包含稻花药特异基因的dna及其转化的转基因植物的制作方法

专利名称：包含稻花药特异基因的dna及其转化的转基因植物的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。
本发明主要涉及作为重组或嵌合DNA序列中编码DNA序列的花药特异转录的启动子发挥功能的新的DNA序列。本发明还涉及在植物花药中特异表达的重组或嵌合DNA序列。该重组或嵌合DNA序列可以用于产生转基因植物，尤其是转基因雄性不育植物。
背景技术：
雄性不育植物的产生是杂交种子生成中的经济热点。雄性不育性预防了在许多植物物种中发生并阻碍育种和杂交种子生产的自花授粉。花药是开花植物的雄性生殖器官，由多种组织组成，诸如绒毡层、药室内壁(endothecium)、药隔组织(connective tissue)、维管组织、等等，并负责产生花粉。花药发育可以分成两个主要阶段。在第一阶段，花药的形态建立，小孢子母细胞进行减数分裂产生四合花粉小孢子。在第二阶段，花粉粒和花药进行分化，并发生组织退化、破裂、和花粉粒释放。在涉及这些发育的许多基因中，只有小部分是花药特异的。
至今已有报导的花药特异基因包括稻的Osc4、Osc6、YY1、和YY2基因(Y.Hihara等人，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)301181-1193，1996；T.Tsuchiya等人，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)261737-1747，1994)；烟草的TA29和TA32基因(A.M.Koltunow等人，植物细胞(Plant Cell)21201-1224，1990)；向日葵的SF2和SF18基因(C.Domon等人，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)15643-646，1990)；番茄的108基因(A.G.Smith等人，分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)2229-16，1990)；烟草的NTM19(M.T.Oldenhof等人，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)31213-225，1996)；和Brassica napus的BA42、BA112、和A9基因(R.Scott等人，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)17195-207，1991；J.B.Shen等人，分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)234379-389，1992)。
这些基因中的一些只在花药的孢子体组织中发现，其它是花粉粒特异的，或者在孢子体和配子体组织中都存在。
稻是以自花授粉方式繁殖的植物的范例。仅仅通过异花授粉培育杂交稻是困难的。为了有助于通过异花授粉产生杂交稻，现有技术描述了一种方法，其中由稻花除去花药产生雄性不育稻，然后转移来自另一株稻的花粉。然而，问题是这种方法需要大量的时间和精力。
由此，为了产生雄性不育的稻或任何其它自花授粉植物，而没有上述先前的问题，本发明逐渐的努力发展使用诱导花药异常发育的基因的方法。
发明简述本发明由此提供了用于感兴趣编码区在花药的绒毡层、药室内壁、和药隔组织中(而非小孢子和花粉中)特异表达的DNA分子和方法，其中感兴趣编码序列的表达起始于四合花粉阶段(tetrad stage)，并在空泡花粉阶段(vacuolated pollen stage)达到最高水平。具体而言，本发明提供了下列DNA分子和方法●包含与SEQ ID NO1所示序列具有至少50％、优选65％、更优选80％、最优选90％、或更多序列同一性的核苷酸序列的DNA；●包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的本发明DNA；●特别设计使得编码序列为反义定向的DNA分子。
本发明还提供了DNA分子和方法，其中编码序列编码在花药细胞中表达时可破坏活性花粉形成的多肽。在本发明的特定实施方案中，编码序列编码选自下组的多肽RNase、DTA、TURF-13、果胶酸裂解酶、gin重组酶、iaaL、和cytA毒素。
本发明还提供了上述DNA分子和方法，其中本发明DNA序列与SEQ IDNO1任何位点的连续30个碱基具有超过80％、优选90％、更优选95％的序列同一性。
本发明还提供了包含能够特异启动相关联编码序列在花药的绒毡层、药室内壁、和药隔组织中(而不在小孢子或花粉中)表达的启动子序列的DNA分子，其中编码序列的表达起始于四合花粉阶段，并在空泡花粉阶段达到最高水平。
具体而言，本发明提供了上述方法和DNA分子，其中●启动子序列与SEQ ID NO3的核苷酸序列具有50％、优选65％、更优选80％、最优选90％、或更多序列同一性；●启动子序列包含SEQ ID NO3所示核苷酸序列；●启动子序列包含能够与感兴趣编码序列可操作连接的额外序列；●该额外序列包含与SEQ ID NO10具有50％、优选65％、更优选80％、最优选90％、或更多序列同一性的序列；●该额外序列包含SEQ ID NO10；●启动子序列和额外序列与SEQ ID NO2具有50％、优选65％、更优选80％、最优选90％、或更多序列同一性；●启动子序列和额外序列特征为具有SEQ ID NO2的核苷酸序列。
另外，本发明提供了DNA分子，其中启动子包含可以由SEQ ID NO2获得的片段，优选能够特异启动相关联编码序列在花药的绒毡层、药室内壁、和药隔组织中(而不在小孢子和花粉中)表达的片段；其中编码序列的表达起始于四合花粉阶段，并在空泡花粉阶段达到最高水平。
