含有非还原性糖的糖组合物。
图1显示温度对来自本发明节杆菌属的种S34，FERM BP-6450的非还原性糖形成酶活性的影响。
图2显示pH对来自本发明节杆菌属的种S34，FERM BP-6450的非还原性糖形成酶活性的影响。
图3显示温度对来自本发明节杆菌属的种S34，FERM BP-6450的非还原性糖形成酶稳定性的影响。
图4显示pH对来自本发明节杆菌属的种S34，FERM BP-6450的非还原性糖形成酶稳定性的影响。
图5为本发明重组DNA pGY1的限制性图谱。粗体线显示来自节杆菌属的种S34，FERM BP-6450的核苷酸序列。粗体线内的黑箭头显示编码本发明非还原性糖形成酶的核苷酸序列，而斜箭头显示编码本发明海藻糖释放酶的核苷酸序列。
图6为本发明重组DNA pGY2的限制性图谱。粗体线显示来自节杆菌属的种S34，FERM BP-6450的核苷酸序列。粗体线内的黑箭头显示编码本发明非还原性糖形成酶的核苷酸序列。
图7为本发明重组DNA pGY3的限制性图谱。黑箭头显示来自节杆菌属的种S34，FERM BP-6450的编码本发明非还原性糖形成酶的核苷酸序列。
图8显示温度对来自本发明节杆菌属的种S34，FERM BP-6450的海藻糖释放酶活性的影响。
图9显示pH对来自本发明节杆菌属的种S34，FERM BP-6450的海藻糖释放酶活性的影响。
图10显示温度对来自本发明节杆菌属的种S34，FERM BP-6450的海藻糖释放酶稳定性的影响。
图11显示pH对来自本发明节杆菌属的种S34，FERM BP-6450的海藻糖释放酶稳定性的影响。
图12为本发明重组DNA pGZ2的限制性图谱。粗体线显示来自节杆菌属的种S34，FERM BP-6450的核苷酸序列。粗体线内的斜箭头显示编码本发明海藻糖释放酶的核苷酸序列。
图13为本发明重组DNA pGZ3的限制性图谱。斜箭头显示来自节杆菌属的种S34，FERM BP-6450的核苷酸序列。
本发明涉及一种非还原性糖形成酶和一种海藻糖释放酶，以及用这2种酶中任意1种或同时用这二者制备糖的方法。本发明中所称的词语“非还原性糖形成酶”代表具有从还原性部分淀粉水解物形成具海藻糖结构作为末端单元的非还原性糖这种作用的酶。本发明中所称的词语“海藻糖释放酶”代表能够特异性地水解具有海藻糖结构作为末端单元、葡萄糖聚合程度至少为3的非还原性糖、并且水解位点位于海藻糖部分和其余部分之间的酶。本发明中所称的词语“适中温度范围”代表通常用于从淀粉物质通过酶促反应而制备糖的反应温度中的适中温度范围。在这些方法的大多数情况下，使用大约10℃到100℃及其周围温度的不同反应温度。本发明的非还原性糖形成酶具有这种酶的功能，并且具有适中温度范围的最适温度，优选具有高于40℃低于60℃的温度范围，且更为优选地，除了最适温度外，其具有酸性pH范围内的最适pH。本发明的海藻糖释放酶具有这种酶的功能，并且具有适中温度范围内的最适温度，优选高于45℃低于60℃的温度范围，且更为优选地，除了最适温度外，其具有酸性pH范围内的最适pH。本发明的这些酶不应限制其出处和来源。
按照如下测定本发明非还原性糖形成酶的活性将1ml酶溶液加入到4ml于20mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)中作为底物的1.25w/v％的麦芽糖五糖中，并将混合物于50℃培养60分钟。将此反应混合物加热至100℃ 10分钟从而终止酶促反应，用去离子水将反应混合物准确稀释10倍，然后根据Somogyi-Nelson方法测定稀释液的还原能力。作为对照，按上述类似地处理已经于100℃加热10分钟而使酶失活的酶溶液。本发明酶的1单位活性定义为，当按上述测定方法测定时，每分钟去除1μmol麦芽糖五糖还原能力的酶量。根据此测定方法测定本发明中所称的酶的最适温度。通过以下方法加以测定，即在不同的温度包括50℃时调节酶促反应温度，使预定量的酶在测定的不同温度作用于底物，根据测定中的不同温度测定还原能力的降低水平，然后对测得的降低水平进行相互比较，确定显示最高活性的本发明酶的最适温度。
按照如下测定本发明海藻糖释放酶的活性将1ml酶溶液加入到4ml于20mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)中作为底物的1.25w/v％麦芽三糖基海藻糖，即α-maltotetraosyl-α-D-葡萄糖苷中，并将混合液于50℃培养30分钟，然后通过加热Somogyi铜溶液而终止酶促反应，并且根据Somogyi-Nelson方法测定还原能力。作为对照，用已经于100℃加热10分钟而失活的酶溶液，按上述类似地进行测定。本发明酶的1单位活性定义为，当按上述测定方法测定时，每分钟增加1μmol葡萄糖还原能力的酶量。根据此测定方法测定本发明中所称的酶的最适温度。通过以下方法加以测定，即在不同的温度包括50℃时调节酶促反应温度，使预定量的酶在测定的不同温度作用于底物，并且根据测定中的不同温度测定还原能力的增加水平，然后对测得的增加水平进行比较，确定显示最高活性的本发明酶的最适温度。
解释基于此氨基酸序列的本发明非还原性糖形成酶，总体上，该酶具有SEQID NO1的氨基酸序列，并且在有些情况下具有SEQ ID NO2到6的氨基酸序列作为其部分序列。除了具有上述整个氨基酸序列的这些酶之外，本发明还包括另几种酶，其包括选自其中任何一种氨基酸序列中的一部分，或同时具有本发明非还原性糖形成酶功能和上述最适温度。这些酶的氨基酸序列的实例有这些，它们在其氨基酸序列内含有与本发明非还原性糖形成酶特性的表达有关的部分氨基酸序列或氨基酸残基，并且其中一个或更多个氨基酸被不同的氨基酸所取代或向其中添加了氨基酸和/或缺失了除上述氨基酸序列或氨基酸残基外的其它氨基酸。在本发明中所称的被不同的氨基酸所取代的氨基酸序列实例包括这些，其中组成SEQ ID NO1氨基酸序列不到30％并且优选不到20％的氨基酸序列被具有类似特性和结构的其它氨基酸所取代。这种氨基酸分组的实例有作为酸性氨基酸组的天冬氨酸与谷氨酸，作为碱性氨基酸的赖氨酸、精氨酸与组氨酸之一，作为酰胺型氨基酸的天冬酰胺与谷氨酰胺之一，作为羟基氨基酸的丝氨酸与苏氨酸之一，作为支链氨基酸的缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸之一。含有选自SEQ ID NO1到6的氨基酸序列中任何一种的一部分的本发明酶其它氨基酸序列的实例有这些，即它们可能与SEQ ID NO1氨基酸序列具有基本上类似的立体结构，即氨基酸的替代、缺失和/或添加被导入到SEQ ID NO1氨基酸序列中。该蛋白的立体结构可通过以下方法加以估计，即对市售数据库进行筛选，以获得具有与目的序列有关的氨基酸序列并且已揭示了其立体结构的蛋白质的立体结构，参照选出的立体结构，并且用商业上可得到的软件观看立体结构。本发明非还原性糖形成酶的上述氨基酸序列与SEQ ID NO1具有至少57％，优选至少70％，更为优选至少80％的同源性。
如上所述，该非还原性糖形成酶不应限于特定的出处/来源。这些酶的实例有源自微生物，即节杆菌属微生物，节杆菌属的种S34，FERM BP-6450，及其变异体的那些酶。这些变异体可通过以下方法获得，即用已知的诱变剂，如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍、甲基磺酸乙酯、紫外线和转座子，以常规方式处理节杆菌属的种S34，FERM BP-6450；筛选能够产生非还原性糖形成酶并且具有适中温度范围的最适温度、通常在高于40℃而低于60℃温度范围的温度具有最适温度的所需突变体。源自节杆菌属的种S34，FERM BP-6450的酶通常具有SEQ IDNO1到6的氨基酸序列。源自突变体节杆菌属的种S34，FERM BP-6450微生物以及其它微生物的其它非还原性糖形成酶包含SEQ ID NO1到6的氨基酸序列中任意一种的全部或部分序列。其它酶的具体实例包括作为本发明非还原性糖形成酶起作用、最适温度在适中温度范围中、通常在高于40℃而低于60℃的温度范围中的重组酶。此重组酶可通过对编码本发明非还原性糖形成酶的DNA应用重组DNA技术而得到，可具有SEQ ID NO1到6的氨基酸序列中任意一种的全部或部分序列。
本发明大多数非还原性糖形成酶具有以下的理化特性(1)作用从葡萄糖聚合程度为3或更高的还原性部分淀粉水解物形成具海藻糖结构作为末端单元的非还原性糖；(2)分子量根据十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)约为75,000±10,000道尔顿；(3)等电点(pI)
用两性电解质等电点电泳，约为4.5±0.5；(4)最适温度当于pH6.0温育60分钟时大约为50℃；(5)最适pH当于50℃温育60分钟时大约为pH6.0；(6)热稳定性当于pH7.0温育60分钟时，在高达约55℃的温度下稳定；和(7)pH稳定性当于4℃温育24小时时，在大约pH5.0至10.0的pH稳定。
通过下述的制备方法，本发明非还原性糖形成酶可以预定的量获得。
本发明提供了编码本发明非还原性糖形成酶的DNA。这样的DNA在制备重组蛋白形式的酶时十分有用。一般地，此DNA包括编码与本发明非还原性糖形成酶不同出处/来源的酶的那些DNA。这些DNA的实例有含有全部或部分SEQ ID NO7的核苷酸序列或与其互补序列的那些DNA。包括全部SEQ ID NO7的核苷酸序列的DNA编码SEQ ID NO1的氨基酸序列。含有全部或部分SEQ ID NO7的核苷酸序列的DNA包括以下DNA，它们具有与本发明非还原性糖形成酶的特性表达有关的氨基酸序列、并且具有相应于该氨基酸序列的核苷酸序列，以及导入了一个或更多个碱基替代、缺失和/或添加而仍然维持与本发明非还原性糖形成酶的特性表达有关的核苷酸序列的SEQ ID NO7核苷酸序列。根据本发明的DNA应该包括根据遗传密码子的简并而以不同碱基替代一个或更多个碱基的那些DNA。根据本发明的DNA也包括那些含有编码本发明非还原性糖形成酶的核苷酸序列并且进一步包括选自以下的一个或多个其它附加核苷酸序列的DNA核糖体结合序列，如起始密码子，终止密码子和Shine-Dalgarno序列；编码信号肽的核苷酸序列，适当限制酶的识别序列；调节基因表达的启动子和增强子核苷酸序列；以及终止子，所以这些序列都常用于重组DNA技术中而用于制备重组蛋白。例如，由于部分及全部的SEQ ID NO8核苷酸序列作为核糖体结合序列而起作用，故可任意地将部分及全部SEQ ID NO8核苷酸序列连接到编码本发明非还原性糖形成酶的核苷酸序列上游的DNA用于制备重组蛋白形式的酶。
如上所述，编码本发明非还原性糖形成酶的DNA不应限制其出处/来源，并且，它们可根据用包含编码本发明酶至少一部分氨基酸序列，如SEQ ID NO1氨基酸序列的核苷酸序列的DNA进行的杂交，通过筛选不同来源的DNA而加以制备。这些来源的实例有节杆菌属的微生物，并且优选为节杆菌属的种S34，FERMBP-6450及其突变体，所有这些来源均产生非还原性糖形成酶。为了筛选这些微生物，可以使用该领域中用于筛选或克隆DNA的常规方法，如筛选重组文库的方法、PCR方法及其改进的方法。筛选的结果是所需DNA可以通过按常规方式收集以预期方式杂交的DNA而获得。一般地，这样得到的DNA包括部分或全部SEQ IDNO7核苷酸序列。例如，包括全部SEQ ID NO7核苷酸序列的DNA一般从节杆菌属的种S34，FERM BP-6450获得。包括部分SEQ ID NO7核苷酸序列的DNA可通过类似地从非上述菌株来源的能够产生本发明非还原性糖形成酶的微生物中筛选DNA而获得。通过从用一种或更多种常规突变导入技术而导入上述DNA中一个或更多个碱基替代、添加和/或缺失的DNA中筛选编码具有本发明酶特性酶的DNA，可以制备这样的DNA。也可根据编码本发明非还原性糖形成酶的核苷酸序列，如SEQ ID NO7的核苷酸序列，用常规化学合成法而得到此DNA。一旦获得，便可应用或使用PCR方法和可自主复制的载体将本发明DNA扩增至所需的水平。
本发明编码非还原性糖形成酶的DNA包括导入适当载体中的重组形式的DNA。只要该DNA可以得到，那么一般可通过重组DNA技术而相对容易地制备重组DNA。只要其能够在适当的宿主中自主地复制，那么任何类型的载体均可用于本发明中。这些载体的实例有用大肠杆菌作为宿主的pUC18，pBluescript IISK(+)，pKK223-3，λgt.λC等；用芽孢杆菌属微生物的pUB110，pTZ4，pC194，ρ11，φ1，φ105等；和用2种或更多种微生物作为宿主的pHY300PLK，pHV14，TRp7，YEp7，pBS7等。本发明中将该DNA插入载体中的方法可以是本领域中常用的方法。含有该DNA的基因及可自主复制的载体首先用限制酶消化和/或用超声破碎仪处理，然后连接得到的DNA片段和载体片段。通过用特异性切割该DNA的限制酶，特别是kpnI，AccI，BamHI，BstXI，EcoRI，HindIII，NotI，PstI，SacI，SalI，SmaI，SpeI，XbaI，XhoI等来促进连接。为了连接该DNA片段和载体，如果必要，首先将其退火，然后在体内或体外用DNA连接酶作用。这样得到的重组DNA可在适当宿主中基本上不受限制地复制。
编码非还原性糖形成酶的本发明DNA进一步包括该DNA已导入适当载体中的转化子。通过将该DNA或上述获得的重组DNA导入适当的宿主中将其转化，可容易地制备这些转化子。作为宿主，可以使用来自植物和动物的细胞以及微生物，它们在本领域中常用，并根据重组DNA中的载体而挑选。作为宿主的微生物包括埃希氏杆菌属、芽孢杆菌属和节杆菌属以及其它放线菌、酵母、真菌等。为了将此DNA导入这些宿主微生物，可以使用常规的感受态细胞方法和原生质体方法。编码非还原性糖形成酶并导入本发明转化子中的DNA可存在于染色体外的分离形式中，或以掺入形式存在于染色体中。掺入宿主染色体中的DNA具有能在其中稳定保持的特征，用于制备本发明重组蛋白比较有利。
本发明海藻糖释放酶可以需要的量通过下面制备酶的方法而得到，该方法特征在于其包括在营养培养基中培养能够产生该酶的微生物和从所得培养物中收集产生的酶。只要其能够产生酶，用于此方法中的微生物可不同于前面的属或种。这些微生物的实例有节杆菌属的微生物，节杆菌属的种S34，FERM BP-6450，其变异体以及可通过将编码该酶的DNA导入到适当的宿主中而得到的转化子。
只要前述的微生物能在其中生长并且产生此酶，则用于培养产生本发明非还原性糖形成酶的任何营养培养基均可使用。一般地，此营养培养基含有碳源和氮源，且如果必要，可加入矿物质。碳源的实例有糖如糊精、淀粉、部分淀粉水解物、葡萄糖等，和如糖蜜和酵母提取物之类含有糖的物质，以及有机酸如葡糖醛酸和琥珀酸。碳源的浓度根据所用的类型加以挑选，一般为30w/v％，并且优选15w/v％或更低。适用于本发明中的氮源的实例有含有无机氮的物质，如铵盐、硝酸盐等；含有有机氮的物质，如尿素、玉米浆、酪蛋白、蛋白胨、酵母提取物、牛肉提取物等。根据用途，可选择性使用无机成份，如钙、镁、钾、钠，磷酸，锰，锌，铁，铜，钼，钴的盐等。
用于制备本发明酶的培养条件可选择性地使用适用于培养相应微生物的适当条件。例如，用节杆菌属的微生物，包括节杆菌属的种S34，FERM BP-6450的情况时，培养温度一般在20-50℃，优选在25-37℃的范围；培养pH一般在pH4-10，优选在pH5-9的范围；培养时间在10-150小时的范围。用这些条件，在有氧条件下培养该微生物。当使用通过将编码本发明非还原性糖形成酶的DNA导入适当的宿主中而制备的转化子时，该转化子在下面的有氧条件下培养，如20-65℃的培养温度。pH2-9的培养pH和1-6天的培养时间，尽管它们依微生物的属、种、品系或型以及载体而变化。这样得到的培养物在细胞级分中一般含有本发明酶。在培养通过用芽孢杆菌属微生物作为宿主而得到的转化子时，根据用于转化宿主的载体，得到的培养基在上清液中可能含有本发明酶。这样得到的培养物中本发明酶的含量通常在每ml培养物中0.01-1,000个单位尽管其依据所用微生物的属、种、品系以及培养条件而变化。
从得到的培养物中收集本发明非还原性糖形成酶。收集方法没有限制。通过分离和收集任何一种发现具有该酶主要活性的细胞级分和培养物上清，并且如果必要则对收集的级分进行适当的纯化从而收集含有该酶的纯化级分，可以得到本发明酶。为了分离细胞级分与培养物上清，可以任意使用常规的固-液分离方法，如用预先覆盖滤膜和平纹及中空纤维膜进行离心和过滤。从分离的细胞级分和培养物上清中收集所需的级分。对于细胞级分，将细胞破碎成细胞碎片，然后将其分离成细胞提取物和不溶性细胞级分，再收集任意一种所需级分。如果必要，可通过常规方法将不溶性细胞级分溶解。作为裂解细胞的方法，可任意使用任何一种下面的技术，包括超声处理、以细胞壁裂解酶如溶菌酶和葡聚糖酶处理以及机械压力负荷。为了裂解细胞，可以用任何一种上述技术直接处理培养物，然后以任何一种上述的固-液分离方法处理所得混合物以收集液体级分。这样可任意得到细胞提取物。