本发明还提供了包含编码特征为与SEQ ID NO4具有50％、优选65％、更优选80％、最优选90％、或更多序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的开放阅读框架的DNA分子。在本发明的特定实施方案中，该开放阅读框架编码特征为SEQ ID NO4的氨基酸序列的蛋白质。在另一个特定实施方案中，上述DNA分子的特征为SEQ ID NO7。
另外，本发明提供了包含用于在宿主有机体(诸如微生物或植物)中表达的包含本发明DNA的第一种表达盒和任选的包含感兴趣基因的第二种表达盒的表达载体。在本发明的特定实施方案中，第二种表达盒包含标记基因。
本发明还提供了由上述开放阅读框架编码的蛋白质。
另外，本发明提供了用本发明DNA序列转化的转基因植物和植物材料及其有性和/或无性繁殖后代。具体而言，本发明提供了●用本发明DNA序列转化了的转基因、雄性不育植物；●本发明的转基因植物或植物材料，其中植物是稻、小麦、玉蜀黍、Sorghum bicolor、或鸭茅。
本发明还提供了产生包含具有启动子序列和相关联编码序列之DNA的转基因植物的方法，其中启动子序列可特异启动编码序列在花药的绒毡层、药室内壁、和药隔组织中(而不在小孢子和花粉)的表达；其中编码序列的表达起始于四合花粉阶段，并在空泡花粉阶段达到最高水平。具体而言，本发明涉及这样的方法，其中的植物是稻、小麦、玉蜀黍、Sorghum bicoior、或鸭茅。
发明结构和功能在特定实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO1所示碱基序列的稻(Oryza sativa L.)花药特异基因和与该基因任何位点的连续30个碱基具有超过80％序列同一性的基因。另外，本发明提供了包含具有SEQID NO2的启动子序列和额外序列的花药特异表达调控子，对应于该基因中第-1196位至第240位碱基序列，由SEQ ID NO1的第1位至第1436位核苷酸表示。
本发明还提供了具有SEQ ID NO3的花药特异表达启动子，对应于该基因中第-1196位至第-1位碱基序列，由SEQ ID NO1的第1位至第1196位核苷酸表示。
定义为了确保对说明书和权利要求的清晰和一致的理解，提供了下列定义。
嵌合用于指示DNA序列(诸如载体或基因)由超过一种不同起源的DNA序列通过重组DNA技术融合在一起，产生非天然发生、尤其不存在于将要转化的植物中的DNA序列。
表达指植物中内源基因或转基因的转录和/或翻译。例如在反义构建物的情况中，表达可以仅指反义DNA的转录。
基因指编码序列和相关联的调控序列，其中编码序列转录成RNA，诸如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有义RNA、或反义RNA。调控序列的范例是启动子序列、5’和3’非翻译序列、和终止序列。可以存在的其它元件是例如内含子。
标记基因指编码可选择或可筛选性状的基因。
nt“核苷酸”的缩写。
可操作连接/相关联如果调控DNA序列和编码RNA或蛋白质的DNA序列的排列使得调控DNA序列能够影响编码DNA序列的表达，则称调控DNA序列与编码DNA序列“可操作连接”或“相关联”。
植物指任何植物，尤其是种子植物。
植物材料指叶、茎、根、花或花部分、果实、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、卵细胞、接合子、胚、种子、插条、细胞或组织培养物、或植物的任何其它部分或产物。
启动子指起始相关联DNA序列转录的DNA序列。启动子区域还可以包含作为基因表达调控子的元件，诸如激活子、增强子、和/或阻遏子。
重组DNA分子使用重组DNA技术连接在一起的DNA序列组合。
重组DNA技术用于将DNA序列连接在一起的步骤，例如Sambrook等人，1989，冷泉港，NY冷泉港实验室出版社描述的。
可筛选标记基因指其表达并不赋予转化细胞以选择优势、但是使得转化细胞在表型上与未转化细胞不同的基因。
可选择标记基因指其在植物细胞中的表达赋予细胞以选择优势的基因。可选择标记基因转化了的细胞拥有的与未转化细胞生长相比的选择优势可能归功于其在负选择试剂(诸如抗生素或除草剂)存在时的生长能力。转化细胞与未转化细胞相比拥有的选择优势还可能归功于其利用添加化合物(如营养物、生长因子、或能源)的增强的或新的能力。可选择标记基因还指其在植物细胞中的表达给予细胞以正和负选择优势的基因或基因组合。
序列同一性使用基于动力学编程算法的计算机程序测定序列同一性百分数。在本发明范围内优选的计算机程序包括设计用于探察所有可获得序列数据库(无论查询的是蛋白质或DNA)的BLAST(基本局部比对搜索工具)搜索程序。该搜索工具的2.0版BLAST(缺口BLAST)已经在因特网上公开使用(当前网址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。它使用启发式算法，搜索局部而非全局比对，并因此能够检测仅共享分离区域的序列之间的相互关系。BLAST搜索中给出的得分具有明确定义的统计学解释。该程序优选将任选参数设置成缺省值运行。
转化指将核酸导入细胞。具体指将DNA分子稳定的整合到感兴趣有机体的基因组中。
序列表中序列的简要描述SEQ ID NO1稻RA8基因的核苷酸序列SEQ ID NO2包含RA8启动子加上第一个外显子、第一个内含子、和第二个外显子一部分的花药特异表达调控子SEQ ID NO3 RA8启动子SEQ ID NO4稻RA8基因编码的蛋白质的推导氨基酸序列SEQ ID NO5引物1SEQ ID NO6引物2SEQ ID NO7 RA8 cDNA序列SEQ ID NO8 PCR引物SEQ ID NO9 PCR引物SEQ ID NO10 稻RA8基因的第一个外显子、第一个内含子、和第二个外显子一部分的核苷酸序列保藏