用于进一步纯化本发明非还原性糖形成酶的方法包括一般纯化糖相关性酶的常规方法，如盐析、透析、过滤、浓缩、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、反相层析、亲和层析、凝胶电泳和等电点电泳。这些方法可根据目的联合使用。从通过这些方法分离而得到的级分中，收集通过非还原性糖形成酶的方法测得具有所需活性的级分，从而获得纯化至所需水平的本发明非还原性糖形成酶。根据下述实施例中方法，本发明酶可纯化至电泳纯的水平。如上所述，该方法提供以下形式的本发明非还原性糖形成酶，包括培养物、细胞级分、培养物上清级分、细胞裂解物、细胞提取物、可溶和不溶的细胞级分、部分纯化的酶级分和纯化的酶级分形式。这些级分可能含有其它类型的本发明海藻糖释放酶。使用前，这样获得的非还原性糖形成酶可用常规的方式加以固定。固定的方法有，例如结合至离子交换剂上的方法、共价结合/吸附到树脂和膜上，用高分子量物质的截流固定方法。这样获得的非还原性糖形成酶可任意用于制备糖的方法中，包括下述用于制备糖的本发明方法。特别地，由于本发明非还原性糖形成酶具有适中温度范围的最适温度，并且优选具有酸性pH范围内的最适pH，故当其与本发明下述的海藻糖释放酶、具有酸性pH范围内最适pH的淀粉脱支酶和在适中的温度范围中有效发挥作用的环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶联合使用时，其可有利地用于制备糖。
解释基于此氨基酸序列的本发明海藻糖释放酶，总体上，该酶具有SEQ IDNO9的氨基酸序列，并且在有些情况下具有SEQ ID NO10到16的氨基酸序列作为其部分序列。除了具有上述整个氨基酸序列的这些酶之外，本发明还包括另几种酶，其包括选自其中的任何一种氨基酸序列的一部分或同时具有本发明海藻糖释放酶功能和上述最适温度。这些酶的氨基酸序列的实例有这些，它们在其氨基酸序列内含有与本发明海藻糖释放酶特性的表达有关的部分氨基酸序列或氨基酸残基，并且其中一个或更多个氨基酸被不同的氨基酸所取代或向其中添加了氨基酸和/或缺失了除上述氨基酸序列或氨基酸残基外的其它氨基酸。在本发明中所称的被不同的氨基酸所取代的氨基酸序列实例包括这些，其中组成SEQ ID NO9氨基酸序列不到30％并且优选不到20％的氨基酸序列被具有类似特性和结构的其它氨基酸所取代。这种氨基酸分组的实例有作为酸性氨基酸的天冬氨酸与谷氨酸，作为碱性氨基酸的赖氨酸、精氨酸与组氨酸之一，作为酰胺型氨基酸的天冬酰胺与谷氨酰胺之一，作为羟基氨基酸的丝氨酸与苏氨酸之一，作为支链氨基酸的缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸之一。含有选自SEQ ID NO9到16的氨基酸序列中任何一种的一部分的本发明酶其它氨基酸序列的实例有这些，即它们可能与SEQ ID NO9氨基酸序列具有基本上类似的立体结构，即氨基酸的替代、缺失和/或添加被导入到SEQ ID NO9氨基酸序列中。蛋白的立体结构可通过以下方法加以估计，即对市售数据库进行筛选，以获得具有与目的序列有关的氨基酸序列并且已揭示了其立体结构的蛋白质的立体结构，参照选出的立体结构，并且用商业上可得到的软件观看立体结构。本发明海藻糖释放酶的上述氨基酸序列与SEQID NO9具有至少60％，优选至少70％，更为优选至少80％的同源性。
如上所述，该海藻糖释放酶不应限于特定的出处/来源。这些酶的实例有源自微生物，即节杆菌属微生物，节杆菌属的种S34，FERM BP-6450，及其变异体的那些酶。这些变异体可通过以下方法获得，即用已知的诱变剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍、甲基磺酸乙酯、紫外线和转座子，以常规方式处理节杆菌属的种S34，FERM BP-6450；筛选能够产生海藻糖释放酶并且具有适中温度范围的最适温度、通常在高于45℃而低于60℃温度范围的温度具有最适温度的所需突变体。源自节杆菌属的种S34，FERM BP-6450的酶通常具有SEQ ID NO9到16的氨基酸序列。源自突变体节杆菌属的种S34，FERM BP-6450微生物以及其它微生物的其它海藻糖释放酶包括SEQ ID NO9到16的氨基酸序列中任意一种的全部或部分序列。其它酶的具体实例包括作为本发明海藻糖释放酶起作用、最适温度在适中温度范围中、通常在高于45℃而低于60℃的温度范围中的重组酶。此重组酶可通过对编码本发明海藻糖释放酶的DNA应用重组DNA技术而得到，可具有SEQ ID NO9到16的氨基酸序列中任意一种的全部或部分序列。
本发明大多数海藻糖释放酶具有以下的理化特性(1)作用在海藻糖结构与其余部分之间的位点特异性水解具有海藻糖结构作为末端单元的非还原性糖；(2)分子量根据十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)约为62,000±5,000道尔顿；(3)等电点(pI)用两性电解质等电电泳约为4.7±0.5；(4)最适温度当于pH6.0温育30分钟时大约为50℃-55℃；(5)最适pH当于50℃温育30分钟时大约为pH6.0；(6)热稳定性当于pH7.0温育60分钟时，在高达大约pH50℃的温度下稳定；和(7)pH稳定性当于4℃温育24小时时，在大约pH4.5至10.0时比较稳定。
通过下述的制备方法，本发明海藻糖释放酶可以预定的量获得。
本发明提供了编码本发明海藻糖释放酶的DNA。这样的DNA在制备重组蛋白形式的酶时十分有用。一般地，此DNA包括编码与本发明海藻糖释放酶不同出处/来源的酶的那些DNA。这些DNA的实例有含有全部或部分SEQ ID NO17的核苷酸序列或与其互补的序列的那些DNA。包含全部SEQ ID NO17的核苷酸序列的DNA编码SEQ ID NO9的氨基酸序列。含有全部或部分SEQ ID NO17核苷酸序列的DNA包括以下DNA，它们具有相应于与本发明海藻糖释放酶的特性表达有关的氨基酸序列的核苷酸序列，以及导入了一个或更多个碱基替代、缺失和/或添加而仍然维持与本发明海藻糖释放酶的特性表达有关的核苷酸序列的SEQ IDNO17核苷酸序列。根据本发明的DNA应该包括根据遗传密码子的简并而以不同碱基替代一个或更多个碱基的那些DNA。根据本发明的DNA也包括那些含有编码本发明海藻糖释放酶的核苷酸序列，并且进一步包括选自以下的一个或多个其它附加核苷酸序列的DNA核糖体结合序列，如起始密码子，终止密码子和Shine-Dalgarno序列；编码信号肽的核苷酸序列，适当限制酶的识别序列；调节基因表达的启动子和增强子核苷酸序列；以及终止子，所以这些序列都常用于重组DNA技术中而用于制备重组蛋白。例如，由于部分及全部SEQ ID NO8的核苷酸序列作为核糖体结合序列而起作用，故可任意地将部分及全部SEQ ID NO8核苷酸序列连接到编码本发明海藻糖释放酶核苷酸序列上游的DNA用于制备重组蛋白形式的酶。
如上所述，编码本发明海藻糖释放酶的DNA不应限制其出处/来源，并且，它们可根据用包含编码本发明酶至少一部分氨基酸序列，如SEQ ID NO9氨基酸序列的核苷酸序列的DNA进行的杂交，通过筛选不同来源的DNA而加以制备。这些来源的实例有节杆菌属的微生物，并且优选为节杆菌属的种S34，FERM BP-6450及其突变体，所有这些来源均产生海藻糖释放酶。为了筛选这些微生物，可以使用该领域中用于筛选或克隆DNA的常规方法，如筛选重组文库的方法、PCR方法及其改进的方法。筛选的结果是所需DNA可以通过按常规方式收集以预期方式杂交的DNA而获得。一般地，这样得到的DNA包括部分或全部SEQ ID NO17核苷酸序列。例如，包括全部SEQ ID NO17核苷酸序列的DNA一般从节杆菌属的种S34，FERM BP-6450获得。包括部分SEQ ID NO17核苷酸序列的DNA可通过类似地从非上述菌株来源的能够产生本发明海藻糖释放酶的微生物中筛选DNA而获得。通过从用一种或更多种常规突变导入技术而导入上述DNA中一个或更多个碱基替代、添加和/或缺失的DNA中筛选编码具有本发明酶特性的酶的DNA，可以制备这样的DNA。也可根据编码本发明海藻糖释放酶的核苷酸序列，如SEQ IDNO17的核苷酸序列，用常规化学合成法而得到此DNA。一旦获得，便可应用或使用PCR方法和可自主复制的载体将本发明DNA扩增至所需的水平。