该保藏物保藏于韩国科学和技术高级研究所(Korea AdvancedInstitute of Science and Technology，KAIST)的附属机构韩国生物科学和生物技术研究所(Korea Research Institute of Bioscience andBiotechnology)。
详述下文将详细描述本发明。
本发明的基因由稻(Oryza sativa L.)分离得到，在花药中特异表达，其基因组序列显示于SEQ ID NOL RA8基因的cDNA序列显示于SEQ IDNO7。对cDNA和基因组序列的比较揭示，RA8基因的编码序列中存在2个内含子和3个外显子。134bp的内含子1位于第14位和第15位密码子之间，对应于SEQ ID NO1的第1289位至第1422位核苷酸，对应于SEQ ID NO1的第1556位至第2149位核苷酸；594bp的内含子2位于由碱基序列推导得到的氨基酸编码区的第59位密码子处，对应于SEQ ID NO1的第1556位至第2149位核苷酸。两个内含子都包含分别位于5’和3’末端的GT和AG共有序列。对于SEQ ID NO1，3个外显子的定位如下外显子1第1247位至第1288位核苷酸；外显子2第1423位至第1555位核苷酸；外显子3第2150位至第2766位核苷酸。在所述编码区的5’非编码侧翼序列，CAAT盒序列(CAAT)位于第-82位至第-79位碱基位置，对应于SEQ ID NO1的第1116位至第1119位核苷酸；TATA盒序列(TATAATA)位于第-53位至第-47位碱基位置，对应于SEQ ID NO1的第1145位至第1151位核苷酸。poly(A)尾位于TGA终止密码子下游第164位碱基(SEQ ID NO1的第2932位核苷酸)。在3’非编码区，存在AATAA共有多聚腺苷酸化信号序列。第一个ATG附近的序列吻合文献中报导的单子叶植物的翻译起始共有序列(C.P.Joshi等人，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)35993-1001，1997)。
所述编码区的开放阅读框架由264个氨基酸残基组成，并具有SEQ IDNO4的氨基酸序列。
由所述开放阅读框架推导得到的蛋白质，分子量为26.4kDa，pI为6.1。构成该蛋白质的主要氨基酸是丙氨酸(21.9％)、甘氨酸(9.9％)、和脯氨酸(10.2％)，而且其氨基酸序列包含可能涉及将蛋白质靶向膜部分或胞外空间的疏水性N末端区、类伸展蛋白的SPPPPPP基元、和富含甘氨酸区。根据与Genebank数据库的同源性分析，这种氨基酸序列是新的，而且显示与至今报导的任何基因不具有显著的序列同一性。
本发明基因的表达的特征为受到时间的和空间的调控。空间表达模式包括，该基因只在稻花的花药器官中表达，而在除了花药的其它花器官、叶、和根等等中不表达；尤其是在花药器官中，它只在绒毡层、药室内壁、和药隔组织中表达，而在维管组织中不表达。时间表达模式包括，该基因的表达水平随花的成熟而上升，其中基因在前减数分裂阶段几乎不表达，在小孢子由四合花粉释放时最早检测到表达。在空泡花粉阶段观察到最高水平，并在开花前夕的成熟花粉阶段急速下降。
本发明基因可以通过差异杂交方法获得。例如，通过包括将花药cDNA文库与非花药起源(诸如叶、根、或幼苗)的cDNA文库进行杂交、此后获得与非花药起源的cDNA文库不反应的花药特异基因的cDNA克隆的方法。另外，可将获得的cDNA克隆作为探针用于与基因组文库的杂交，分离与其阳性反应的克隆，并进行亚克隆，以获得花药特异基因的基因组克隆。另一种用于获得该基因的方法包括，使用SEQ ID NO1的碱基序列合成用于传统PCR的适当引物的方法。在本发明的特定实施方案中，将获得的基因克隆到pBluescript SK(-)载体中，并命名为质粒pGA1173-9。该质粒于1998年7月29日保存于韩国科学和技术高级研究所(KoreaAdvanced Institute of Science and Technology，KAIST)的附属机构韩国生物科学和生物技术研究所(Korea Research Institute ofBioscience and Biotechnology)，保藏号KCTC 8899P。
包含RA8启动子的区域显示于SEQ ID NO3，对应于SEQ ID NO1的第1位至第1196位核苷酸。RA8基因的转录核苷酸起始于SEQ ID NO1的第1197位。调控本发明基因的花药特异表达的元件位于包含启动子、外显子1、内含子1、和部分外显子2的区域内，该区域显示于SEQ ID NO2，对应于SEQ ID NO1的第1位至第1436位碱基序列。该调控元件可以通过传统克隆方法由例如稻基因组DNA或质粒pGA1173-9获得，其中使用SEQ IDNO2的碱基序列合成适当引物，此后进行传统的PCR方法。
本发明的植物表达载体包含例如SEQ ID NO2所示调控元件，其中花药特异表达调控子与感兴趣的另一基因融合。作为目的基因，可以使用报导基因，诸如β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)；而为了诱导稻花药异常发育的目的，可以使用(见下文)DTA(破坏细胞的一种毒性基因)、RNase基因、等等，但是不应当限制感兴趣的基因。