本发明编码海藻糖释放酶的DNA包括导入适当载体中的重组形式的DNA。只要该DNA可以得到，那么一般可通过重组DNA技术而相对容易地制备重组DNA。只要其能够在适当的宿主中自主地复制，那么任何类型的载体均可用于本发明中。这些载体的实例有用大肠杆菌作为宿主的pUC18，pBluescript II SK(+)，pKK223-3，λgt.λC等；用芽孢杆菌属微生物的pUB110，pTZ4，pC194，ρ11，φ1，φ105等；和用2种或更多种微生物作为宿主的pHY300PLK，pHV14，TRp7，YEp7，pBS7等。本发明中将该DNA插入载体中的方法可以是本领域中常用的方法。含有该DNA的基因及可自主复制的载体首先用限制酶消化和/或用超声破碎仪处理，然后连接得到的DNA片段和载体片段。通过用特异性切割该DNA的限制酶，特别是kpnI，AccI，BamHI，BstXI，EcoRI，HindIII，NotI，PstI，SacI，SalI，SmaI，SpeI，XbaI，XhoI等来促进连接。为了连接该DNA片段和载体，如果必要，首先将其退火，然后在体内或体外用DNA连接酶作用。这样得到的重组DNA可在适当宿主中基本上不受限制地复制。
编码海藻糖释放酶的本发明DNA进一步包括该DNA已导入适当载体中的转化子。通过将该DNA或上述获得的重组DNA导入适当的宿主中将其转化，可容易地制备这些转化子。作为宿主，可以使用来自植物和动物的细胞以及微生物，它们在本领域中常用，并根据重组DNA中的载体而挑选。作为宿主的微生物包括埃希氏杆菌属、芽孢杆菌属和节杆菌属以及其它放线菌、酵母、真菌等。为了将此DNA导入这些宿主微生物，可以使用常规的感受态细胞方法和原生质体方法。编码海藻糖释放酶并导入本发明转化子中的DNA可存在于染色体外的分离形式中，或以掺入形式存在于染色体中。掺入宿主染色体中的DNA具有能在其中稳定保持的特征，用于制备本发明重组蛋白比较有利。
前述用于获得本发明DNA(包括重组DNA和转化子)的技术以及用于获得DNA和重组蛋白的技术常用于本领域中；例如，在J.Sambrook等编，由冷泉港实验室出版社(1989)出版的“分子克隆实验手册”第2版中详细公开了用于获得所需DNA的方法和所获得的DNA在制备中的应用。例如，日本专利No.2,576,970公开了用目的基因缺陷的微生物作为宿主而稳定转化DNA的方法。日本专利公开No.157,987/88公开了可在芽孢杆菌属微生物中有效表达目的DNA的一种载体。日本专利公表No.502,162/93公开了稳定导入所需DNA至细菌染色体中的方法。日本专利公表No.506,731/96公开了用重组DNA技术有效制备淀粉水解酶的方法。日本专利公表No.500,543/97和500,024/98公开了用真菌有效制备重组蛋白的宿主一载体系统。常用于本领域中的这些方法可任意用于本发明中。
在本领域中，当所需的DNA可用上述方法得到时，通常可提供该DNA被导入适当植物和动物中的转化子，即转基因植物和动物。以DNA形式导入适当载体中、编码非还原性糖形成酶和海藻糖释放酶的本发明DNA也包括转基因植物和动物。为了得到转基因动物，大体上可通过以下方法获得，即，将权编码本发明任意一种酶的DNA或者与其它所需DNA(如启动子及增强子)一起，插入根据宿主动物的种类而选择的适当载体中，通过如显微注射和电穿孔方法，或通过用含有该重组DNA的重组病毒的感染方法，将得到的重组DNA导入宿主动物的受精卵或胚胎干细胞。宿主动物的实例有常规实验用啮齿类，如小鼠、大鼠和仓鼠；和常用作家养动物的哺乳动物，如山羊、绵羊、猪和母牛，所以这些均具有容易饲养的优势。将得到的导入有该DNA的细胞移植到与细胞相同种的假孕雌性动物的输卵管或子宫内。之后，从自然产或破腹产新生动物中获得转基因动物，通过杂交或PCR方法证实其中导入有编码本发明酶的DNA。这样便获得了转基因动物形式的本发明DNA。转基因动物的有关内容详细公开于由Masami MATSUMURA，HirotoOKAYAMA和Tadashi YAMMOTO编、由日本东京Yodosha有限公司出版的“Jikken-Igaku-Bessatsu-Shin-Idennshi-Kogaku-Handbook”(遗传工程手册)第269-283页(1996)中。获得转基因植物的方法包括，例如，提供对植物具有感染性的农杆菌属微生物载体，将编码本发明任一种酶的DNA导入该载体中，再将得到的重组DNA导入植物体中或原生质体中，或者以包括编码本发明任一种酶的核苷酸序列的DNA包被重金属颗粒并且直接将包被的颗粒用粒子枪注射入植物体内或原生质体内。尽管各种植物可用作宿主植物，但它们通常包括可食用植物，如土豆、大豆、小麦、大麦、水稻、玉米、番茄、莴苣、苜蓿、苹果、桃、瓜等。通过对上面转化的植物体或原生质体应用杂交或PCR方法，筛选出含有所需DNA的转化子。此转化的原生质体可再生成植物体，作为转基因植物形式的本发明DNA。转基因植物技术一般公开于由Jane K. Setlow编，美国纽约Plenum出版公司出版的《遗传工程》(1994)16卷第93-113页中。前述转基因动植物形式的DNA可用作本发明非还原性糖形成酶和/或海藻糖释放酶的来源，并可用作含有海藻糖或具有海藻糖结构的非还原性糖的食用动植物。
本发明海藻糖释放酶可以需要的量通过下面制备酶的方法而得到，该方法特征在于其包括在营养培养基中培养能够产生该酶的微生物和从所得培养物中收集产生的酶。只要其能够产生本发明海藻糖释放酶，用于此方法中的微生物可为不同的属或种。这些微生物的实例有节杆菌属的微生物，节杆菌属的种S34，FERMBP-6450，其变异体以及可通过将编码该酶的DNA导入到适当的宿主中而得到的转化子。
只要前述的微生物能在其中生长并且产生此酶，则用于培养产生本发明海藻糖释放酶的任何营养培养基均可使用。一般地，此营养培养基含有碳源和氮源，且如果必要，可加入矿物质。碳源的实例有糖如糊精、淀粉、部分淀粉水解物、葡萄糖等，和如糖蜜和酵母提取物之类含有糖的物质，以及有机酸如葡糖醛酸和琥珀酸。碳源的浓度根据所用的类型加以挑选，一般为30w/v％，并且优选15w/v％或更低。适用于本发明中的氮源的实例有含有无机氮的物质，如铵盐、硝酸盐等；含有有机氮的物质，如尿素、玉米浆、酪蛋白、蛋白胨、酵母提取物、牛肉提取物等。根据用途，可选择性使用无机成份，如钙、镁、钾、钠，磷酸，锰，锌，铁，铜，钼，钴等的盐。
用于制备本发明海藻糖释放酶的培养条件可选择性地使用适用于培养相应微生物的适当条件。例如，用节杆菌属的微生物，包括节杆菌属的种S34，FERMBP-6450的情况时，培养温度一般在20-50℃，优选在25-37℃的范围；培养pH一般在pH4-10，优选在pH5-9的范围；培养时间在10-150小时的范围。用这些条件，在有氧条件下培养该微生物。当使用通过将编码本发明海藻糖释放酶的DNA导入适当的宿主中而制备的转化子时，该转化子在下面的有氧条件下培养，如20-65℃的培养温度，pH2-9的培养pH和1-6天的培养时间，尽管它们依微生物的属、种、品系或型以及载体而变化。这样得到的培养物在细胞级分中一般含有本发明酶。在培养通过用芽孢杆菌属微生物作为宿主而得到的转化子时，根据用于转化宿主的载体，得到的培养基在上清液中可能含有本发明酶。这样得到的培养物中本发明酶的含量通常在每ml培养物中0.01-3,000个单位，尽管其依据所用微生物的属、种、品系以及培养条件而变化。
从得到的培养物中收集本发明海藻糖释放酶。收集方法没有限制。通过分离和收集任何一种发现具有该酶主要活性的细胞级分和培养物上清，并且如果必要则对收集的级分进行适当的纯化从而收集含有该酶的纯化级分，可以得到本发明酶。为了分离细胞级分与培养物上清，可以任意使用常规的固-液分离方法，如用预先覆盖的滤膜和平纹及中空纤维膜进行离心和过滤。从分离的细胞级分和培养物上清中收集所需的级分。对于细胞级分，将细胞破碎成细胞碎片，然后将其分离成细胞提取物和不溶性细胞级分，再收集任意一种所需级分。如果必要，可通过常规方法将不溶性细胞级分溶解。作为裂解细胞的方法，可任意使用任何一种下面的技术，包括超声处理、以细胞壁裂解酶如溶菌酶和葡聚糖酶处理以及机械压力负荷。为了裂解细胞，可以用任何一种上述技术直接处理培养物，然后以任何一种上述的固-液分离方法处理所得混合物以收集液体级分。这样可任意得到细胞提取物。