植物表达载体可以包含第二种表达盒，该盒包含能够用于选择转化体的标记基因。可选择或可筛选标记基因的范例描述于下文。对于某些靶物种，不同的抗生素或除草剂选择标记可能是优选的。在转化中常规使用的选择标记包括，赋予卡那霉素、巴龙霉素、遗传霉素、和相关抗生素抗性的nptII基因(Vieira和Messing，基因(Gene)19259-268，1982；Bevan等人，自然(Nature)304184-187，1983)；编码氨基糖苷3’-腺苷酰转移酶并赋予链霉素或壮观霉素抗性的细菌aadA基因(Goldschmidt-Clermont，核酸研究(Nucl.Acids Res.)194083-4089，1991)；赋予潮霉素抗性的hp基因(Blochlinger和Diggelmann，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)42929-2931，1984)；和赋予氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis和Jarry，欧洲分子生物学杂志(EMBOJ.)21099-1104，1983)。可使用的其它标记包括，赋予除草剂膦丝菌素抗性的膦丝菌素乙酰转移酶基因(White等人，核酸研究(Nucl.AcidsRes.)181062，1990；Spencer等人，理论及应用遗传学(Theor.Appl.Genet.)79625-631，1990)；编码草甘膦抗性的突变型EPSP合酶基因(Hinchee等人，生物技术(Bio/Technology)6915-922，1988)；授予咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突变型乙酰乳酸合酶(ALS)基因(Lee等人，欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)71241-1248，1988)、赋予莠去净(atrazine)抗性的突变型psbA基因(Smeda等人，植物生理学(PlantPhysiol.)103911-917，1993)；或EP 0 769 059中公开的突变型原卟啉原氧化酶基因。还可以使用导致正选择的选择标记，诸如专利申请WO 93/05163中公开的磷酸甘露糖异构酶基因。
转化细胞的鉴定还可以通过可筛选标记基因的表达来实现，诸如氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、萤光素酶、和绿色荧光蛋白(GFP)，或者赋予转化细胞以表型独特性状的任何其它蛋白质。
该表达载体可以通过融合所述花药特异表达调控子和目的基因、此后与适当植物表达载体连接而构建。例如，将调控元件与GUS在不改变阅读框架的前提下融合，然后将融合产物与能够在植物中表达的二元载体pGAl633连接，从而构建了表达载体pGAl647。
可以通过大量众所周知的方法将本发明的重组DNA序列导入植物细胞。本领域技术人员将领会到，这些方法的选择取决于将要转化的植物的种类，即单子叶植物或双子叶植物。转化植物细胞的合适方法包括微量注射(Crossway等人，生物技术(Bio/Technology)4320-334，1986)、电穿孔(Riggs和Bates，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)835602-5606，1986)、土壤杆菌介导的转化(Hinchee等人，生物技术(Bio/Technology)6915-922；EP O 853 675)、直接基因转移(Paszkowski等人，欧洲分子生物学(EMBO J.)32717-2722，1984)、和使用可以由Agracetus公司(Madison，Wisconsin)和Dupont公司(Wilmington，Delaware)购买的设备的微弹加速(参阅例如美国专利号4,945,050和McCabe等人，生物技术(Bio/Technology)6923-926，1988)。将要转化的细胞可以是分化的叶细胞、胚性细胞、或任何其它类型的细胞。
在原生质体的直接转化中，原生质体对外源遗传物质的摄取可以通过使用化学试剂或电场而增强。然后外源物质可以整合到细胞核基因组中。在双子叶的烟草中进行了早期的工作，导致了外源DNA的掺入并转移给后代植株(Paszkowski等人，欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)32712-2722，1984；Potrykus等人，分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)199169-177，1985)。单子叶的原生质体，例如Triticum monococcum、)多花黑麦草(Lolium multiflorum)(意大利黑麦草)、玉蜀黍、和黑墨西哥甜玉米，可通过该步骤进行转化。另一种优选的实施方案是EP 0292 435以及EP 0 846 771中公开的用于玉蜀黍的原生质体转化方法。关于玉蜀黍的转化还可以参阅Koziel等人，生物技术(Bio/Technology)11194-200，1993)。稻的转化可以通过利用原生质体或微粒轰击的直接基因转移技术进行。已描述了Japonica型和Indica型的原生质体介导转化(Zhang等人，植物细胞报告(Plant Cell Rep.)7379-384，1988；Shimamoto等人，自然(Nature)338274-276，1989；Datta等人，生物技术(Bio/Technology)8736-740，1990)。上述两种类型也可以使用微粒轰击进行常规转化(Christou等人，生物技术(Bio/Technology)9957-962，1991)。专利申请号EP 0 332 581描述了用于Pooideae原生质体的产生、转化、和再生的技术。这些技术能够转化所有的Pooideae植物，包括鸭茅(Dactylis)和小麦。此外，专利申请号EP 0 674 715；和Weeks等人，植物生理学(Plant Physiol.)1021077-1084，1993中描述了小麦的转化。
可以根据传统植物转化方法将由此构建的植物表达载体导入稻愈伤组织，并由此诱导根和叶的分化，然后可以转移到花盆中培养，从而获得转化稻。
转化植物的优选方法是土壤杆菌介导的转化。根据土壤杆菌介导的转化作为代表性实施例，使用冻融方法将表达载体pGA1647转移到携带二元Ti质粒的根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中(G.An等人(编)，植物分子生物学手册(Plant Molecular Biology Manual)，第A3/1-A3/19页，Kluwer Academic Publisher，Dordrecht，1988)，然后在添加适当抗生素的AB液体培养基中进行培养(M-D Chilton，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)713672-3676，1974)，并将由此获得的产物在添加1mM甜菜碱的2N6-As培养基(Y.Hiei等人，植物杂志(Plant J.)6271-282，1994)上与愈伤组织在暗处于25℃共培养2-3天。将共培养的愈伤组织用含头孢氨噻的无菌水清洗，并在含适当抗生素和头孢氨噻的N6培养基上再培养3-4周，以获得活跃生长的愈伤组织。将这些愈伤组织转移到适当的选择培养基上，例如添加0.2mg/L NAA(萘乙酸)、2mg/L激动素、2％山梨醇、1.6％phytagar(Gibco)、适当抗生素、和250mg/L头孢氨噻的MS培养基(LifeTechnologies)，然后在30-60μmol m-2sec-1，优选40μmol m-2sec-1的连续光照条件下培养2-3周，以获得苗。将这些苗装盆，并在10h亮/14h暗的条件下在温室中进行培养，以获得转基因稻。
在所述方法中使用的载体包含本发明调控元件和DTA或RNase基因等等的融合基因的情况中，用该载体转化的植物具有雄性不育特征。
本发明的编码DNA序列可以是编码目的多肽的任何DNA序列。尤其优选用于本发明的是，在花药组织中表达时使植物不产生活性花粉的多肽产物的编码DNA序列。这些编码DNA序列的范例包括下列参考文献(此处完整引用作为参考)中描述的基因a)抑制蛋白质合成的Diptheria毒素A链基因(DTA)(Greenfieid等人，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)806853，1983；Palmiter等人，细胞(Cell)50435-443，1987)；b)降解果胶、引起细胞裂解的来自菊欧文氏菌(Erwiniachrysanthemi)ECl6的果胶酸裂解酶基因pelE(Keen等人，细菌学杂志(J.Bacteriology)168595，1986)；c)来自cms-T玉蜀黍线粒体基因组的T-urf13(TURF-13)基因该基因编码命名为URF13、破坏线粒体或原生质膜的多肽(Braun等人，植物细胞(Plant Cell)2153，1990；Dewey等人，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)845374，1987；和Dewey等人，细胞(Cell)44439，1986)；d)来自噬菌体Mu基因的gin重组酶基因其编码在植物细胞中表达时引起基因组重排和细胞活力丧失的位点特异的DNA重组酶(Maeser等人，分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)230170-176，1991)；e)编码将赖氨酸与吲哚乙酸(IAA)缀合的酶、来自丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的吲哚乙酸-赖氨酸合成酶基因(iaaL)。在植物细胞中表达时，由于通过缀合由细胞中除去了IAA，引起其发育改变(Romano等人，基因和发育(Genes and Development)5438-446，1991；Spena等人，分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)227205-212，1991；Roberto等人，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)875795-5801，1990)；f)编码杀蚊和溶血蛋白的来自苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillusthringiensis israeliensis)的CytA毒素基因。当其在植物细胞中表达时，由于破坏细胞膜，可引起细胞死亡(McLean等人，细菌学杂志(J.Bacteriology)1691017-1023，1987；Ellar等人，美国专利号4,918,006,1990)。
实施例本发明将通过实施例的参考进行更详细的描述，但是不应当理解为对本发明范围的限制。实施例1稻花药特异基因RA8的分离步骤1RA8基因的分离将处于晚空泡阶段的稻(Oryza sativa L.Nakdong)花横切成3个部分。包含完整花药和部分内稃和外稃的中间部分作为花药富含样品。由此部分使用poly(A)快速mRNA分离试剂盒(Stratagene，USA)分离花药富含mRNA。以该mRNA作为模板用ZAP-cDNA Gigapack 2 Gold克隆试剂盒(Stratagene)构建花药cDNA文库。