用于进一步纯化本发明海藻糖释放酶的方法包括一般纯化糖相关性酶的常规方法，如盐析、透析、过滤、浓缩、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、反相层析、亲和层析、凝胶电泳和等电点电泳。这些方法可根据目的联合使用。从通过这些方法分离而得到的级分中，收集通过海藻糖释放酶的方法测得具有所需活性的级分，从而获得纯化至所需水平的酶。根据下述实施例中方法，本发明酶可纯化至电泳纯的水平。如上所述，该方法提供以下形式的本发明海藻糖释放酶，包括培养物、细胞级分、培养物上清级分、细胞裂解物、细胞提取物、可溶和不溶的细胞级分、部分纯化的酶级分和纯化的酶级分形式。这些级分中可能含有其它类型的本发明非还原性糖形成酶。使用前，这样获得的海藻糖释放酶可用常规的方式加以固定。固定的方法有，例如结合至离子交换剂上的方法、共价结合/吸附到树脂和膜上，用高分子量物质的截流固定方法。这样获得的海藻糖释放酶可任意用于制备糖的方法中，包括下述用于制备糖的方法。特别地，由于本发明海藻糖释放酶具有适中温度范围中的最适温度，并且优选具有酸性pH范围的最适pH，故当其与本发明上述的非还原性糖形成酶、具有酸性pH范围内最适pH的淀粉脱支酶和在适中的温度范围中有效发挥作用的环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶联合使用时，其可有利地用于制备糖。
本发明提供了通过用本发明前述的酶制备包含非还原性糖的糖类的方法；此方法包括以下步骤使非还原性糖形成酶和/或海藻糖释放酶作用于还原性部分淀粉水解物以形成非还原性糖，以及收集得到的非还原性糖或具有较低还原性的非还原性糖组合物。在该方法中，一种或更多种其它非本发明非还原性糖形成酶和海藻糖释放酶以及其它糖相关性酶的使用不应该排除在本发明之外。用于本发明方法中的还原性部分淀粉水解物可以不依赖于其出处/来源而加以使用。本发明中所称的非还原性糖包括一般的非还原性糖，如海藻糖和具有海藻糖结构的糖。
用于本发明制备糖类的方法中的还原性部分淀粉水解物可以，例如通过常规方法液化淀粉或淀粉状物质而获得。此淀粉包括地面淀粉，如玉米淀粉、水稻淀粉和小麦淀粉；以及地下淀粉，如土豆淀粉、甜菜淀粉和木薯淀粉。为了液化这些淀粉，一般将它们在水中悬浮成淀粉悬液，优选为至少10w/w％的浓度，并且更为优选具有大约20到50w/w％的浓度，并且以机械、酸和/或酶处理。使用相对较低程度的液化比较让人满意，优选地，DE(葡萄糖当量)低于15，更为优选DE低于10。当用酸液化时，用盐酸、磷酸、草酸等处理淀粉，然后在使用前用碳酸钙、氧化钙、碳酸钠等中和得到的混合物至所需的pH。用酶液化淀粉时，使用α-淀粉酶，特别是热稳定的α-淀粉酶比较让人满意。这样得到的液化淀粉可进一步用α-淀粉酶、形成麦芽三糖的淀粉酶、形成麦芽四糖的淀粉酶、形成麦芽五糖的淀粉酶、形成麦芽六糖的淀粉酶等处理，得到的反应混合物可用作还原性部分淀粉水解物。淀粉相关性酶的特性详细描述于由Pergamon出版社出版的《淀粉酶和相关酶手册》，18-81和125-142页(1988)中。
将这样得到的还原性部分淀粉水解物用本发明非还原性糖形成酶和/或海藻糖释放酶作用，并且如果必要，进一步用一种或更多种淀粉相关性酶作用，如α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、淀粉脱支酶如异淀粉酶和支链淀粉酶、环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶(cyclomatodextrin glucanotransferase)、α-葡糖苷酶和β-呋喃果糖苷酶。用于酶促反应的条件为适于所用酶的那些条件；一般地，酶促反应条件选自pH4-10和20-70℃，并且优选pH5-7和30-60℃。特别地，非还原性糖可通过在适中温度范围，即高于40℃但低于60℃或高于45℃但低于60℃的温度下及微酸性或酸性pH条件通过酶促反应而有效制备。使不同酶作用于还原性部分淀粉水解物的顺序没有限制，一种可在另一种酶之前或之后使用，或任意将多种酶同时作用于底物。
根据酶促条件和反应时间以及非还原性糖或含有该糖的较低还原性的糖组合物的最终用途而适当设定酶量。对于本发明非还原性糖形成酶和海藻糖释放酶而言，前者以大约0.01到100单位/g固体还原性部分淀粉水解物的量使用，后者以大约1到10,000单位/g固体还原性部分淀粉水解物的量使用。环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶以大约0.05到500单位/g固体还原性部分淀粉水解物，d.s.b的量使用。用这些酶获得的反应混合物一般含有海藻糖、α-葡糖基海藻糖、α-麦芽糖基海藻糖、α-麦芽三糖基海藻糖、α-麦芽四糖基海藻糖或α-麦芽五糖基海藻糖。在上面方法中，当联合使用时，本发明非还原性糖形成酶和海藻糖释放酶与淀粉脱支酶和环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶一起特征性更多地产生大量的海藻糖和具有海藻糖结构的相对低分子量的非还原性糖。
从得到的反应混合物中，收集非还原性糖和具有较低还原性的糖组合物。在这些制备步骤中，可适当选择通常加工糖的方法。将得到的反应混合物经过滤和离心从而去除不溶性物质，然后用活性炭脱色而纯化得到的溶液，用H-或OH-形式的离子交换剂脱盐，并且浓缩成糖浆产物。如果必要，此糖浆产物可进一步纯化成具有较高纯度的非还原性糖；在纯化中，可以使用一种或更多种方法，例如，柱层析分级分离，如离子交换柱层析，用活性炭或硅胶的柱层析，用有机物如丙酮和乙醇的分离沉淀；用具有适当分离能力的膜的分离；和碱处理以分解和去除剩下的还原性糖。特别地，离子交换柱层析可适当地用于本发明中作为工业规模制备目的糖。具有改进纯度的非还原性糖例如，可通过用在日本专利公开No.23,799/83和72,598/83中所述的强酸性阳离子交换树脂的柱层析以去除伴生的糖而任意地加以制备。在此情况下，可以利用任何固定床、移动床和半移动床方法。
如果必要，可用淀粉酶如α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶水解得到的非还原性糖或含有非还原性糖的相对较低还原性的糖类，从而控制其甜度和还原能力或降低其粘度；这样得到的产物可进一步进行以下的处理，其中将剩余的还原性糖氢化成糖醇从而降低其还原能力。特别地，通过使葡糖淀粉酶或α-葡糖苷酶作用于非还原性糖或含有非还原性糖的相对较低还原性的糖类，可容易地制备海藻糖。通过使葡糖淀粉酶或α-葡糖苷酶作用于这些糖从而形成海藻糖和葡萄糖的混合物，并且对此混合物进行前述的纯化方法，如离子交换柱层析，以去去除葡萄糖，可获得高海藻糖含量的级分。高海藻糖含量的级分可任意纯化并且浓缩成糖浆产物。如果必要，此糖浆产物可浓缩成超饱和溶液，然后结晶水合或非水合的晶体海藻糖，并回收得到的晶体。
为了制备水合的晶体海藻糖，将纯度大约60w/w％或更高的大约65-90w/w％溶液置于结晶仪中，如果必要，在0.1-20w/v％晶种存在下，在95℃或更低的温度下，并且优选在10-90℃的温度下，逐渐冷却同时搅拌，从而获得含有水合的晶体海藻糖的糖膏。可任意使用连续结晶方法，从而在真空浓缩条件下完成结晶。
常规方法如分离、大块粉碎、流床颗粒化和喷雾干燥可用于本发明中，从而从糖膏水合晶体海藻糖或含有海藻糖晶体的晶体糖类中分离。
在分离的情况，通常对糖膏进行桶式离心，从而将水合晶体海藻糖与母液分离，如果必要，通过喷洒少量冷水冲洗该水合晶体海藻糖，以利于制备具有较高纯度的水合晶体海藻糖。在喷洒干燥的情况，不具有或基本上不具有吸水性的结晶糖类通过下面方法可容易制备，包括通过高压泵喷头喷洒具有70-85w/w％浓度(基于干燥固体，dsb)大约20-60％结晶度(基于干燥固体，dsb)的糖膏；用加热至60-100℃而不会融化所得晶体粉末的空气干燥得到的产物；并且老化得到的粉末大约1到20小时，同时向其中吹入热至30-60℃的空气。在大块粉碎的情况，不具有或基本上不具有吸水性的结晶糖类通过下面方法可容易制备，包括使具有10-20％w/w湿度含量和大约10-60％结晶度(d.s.b)的糖膏静置大约0.1到3天从而使全部组分结晶并固化成块；并且粉碎或切割得到的固体块。
为了得到无水结晶海藻糖，将上面得到的水化晶体海藻糖在70-160℃并且优选在80-100℃的温度于正常或减压下干燥；或者将具有不到10％湿度的相对高浓度和含量的海藻糖溶液置于结晶仪中，在晶种存在下于50-160℃并且优选在80-140℃的温度搅拌，从而制备含有非水合晶体海藻糖的糖膏，并且用诸如块粉碎、流床粒化和喷洒干燥之类方法在相对高温和干燥条件下处理此糖膏。