将相同方法应用于由6日龄稻幼苗的叶，以构建叶cDNA文库。
由构建的花药cDNA文库，随机选择33个cDNA克隆，用EcoRI切割相应克隆DNA获得cDNA区域，用放射性同位素32P对其进行标记，并与来自叶cDNA文库的噬菌斑进行杂交。
结果，6个花药cDNA克隆与来自叶cDNA文库的噬菌斑不发生阳性反应，在这些克隆中，选择在花药cDNA文库中最丰富的1个克隆并命名为RA8。
由此RA8克隆，使用f1辅助噬菌体R408(Stratagene)获得重组质粒pGA1173-4(RA8)，其中通过体内切除插入了cDNA片段，通过Sanger等人的方法(F.Sanger等人，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)745463-5467，1977)测定克隆到上述质粒中的RA8 cDNA的破基序列。
所述碱基序列显示于SEQ ID NO7。如SEQ ID NO7所示，RA8 cDNA的碱基序列的大小为1008bp。开放阅读框架位于SEQ ID NO7的第51位至第842位核苷酸，由264个氨基酸残基组成。由该开放阅读框架推导得到的蛋白质，分子量为26.4kDa，pI为6.1。第一个ATG附近的序列吻合文献中报导的单子叶植物的翻译起始共有序列(C.P.Joshi等人，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)35993-1001，1997)，poly(A)尾位于TGA翻译终止密码子下游第164位碱基。在3’非编码区，存在AATAA共有多聚腺苷酸化信号序列。
构成上述氨基酸序列的主要氨基酸残基是丙氨酸(21.9％)、甘氨酸(9.9％)、和脯氨酸(10.2％)，而且该氨基酸序列包含可能涉及将蛋白质靶向膜部分或胞外空间的疏水性N末端区、类伸展蛋白的SPPPPPP基元、和富含甘氨酸区。根据与Genebank数据库的同源性分析，确认这种氨基酸序列是与至今报导的任何基因不具有显著序列同一性的新基因。步骤2RNA印渍分析为了确认由上述步骤1获得的RA8基因是否在花药中特异表达，由稻的叶、根、未成熟花、成熟花、和花的内稃/外稃、雌蕊、和雄蕊分离总RNA，电泳，然后转移到尼龙膜上。使用32P标记的RA8 cDNA作为探针，进行RNA印渍。
RA8 mRNA只存在于各个发育阶段的花中，叶和根中没有。RA8基因的表达水平随花的发育而上升，在成熟花中达到最高水平。为了测定花中的器官特异性，使用由不同花器官获得的总RNA进行RNA印渍实验。将各种花器官在解剖镜下进行解剖，使交叉污染最小化。结果揭示RA8 mRNA存在于花药中，心皮或内稃/外稃中没有。步骤3RA8基因组克隆的分离将稻基因组文库(通过常规方法构建，由Steve Kay and Nam-Hi Chuaof Rockefeller University获得，在EMBLλ噬菌体DNA中插入了稻基因组DNA)的噬菌斑转移到尼龙膜(Hybond，Amersham)上，并使用放射性同位素32P标记的RA8 cDNA作为杂交探针进行杂交。将杂交膜暴露于X光胶片，并由显示阳性的噬菌斑获得噬菌体克隆。由这些噬菌体克隆分离λ噬菌体DNA，用BamHI切割以获得13.7kb的基因组片段，并进行其中4.3kb的SacI-EcoRI片段的亚克隆。由4.3kb的SacI-EcoRI片段获得的2.9kb的SacI片段包含5’侧翼序列和5’编码区，而毗邻的1.5kb的SacI-EcoRI片段包含剩余编码区以及3’侧翼序列。编码区中存在2个内含子(内含子1和内含子2)和3个外显子。对于SEQ ID NO1，3个外显子的定位如下外显子1第1247位至第1288位核苷酸；外显子2第1423位至第1555位核苷酸；外显子3第2150位至第2766位核苷酸。134bp的内含子1位于第14位和第15位密码子之间，对应于SEQ ID NO1的第1289位至第1422位核苷酸；594bp的内含子2位于第59位密码子处，对应于SEQ ID NO1的第1556位至第2149位核苷酸。两个内含子都包含分别位于5’和3’末端的GT和AG共有序列。RA8编码区的5’侧翼序列包CAAAT盒序列(CAAT)，位于第-82位至第-79位碱基位置，对应于SEQ ID NO1的第1116位至第1119位核苷酸；还包含TATA盒序列TATAATA，位于第-53位至第-47位碱基位置，对应于SEQ ID NO1的第1145位至第1151位核苷酸。
将2.9kb的SacI片段克隆到质粒pBluescript SK(-)载体中，并将该质粒命名为pGAll73-9。该质粒于1998年7月29日保存于韩国科学和技术高级研究所(Korea Advanced Institute of Science and Technology，KAIST)的附属机构韩国生物科学和生物技术研究所(Korea ResearchInstitute of Bioscience and Biotechnology)，保存编号KCTC 8899P。
使用Sanger等人的方法分析克隆到质粒pGA1173-9中的基因组DNA片段的碱基序列，并与cDNA相比，确定了大约2.5kb的启动子区域。
为了研究RA8克隆的基因组复杂性，将由2周龄稻幼苗叶分离的基因组DNA用EcoRI、HindIII、或PstI进行切割，然后与RA8 cDNA进行DNA印渍。RA8 cDNA探针与稻基因组DNA的单一条带发生杂交，由此RA8基因在稻基因组中以单拷贝存在。实施例2植物表达载体的产生包含报道基因GUS和选择基因hph(潮霉素磷酸转移酶)的二元载体的构建如下用BamHI和HindIII切割质粒pGA748(G.An，《二元Ti质粒载体土壤杆菌方案》，Humana Press，第47-58页)，然后插入CaMV35S启动子(Benfey等人，科学(Science)250959-966，1993)。在由此获得的质粒的BglII位点插入潮霉素抗性基因(潮霉素磷酸转移酶，hph)(Gritz等人，1983)。用HindIII和ClaI切割该质粒，补平末端，然后连接。用SacI切割由此获得的质粒除去大约0.5kb的片段，然后再次连接。在该质粒的BamHI位点，插入包含BamHI、HindIII、XbaI、SacI、HpaI、KpnI、ClaI、和BglII切割位点的合成衔接头，以构建质粒pGA1182。
使用质粒pGA1182作为模板，使用下列引物进行PCR引物1(SEQ ID NO5)5’-TTGGCATGCACATAC-3’引物2(SEQ ID NO6)5’-CGGGATCCGTGTTTGACAGG-3’用BamHI和SphI切割获得的大约120bp的片段，然后连接到用相同限制酶切割质粒pGA1182获得的大约9kb的片段中。在由此获得的质粒的BamHI和ClaI位点之间插入GUS基因(Jefferson等人，欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)63901-3907，1987)，以构建二元载体pGA1633。
使用实施例1步骤3构建的包含2.9kb RA8基因组DNA的pGA1173-9以及合成寡核苷酸引物SEQ ID NO8(AATTAACCCTCACTAAAGGG)和SEQ ID NO9(GCGGATCCAGGTTGAACCAC)进行PCR。SEQ ID NO9所示寡核苷酸引物在RA8基因的外显子2中产生BamHI位点。
然后构建包含上述扩增序列的质粒pGA1639。质粒pGA1639包含2.7kb的SacI-BamHI片段，该片段包含RA8基因的5’侧翼区、外显子1、内含子1、和部分外显子2。
将该片段连接pGA1633中的β-葡糖醛酸糖苷酶编码序列，以构建植物表达载体pGA1647。在载体pGA1647中，上述RA8基因衍生序列在外显子2中新导入的BamHI位点处融合了GUS基因，而其阅读框架没有任何改变。由此，在部分RA8基因和β-葡糖醛酸糖苷酶编码序列之间产生了翻译融合。实施例3转基因稻的产生使用冻融法(G.An等人(编)，《植物分子生物学手册》，第A3/1-A3/19页，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，1988)将实施例2中构建的表达载体pGA1647转化到携带二元Ti质粒pAL4404的根瘤土壤杆菌LBA4404(Hoekema等人，自然(Nature)303179-181，1983)中。
将经转化根瘤土壤杆菌LBA4404在添加30mg/L潮霉素B和3mg/L四环素的AB液体培养基中培养3天，并在添加1mM甜菜碱的2N6-As培养基(Y.Hiei等人，植物杂志(Plant J.)6271-282，1994)上与由成熟种子盾片在含2mg/L 2，5-D的N6培养基(Chu C.C.等，Sci.Sin.18，659-668，1975)中诱导的3周龄愈伤组织在暗处于25℃共培养2-3天。将共培养的愈伤组织用含100mg/L头孢氨噻的无菌水清洗，并在含40mg/L潮霉素和250mg/L头孢氨噻的N6培养基上再培养3周。将活跃生长的潮霉素抗性愈伤组织转移到选择培养基上，例如添加0.2mg/L NAA(萘乙酸)、2mg/L激动素、2％山梨醇、1.6％phytagar(Gibco)、50mg/L潮霉素B、250mg/L头孢氨噻的MS培养基(Life Technologies)，然后在40 μ mol m-2sec-1的连续光照条件下培养2-3周。将由此获得的苗装盆，并在10h亮/14h暗的条件下在生长箱中进行培养，共获得22株转基因稻植株。
为了在这22株转基因稻植株中选择在花药中具有最高表达水平的植物株系，根据Dai等人的方法(Z.Dai等人，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)321055-1065，1996)，经修正染色液中含20％甲醇，然后在固定液(50％乙醇/5％乙酸/3.7％甲醛)中固定，对转基因稻的花部分进行组织化学GUS染色。在解剖镜(x7.5放大率)下观察样品。由此结果，选择在花药中展示最高GUS表达水平的稻，并命名为转基因植物株系A11279。实施例4转基因稻的组织化学GUS分析为了研究RA8基因的空间和时间表达模式，如实施例3所述，对来自实施例3中构建的转基因稻A11279的未成熟花、早空泡花粉阶段的花、成熟花、叶、和根进行GUS活性的组织化学分析，然后在显微镜下进行观察。使用未转化稻的花作为对照。
只在稻花的花药中检测到RA8启动子驱动的GUS表达，在其它花器官中或者在叶或根中则没有。另外，GUS报导基因的表达水平随花的成熟而上升，而且该基因在前成熟分裂阶段的未成熟花中一点都不表达。
为了研究RA8启动子-报导基因构建物的稻花药特异表达模式，在根据实施例3中描述的相同方法对处于不同发育阶段的4朵稻花进行染色和固定后，将它们包埋于Paraplast(Sigma)，并切成10μm厚度的切片。在光学显微镜(x100放大率)下使用暗视野照明观察切片。在前成熟分裂阶段，在花药的任何部分没有检测到GUS活性。GUS表达首先在小孢子由四合花粉释放时检测到。在空泡花粉阶段的花药中观察到最大量的GUS活性。然而，恰恰在裂开之前或之后的成熟花粉阶段的花药中，GUS活性突然下降。还观察到GUS染色局限于绒毡层、药隔组织、和药室内壁组织。实施例5转基因玉蜀黍的产生通过未成熟合子胚或可连续繁殖的I型胚性愈伤组织的微弹轰击实现用根据上述方法制备的新基因对玉蜀黍进行转化。