这样获得的非还原性糖或含有该成份并具有相对低还原性的糖组合物具有低的还原性和满意的稳定性；当与其它物质如氨基酸、寡肽或蛋白混合并一起处理时，它们不变成棕色、不产生令人不快的气味，并且不使后面的其它物质变质。即使具有相对低的还原性，但上述的糖仍具有相对低的粘度，并且那些具有平均相对较低葡萄糖聚合程度的糖类具有相对高的质量和甜度。这些糖可任意用于食品、化妆品和药品等领域中，如在以下的日本专利公开中所公开的领域，包括No.66,187/96，66,188/96，73,482/96，73,506/96，73,504/96，336,363/96，9,986/97，154,493/97，252,719/97，66,540/98，和168,093/98；以及日本专利申请No.236,441/97，256,219/97，268,202/97，274,962/97，320,519/97，338,294/97，55,710/98，67,628/98，134,553/98和214,375/98，所以这些均由与本发明相同的申请人申请过。
下面的实施例更为详细地描述本发明实施例1能够产生非还原性糖形成酶和海藻糖释放酶的微生物本发明者广范地筛选土壤，以分离能够产生非还原性糖形成酶和海藻糖释放酶的微生物。结果，他们从日本Ako，Hyogo的土壤中分离到具有该特性的微生物，并且根据在由Takeji Hasegawa编由日本东京科学学会出版社出版的“Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei”(微生物的分类和鉴定)(1985)中所述的方法加以鉴定。结果如下细胞形态学结果(1)当于37℃在营养琼脂培养基中培养时的细胞特征通常以0.4-0.5×0.8-1.2um的杆状形式存在；以单一形式存在，但极少数情况下以多态形式存在；无活动性；不产芽孢；非酸性快速；及革兰氏染色阳性。
(2)当于37℃在EYG营养琼脂中培养时的细胞特征显示出杆状和球状的生长周期。
培养特性结果(1)当于37℃在营养琼脂培养平板中培养时所形成菌落的特征形状2天培养后具有大约1-2mm直径的圆形菌落；边缘完整；突出情况突出；光泽潮湿光泽表面平整；及颜色半透明或奶黄色。
(2)当于37℃在营养琼脂斜面中培养时形成菌落的特征生长满意；和形状线样。
(3)当于37℃在具有酵母提取物和蛋白胨的琼脂斜面中培养时形成菌落的特征生长满意；和形状线样。
(4)当于27℃在营养明胶培养基中穿刺培养时形成菌落的特征没有液化明胶。
生理特性的结果(1)甲基红测试阴性(2)VP测试阳性(3)吲哚的形成阴性(4)硫化氢的形成阴性(5)淀粉的水解阳性(6)明胶的液化阴性(7)柠檬酸的利用阳性(8)无机氮源的利用利用硝酸盐但不利用铵盐(9)色素的形成无(10)脲酶阴性(11)氧化酶阴性(12)过氧化氢酶阳性(13)生长范围在pH4.5-8.0和20-50℃的范围生长；并且最适温度30-45℃。
(14)氧气需求需氧(15)碳源的利用L-阿拉伯糖同化D-葡萄糖同化D-果糖不同化D-半乳糖不同化L-鼠李糖不同化D-木糖不同化D-甘露糖同化棉籽糖不同化海藻糖不同化蔗糖不同化麦芽糖不同化乳糖不同化D-半乳糖醇不同化D-甘露糖醇不同化葡萄糖醛酸同化琥珀酸同化烟酸不同化L-马来酸同化乙酸同化乳酸同化(16)从糖中形成酸L-阿拉伯糖略微形成D-葡萄糖略微形成D-果糖不形成D-半乳糖略微形成L-鼠李糖略微形成D-木糖略微形成甘油略微形成棉籽糖不形成海藻糖略微形成蔗糖略微形成麦芽糖略微形成乳糖不形成(17)氨基酸的利用不利用L-谷氨酸钠、L-天冬氨酸钠、L-组氨酸和L-精氨酸。(18)对氨基酸的脱羧酶测试对L-赖氨酸、L-鸟氨酸和L-精氨酸为阴性。(19)脱氧核糖核酸酶阴性(20)细胞壁的N-酰基类型乙酰基(21)细胞壁的主要二氨基酸赖氨酸(22)DNA的鸟嘌呤(G)加上胞嘧啶(C)的摩尔百分数71.2％
参照《伯杰氏系统细菌学手册》(Borgey’s Manual of SystematicBactenioligy)第二卷(1984)，将这些细菌学特性与已知微生物的特性进行比较。结果显示此微生物被鉴定为节杆菌属的新种。根据这些结果，本发明者将此微生物命名为“节杆菌属的种S34”(“Arthrobacter sp S34”)。该微生物于1998年8月6日以FERM BP-6450的许可号保藏于日本国际贸易与工业部工业科技署国立生物科学与人类技术研究所专利微生物保藏中心(1-3，Higashi，1chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566)并被接受。
根据《伯杰氏系统细菌学手册》第一卷(1984)中的DNA-DNA杂交方法，检测此鉴定出的微生物与保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(美国的国际微生物保藏库)的节杆菌属模式株DNA之间的同源性。示于下表1中的12种模式株分别以正常方式培养，并且从得到的培养物中收集增殖的细胞。通过下述实施例2-1中的种子培养物方法，培养节杆菌属的种S34，FERM BP-6450，然后收集增殖的细胞。根据常规方法，从每种模式株微生物中获得DNA，将该DNA的2微克等分液用限制酶PstI消化。将得到的消化的混合物分别点于“Hybond-N+”(一种由Amersham International，Arlington Heights，IL，USA商业化的尼龙膜)上，并且以常规的方式用碱处理，中和并干燥，从而将此DNA固定于尼龙膜上。取从节杆菌属的种S34，FERM BP-6450获得的1微克DNA并且用限制酶PstI消化。用由Amersham International，Arlington Heights，IL，USA商业化的[α-32P]dCTP，和“READY-TO-GODNA标记试剂盒”(一种由Pharnacia LKBBiotechnology AB，Uppsala，Sweden商业化的DNA标记试剂盒)，将消化产物用同位素标记以获得探针。将该探针与上述固定于尼龙膜上的DNA在振荡条件下于65℃于“快速杂交缓冲液”(一种Amersham Corp.，Div.，AmershamInternational，Arlington Heights，IL，USA商业化的杂交缓冲液)中杂交2小时。杂交后的尼龙模以常规的方式冲洗、干燥并且以常规方式进行放射自显影。放射自显影中观察到的杂交信号于“IMAGE MASTER”(一种由Pharmacia LKBBiotechnology AB，Uppsala，Sweden商业化的图形分析系统上)进行分析，然后数字化表示杂交信号的强度。根据数字，通过以下方法计算来自模式株DNA的点的相对强度(％)，即将节杆菌属的种S34，FERM BP-6450的DNA点的信号强度看作100，并且用作该微生物与模式株间DNA同源性的指标。结果列于表1中。
表1微生物菌株杂交信号强度黑蓝节杆菌，ATCC 1375242.0金黄节杆菌，ATCC 1334412.4柠檬节杆菌，ATCC 1162436.2成晶节杆菌，ATCC 1548131.6球形节杆菌，ATCC 8010 55.1烟草节杆菌，ATCC 1523618.8氧化节杆菌，ATCC 1435828.3滋养节杆菌，ATCC 1334624.6原玻璃蝇节杆菌，ATCC 1927129.3分枝节杆菌，ATCC 1372798.6产脲节杆菌，ATCC 7562 42.3粘节杆菌，ATCC 19584 0.0节杆菌属的种S34，FERM BP-6450 100如表1中所示，来自分枝节杆菌模式菌株，ATCC 13727的DNA点的杂交信号强度高达98.6％。此数据显示在此实施例中所用的12种模式菌株中，节杆菌属的种S34，FERM BP-6450与其中的分枝节杆菌模式菌株，ATCC 13727具有最高的同源性。上述结果显示，节杆菌属的种S34，FERM BP-6450为与分枝节杆菌模式菌株，ATCC 13727密切相关的新的微生物。
实施例2非还原性糖形成酶实施例2-1酶的制备制备由以下成份所组成的营养培养基1.0w/v％的“PINE-DEX#4”(一种由Matsutani Chemical Ind.，东京，日本所商业化的糊精)、0.5w/v％的蛋白胨、0.1％w/v％的酵母提取物、0.1w/v％的磷酸二氢钠、0.06w/v％的磷酸氢二钾、0.05w/v％的硫酸镁和水，并将培养基调节至pH7.0。将大约100ml等分的培养基置于500-ml Erlenmeyer瓶中，然后于120℃高压蒸汽灭菌20分钟并且冷却，然后接种节杆菌属的种S34，FERM BP-6450种子液，并且在260rpm的振荡条件下于37℃培养48小时，以获得种子培养物。
除了含有0.05w/v％的“KM-75”(一种由日本东京Shi-Etsu化工有限公司商业化的抗泡沫剂)外，将与用于种子培养物中的相同的营养培养基大约20升置于30升的发酵罐中，灭菌，冷却至37℃，并且用1v/v％的种子培养物接种至该培养基中，然后在有氧并搅拌的条件下于37℃，及5.5-7.5的pH培养大约72小时。
取样得到的部分培养物并离心，从而分离成细胞和培养物上清。将细胞超声破碎并且离心，从而从细胞提取物中收集上清。对每个培养物上清及细胞提取物中非还原性糖形成酶活性的测定显示酶活性相对较低。后者相对于1毫升培养物中显示出大约0.1单位。
实施例2-2酶的纯化将按实施例2-1中方法获得的大约80升培养物以8,000rpm离心30分钟，从而获得大约800克湿重细胞。将湿细胞悬浮于2升10M的磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，并且用“MODEL UH-600”(一种日本东京SMT公司商业化的超声匀浆器)处理。得到的培养物以10,000rpm离心30分钟，从而获得大约2升的培养物上清。向此培养物上清中加入硫酸铵并且使其溶解，从而得到0.7的饱和度，使该混合物在4℃静置24小时并以10,000rpm离心30分钟从而获得沉淀物。将这样获得的沉淀物溶解于10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，并且对与上述同样的新鲜缓冲液制品透析48小时，然后将透析的内部溶液以10,000rpm离心30分钟从而去除不溶性物质。将大约1升的所得溶液用装入了大约1.3升“SEPABEADS FP-DA13 GEL”(一种由日本东京Mitsubishi化工有限公司商业化的阴离子交换剂)的柱进行离子交换柱层析。用含有从0M增加到0.6M盐的10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)这种线性梯度缓冲液进行洗脱步骤。分级分离柱中的洗脱物，分别分析这些级分的非还原性糖形成酶活性。结果发现，在用具有大约0.2M盐浓度的缓冲液洗脱后收集到的级分中发现有异常高的酶活性。
将硫酸铵加入到得到的溶液中以得到1M的浓度，使该混合物在4℃静置12小时，以10,000rpm离心30分钟从而收集上清。将这样得到的的上清用装入了“BUTYL TOYOPEARL 650M GEL”(一种由日本东京Tosoh公司商业化的疏水凝胶)的柱进行疏水柱层析。所用的凝胶体积大约300ml，用含有1M硫酸铵的10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)平衡后使用。在进样过程中用含有从1M降低到0M硫酸铵的10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)线性梯度缓冲液进行洗脱步骤。分级分离柱中的洗脱物，并且分别分析这些级分的非还原性糖形成酶活性。结果，在以具有大约0.75M盐浓度的缓冲液洗脱后收集到的级分中发现有异常高的酶活性，将这些级分合并在一起。
将获得的溶液于10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中透析，将所得透析过的内部溶液以10,000rpm离心30分钟从而收集上清，然后将此上清用装入大约40ml“DEAE TOYOPEARL 650S GEL”(一种由日本东京Tosoh公司商业化的阴离子交换剂)的柱进行离子交换柱层析。在进样过程中用含有从0M增加到0.2M的线性盐水溶液进行洗脱步骤。分级分离柱中的洗脱物，并且分别分析这些级分的非还原性糖形成酶活性。结果，在以具有大约0.15M盐浓度的缓冲液洗脱后收集到的级分中发现有异常高的酶活性。将这样得到的溶液进一步用装入了大约380ml“ULTROGELR AcA44 GEL”(一种由法国Sepracor/IBF s.a. Villeneuve laGarenne商业化的用于凝胶柱层析的凝胶)的柱进行凝胶柱层析，然后收集具有所需酶活性的级分。上述纯化步骤中非还原性糖形成酶活性、比活性和产率的水平列于表2中。
表2纯化步骤非还原性糖形 比活性 产率成酶活性(单位/mg蛋白) (％)细胞提取物 8,000 - 100以硫酸铵盐析 7,500 0.2 94后透析内部溶液来自SEPABEADS 5,200 0.7 65柱的洗脱物来自疏水柱的 2,600 6.3 33洗脱物来自TOYO 91067.411PEARL的洗脱物凝胶过滤洗脱物 59.0 168 0.7将从上面凝胶过滤层析中洗脱和收集的溶液以常规方式用7.5w/v％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，得到单一的蛋白条带。该数据显示来自此凝胶过滤层析的洗脱物为纯化至电泳纯形式的非还原性糖形成酶纯化标本。
实施例2-3酶的特性实施例2-3(a)作用制备含有葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖或麦芽七糖的20％水溶液作为酶底物并且与利用实施例2-2方法获得的非还原性糖形成酶纯化标本的2单位/克底物(d.s.b)混合，在50℃于pH6.0酶促反应48小时。将此反应混合物脱盐，并且用日本东京Mitsubishi化工有限公司商业化的“MCI GEL CK04SS COLUMN”2根层析柱(它们串联使用)进行高效液相色谱(下文简称“HPLC”)分析，然后测定反应混合物的糖组成。用于HPLC的条件和仪器如下用“CO-8020”(一种由日本东京Tosoh公司商业化的柱烤炉)将柱维持于85℃。以0.4ml/min的流速送入水作为流动相。洗脱结果于“RI-8020”(一种由日本东京Tosoh公司商业化的差动式折射计)上进行分析。结果列于表3中。
表3底物反应产物洗脱时间(分钟) 百分数(％)萄萄糖 葡萄糖 57.2 100.0麦芽糖 麦芽糖 50.8 100.0麦芽三糖葡糖基海藻糖43.2 36.2麦芽三糖46.2 63.8麦芽四糖麦芽糖基海藻糖 38.9 87.2麦芽四糖42.3 12.8麦芽五糖麦芽三糖基海藻糖35.4 93.0麦芽五糖38.4 7.0麦芽六糖麦芽四糖基海藻糖32.7 93.8麦芽六糖35.2 6.2麦芽七糖麦芽五糖基海藻糖30.2 94.2麦芽七糖32.4 5.8正如来自表3的结果证明，每个反应的产物基本包括剩余的底物和新形成的非还原性糖α-葡糖基海藻糖，α-麦芽糖基海藻糖，α-麦芽三糖基海藻糖，α-麦芽四糖基海藻糖，或α-麦芽五糖基海藻糖(在表3，表示为葡糖基海藻糖，麦芽糖基海藻糖，麦芽三糖基海藻糖，麦芽四糖基海藻糖，或麦芽五糖基海藻糖)。在反应混合物中基本没有检测到其它多糖。将非还原性糖占每个反应的产物的百分数认为和评估为生产率，结果表明葡萄糖多聚化程度为3的α-葡糖基海藻糖的产量是相对低的，具有葡萄糖多聚化程度为4或更高的糖如麦芽糖基海藻糖，α-麦芽三糖基海藻糖，α-麦芽四糖基海藻糖，和α-麦芽五糖基海藻糖的产量高达约85％或更高。没有观察到从葡萄糖和麦芽糖形成非还原性糖。
实施例2-3(b)分子量以常用方法，与日本东京日本Bio-Rad实验室出售的分子量标记平行试验，利用10w/v％聚丙烯酰胺凝胶将按实施例2-2的方法获得的非还原性糖形成酶的纯化样品进行SDS-PAGE。在电泳后与分子量标记的位置比较，该非还原性糖形成酶显示分子量约为75,000±10,000道尔顿。
实施例2-3(c)等电点利用含有2w/v％可在Pharmacia LKB Biotechnology AB，Uppsala，瑞典销售的“AMPHOLINE”(一种两性电解质)的聚丙烯酰胺凝胶，将按实施例2-2的方法获得的非还原性糖形成酶的纯化样品进行等电点电泳。在等电点电泳后，测量凝胶的pH，表明非还原性糖形成酶具有约4.5±0.5的等电点。
实施例2-3(d)最适温度和pH利用按实施例2-2的方法获得的非还原性糖形成酶的纯化样品，检测温度和pH对非还原性糖形成酶的活性的影响。当检测温度的影响时，与酶活性的测试类似地进行实验，不同的是在不同温度让酶反应。在pH的影响的检测中，与酶活性的测试类似地进行了实验，不同的是利用适当的20毫摩尔/升缓冲液在不同pH与酶反应。在每个检测中，将每个反应系统中底物还原能力降低水平的相对值(％)计算成它相应的相对酶活性(％)。图1显示了温度影响的结果，图2显示了pH影响的结果。图1和2的横轴分别显示反应温度和反应pH。如图1所示，当在pH6.0温育60分钟时，酶的最适温度约为50℃。也如图2所示，当在50℃温育60分钟时，酶的最适pH约为pH6.0。
实施例2-3(e)热和pH稳定性利用按实施例2-2的方法获得的非还原性糖形成酶的纯化样品，检测酶对热和pH的稳定性。根据酶活性的测试的方法，通过利用20毫摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释样品，在预定的温度温育稀释液60分钟，冷却温育的稀释液，和确定稀释液中剩余的酶活性，即可检测热稳定性。根据酶活性的测试方法，通过利用具有适当的不同pH的50毫摩尔/升缓冲液稀释样品，在4℃温育稀释液24小时，调节稀释液pH到pH6，确定稀释液中剩余的酶活性，即可检测酶的pH稳定性。图3和4中分别显示了酶的热和pH稳定性的结果。图3和4的横轴分别显示了酶的温育温度和pH。如图3所示，酶在高达约55℃的温度下稳定，如图4所示，酶在约pH5.0-10.0的pH范围是稳定的。
这些结果证明，按实施例2-2的方法获得的非还原性糖形成酶是具有中等温度范围的最适温度的本发明非还原性糖形成酶。
实施例2-4部分氨基酸序列对蒸馏水透析按实施例2-2的方法获得的非还原性糖形成酶纯化样品的部分，以便获得蛋白质重量约80微克的样品用于分析N-末端氨基酸序列。利用美国，Foster市，应用生物系统公司出售的蛋白质序列仪“473A型蛋白质序列仪”，分析N-末端氨基酸序列直到N末端的20个氨基酸残基。测序结果揭示出的N末端氨基酸序列是SEQ ID NO4的部分氨基酸序列。对10毫摩尔/升Tris-HCl缓冲液(pH9.0)透析按实施例2-2的方法获得的非还原性糖形成酶纯化样品的部分，并且利用日本，东京，Tosoh公司出售的超滤膜“ULRACENT-30”，以常用的方法浓缩到约1毫克/毫升溶液。在0.2毫升浓缩物中加入10微克日本东京Wako纯化化学工业公司出售的试剂胰蛋白酶“TPCK-TRYPSIN”，使其在30℃反应22小时，以便消化该酶形成肽。通过利用直径3.9毫米和长度150毫米的美国，Milford，Millipore公司，Waters Chromatography Div.，的产品“μBONDASPHERE C18 COLUMN”，将反应混合物进行反相HPLC，以便分离肽。在大气温度下，利用含有0.1v/v％的三氟乙酸和在60分钟内从24v/v％增加到48v/v％的乙腈的水溶液加在柱中进行洗脱步骤，加洗脱液期间的流速是0.9毫升/分钟。通过在波长210纳米检测吸光值，从而检测从柱中洗脱下来的肽。与其它物质很好分离开的两个肽，即分离出了在约2小时保留时间洗脱的“S5”和在30分钟保留时间洗脱的“S8”，分别真空干燥，在含有50微升0.1v/v％三氟乙酸的50v/v％乙腈水溶液中溶解。将肽溶液进行蛋白质序列分析，以便分析多达20个氨基酸残基。从肽“S5”和“S8”，获得了SEQ ID NO5和6的氨基酸序列。
实施例3编码非还原性糖形成酶的DNA实施例3-1基因文库的构建和筛选除了设定培养的温度和时间分别为27℃和24小时之外，与实施例2-1类似地培养节杆菌S34，FERM BP-6450。
离心培养物以便取出细胞，然后悬浮于适当量的Tris-EDTA-盐缓冲盐(下文中命名为“TES缓冲液”)(pH8.0)中。以占细胞悬浮液体积0.05w/v％的量混合溶菌酶，接着在37℃温育30分钟。在-80℃停留1小时以冷冻得到的混合物，然后与在60℃预热的TES缓冲液和苯酚混合物混合和充分搅拌，冷却和离心收集形成的上清液。在上清液中加入冷乙醇，然后收集形成的沉淀物，在适当量的SSC缓冲液中溶解(pH7.1)，与7.5微克核糖核酸酶和125微克蛋白酶混合，并且在37℃温育1小时。混合得到的混合物并且与氯仿/异戊醇混合搅拌，使其静置，接着收集形成的上层，在该层中加入冷乙醇，并且收集形成的沉淀物。利用冷的70v/v％乙醇漂洗沉淀，真空干燥获得DNA，接着在SSC缓冲液(pH7.1)中溶解，使浓度约为1毫克/毫升，并且在-80℃冷冻。
取50微升的DNA，与约50单位的限制酶KpnI混合，在37℃温育1小时以便消化DNA。根据试剂盒附带的方案，将3微克消化的DNA和0.3微克美国，加里弗尼亚，Stratagene克隆系统销售的质粒载体“pBluescript II SK(+)”利用Takara Shuzo公司，东京，日本销售的“DNA连接试剂盒”连接，称重，反应。根据常规的感受态细胞方法，利用连接产物转化100微升美国，加里弗尼亚，StratageneCloning Systems销售的大肠杆菌菌株“Epicurian(oli XL1-Blue”，由此获得了基因文库。
将这样获得的基因文库接种到含有10克/升胰蛋白胨，5克/升酵母提取物，5克/升氯化钠，75毫克/升氨苄青霉素钠盐，和50毫克/升，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷的琼脂营养培养基平板(pH7.0)上，并且在37℃温育18小时。将培养基上形成的白色菌落约5000个以常用方法固定在Amersham公司，Div.Amersham Intermational，Arlington Heights，IL，美国销售的尼龙膜“HYBOND-N-+”上。根据实施例2-4中显示的SEQ ID N05氨基酸序列中的1-8个氨基酸残基，化学合成具有SEQ ID NO18核苷酸序列的寡核苷酸，并且以常用方法，利用[γ-32P]ATP和T4多核苷酸激酶标记，以获得探针。利用该探针，通过常规菌落杂交方法筛选已经固定在尼龙薄膜上和前面获得的菌落。在含有6×SSC，5×Denhalt溶液，和100毫克/升变性鲸精子DNA的杂交溶液中在65℃进行杂交16小时。在杂交后，利用6×SSC，在65℃洗涤上面的尼龙薄膜30分钟，利用含有0.1w/v％SDS的2×SSC在65℃进一步洗涤2小时。以常用方法将得到的尼龙薄膜进行放射自显影，然后根据放射自显影观察到的信号，选择与探针强烈杂交的菌落，并且命名为“GY1”，作为转化体。
实施例3-2核苷酸序列的译码根据常用方法，在含有100微克/毫升钠形式氨苄青霉素的L肉汤培养基(pH7.0)中接种转化体GY1，并且在振摇条件下，在37℃培养24小时。在完成培养后，通过离心从培养物收集增殖细胞，并且利用常规碱性SDS方法处理以便提取重组DNA。将重组DNA命名为pGY1。利用上面的探针，在常规Southern印迹技术上分析重组DNA，pGY1，并且根据分析的数据，构建了如图5所示的限制图谱。如图5所示，表明了重组DNA，pGY1含有由包括黑线表示的来自节杆菌S34，FERM BP-6450的约5,500个碱基对(bp)的碱基组成的一段核苷酸序列，并且该重组DNA在限制酶EcoRI的两个识别位点之间的约4,000bp碱基的区域内，含有黑线区域内的黑箭头表示的编码本发明非还原性糖形成酶的核苷酸序列。根据这一结果，利用EcoRI完全消化重组DNA pGY1，然后利用常规琼脂糖凝胶电泳分离和纯化约4,000bp的DNA片段。利用常规连接方法连接已经利用EcoRI消化的美国，加里弗尼亚Stratagene Cloning System销售的质粒载体“pBluescriptII SK(+)”和该DNA片段。利用连接产物，转化美国，加里弗尼亚，StratageneCloning System销售的大肠杆菌菌株“XL1-BLUE”以便获得转化体。以常用方法，从转化体提取重组DNA，以常规方法证实它含有色括约4000bp碱基的前面所述DNA片段，并且命名为“pGY2”。导入了“pGY2”的转化体命名为“GY2”。
以常用的二脱氧方法分析重组DNA pGY2的核苷酸序列，表明它含有包括起源于节杆菌S34，FERM BP-6450的3252个减基对的SEQ ID NO19核苷酸序列。核苷酸序列编码如SEQ ID NO19平行所示的氨基酸序列。比较实施例2-4所证实作为本发明非还原性糖形成酶部分氨基酸序列的氨基酸序列SEQ ID NO4-6，发现SEQ ID NO4-6的氨基酸序列与SEQ ID NO19中的氨基酸2-21，619-638，和98-117完全一致。这些数据表明，实施例2中获得的本发明非还原性糖形成酶包括SEQ ID NO19的氨基酸2-757，或具有SEQ ID NO1的氨基酸序列，并且SEQ ID NO19的碱基746-3013的核苷酸序列，或SEQ ID NO7的核苷酸序列编码节杆菌S34，FERM BP-6450的酶。重组DNA pGY2的结构在图6中。
根据Lipman，David J.在科学，227卷，1,435-1,441(1985)中介绍的方法，利用软件开发公司，东京，日本销售的计算机程序“GENETYX-MAC，VER.8”比较按上面实施例2的方法获得的本发明非还原性糖类形成酶的氨基酸序列和具有非还原性糖类形成活性的已知酶的氨基酸序列，以便计算它们的同源性(％)。用作已知酶的酶是来自日本专利
发明者山本拓生, 丸田和彦, 久保田伦夫, 福田惠温, 三宅俊雄 申请人:株式会社林原生物化学研究所