I型胚性玉蜀黍愈伤组织培养物(Green等人，迈阿密冬季研讨会(Miami Winter Symposium)20，1983)由温室培养物的长度为1.5-2.5mm的未成熟胚起始。由授粉大约14天后，由表面灭菌的穗无菌切下胚。可以将胚置于含2％蔗糖和5mg/L草灭平的D愈伤组织起始培养基(Duncan等人，植物(Planta)165322-332，1985)上，或置于含3％蔗糖和0.75mg/L 2，4-D的KM愈伤组织起始培养基(Kao和Michayluk，植物(Planta)126105-110，1975)上。随后将胚和胚性培养物在黑暗中进行培养。大约14天后由外植体除去胚性生长物(embryogenicresponse)。将来自D愈伤组织起始培养基的胚性生长物置于含2％蔗糖和0.5mg/L 2，4-D的D愈伤组织维持培养基上；而将来自KM愈伤组织起始培养基的胚性生长物置于含2％蔗糖和5mg/L麦草畏的KM愈伤组织维持培养基上。每周选择性传代培养在新鲜维持培养基上。3-8周后，形成高质量的致密胚性培养物。选择活跃生长的胚性愈伤组织块作为基因投递的靶组织。在基因投递前大约4小时，将愈伤组织块置于装有含12％蔗糖的维持培养基的靶板上。将愈伤组织块排列成圈，由靶板中心的半径为8和10mm。
如DuPont Biolistics手册所述，将质粒DNA沉淀在金微载体上。6次轰击微载体制备每次使用2-3μg各种质粒。使用PDS-1000He Biolistics装置将基因投递到靶组织细胞中。Biolistics装置的设置如下破裂盘和巨载体(macrocarrier)之间8mm，巨载体和终止屏之间10mm，终止屏和靶之间7cm。使用650psi破裂盘，每个靶板轰击2次。将200×200不锈钢筛网(McMaster-Carr，New Brunswick，NJ)置于终止屏和靶组织之间。
基因投递7天后，将靶组织块由高渗透性培养基转移至选择培养基上。对于使用BAR基因的选择，将靶组织块置于含100mg/L草铵膦(Basta)或20mg/L双丙氨酰膦(Herbiace)的维持培养基上。由选择培养基除去所有氨基酸。在这些高水平选择培养基上5-8周后，将任何生长的愈伤组织在含3-20mg/L Basta的培养基进行传代培养。
对于使用甘露糖磷酸异构酶基因的选择，将靶组织块置于其不含蔗糖而含1％甘露糖的相应维持培养基上。不由这些选择培养基除去氨基酸。5-8周后，将生长的愈伤组织在不含蔗糖而含1.5％甘露糖的D愈伤组织维持培养基或含1％蔗糖和0.5％甘露糖的KM愈伤组织维持培养基中进行传代培养。将在选择培养基上生长的胚性愈伤组织每2周进行传代培养，如此4-8周，直至获得足够愈伤组织以产生10-20株植物。将原始靶组织块上经选择而存活的组织以单集落进行传代培养，并计为独立转化事件。
此时，将在Basta上选择的集落转移到改良的MS培养基(含3％蔗糖而不含选择试剂，MS3S)(Murashige和Skoog，植物生理学(Physiol.Plant)15473-497，1962)上，置于亮处。向此培养基中加入0.25mg/L嘧啶醇和0.5mg/L激动素以诱导胚发生，或加入2mg/L苄基腺嘌呤。将使用甘露糖选择的集落转移到上述含嘧啶醇和激动素的改良MS培养基(含2％蔗糖和1％甘露糖，MS2S＋1M)或上述含苄基腺嘌呤的改良MS培养基(含2％蔗糖和0.5％甘露糖，MS2S＋0.5M)上。
2周后，将来自Basta选择的再生集落转移至不含嘧啶醇和激动素或苄基腺嘌呤的MS3S培养基。2周后，将来自甘露糖选择的再生集落分别转移至不含激素的MS2S＋1M和MS2S＋0.5M培养基上。将来自所有集落、含或不含根的再生芽转移至装有MS3S培养基的Magenta盒中，最后回收含根的小植株，并转移至温室的土壤中。
使用改良的48孔氯酚红实验，测试植物的PMI基因表达，其中培养基不含蔗糖而含0.5％甘露糖。将叶样品(约5mm×5mm)置于此检测培养基上，并于暗处培养约72小时。如果植物表达PMI基因，则其可以代谢甘露糖，而培养基将变成黄色。反之，培养基保持红色。
使用由未成熟合子胚经常规培养技术获得的I型愈伤组织也得到了转化事件。在基因投递前1-2天通过传代培养到新鲜培养基上，选择靶组织块，并在含12％蔗糖的培养基上排列成圈，距靶板中心10mm，制备了大约300mg I型愈伤组织用于基因投递。大约4小时后，使用购自DuPont的PDS-i000/He Biolistic装置轰击组织。使用DuPont的常规方案，将感兴趣质粒沉淀在1μm金颗粒上。每个靶板于650psi进行2次轰击投递基因。
基因投递后大约16小时，将愈伤组织转移至含2％蔗糖而不含选择试剂的标准培养基上。基因投递后12天或13天，将靶组织块转移至含40mg/L膦丝菌素(Basta或双丙氨酰膦)的选择培养基上。将愈伤组织进行12-16周的传代培养(选择)，然后将存活并生长的愈伤组织转移至含3mg/L膦丝菌素(Basta)的标准再生培养基，用于产生植株。
大约1个月后，将含正发育的胚性愈伤组织的胚外植体转移到含适当选择试剂的再生培养基(添加1mg/L NAA和5mg/LGA的MS)上。大约1个月后，将形成的芽转移到装有半量MS/2％蔗糖/相同浓度选择试剂的较大无菌容器(已知为GA7s)中。专利申请EP 0 674 715中详细描述了小麦的稳定转化。
序列表<110>Novartis AG<120>稻花药特异基因<130>S-30723A<140><141><150>KR 98-46973<151>1998-11-03<150>KR 98-50126<151>1998-11-19<160>10<170>PatentIn Ver.2.2<210>1<211>3003<212>DNA<213>Oryza sativa<400>1cattcagaat catctccagc ctacaatgta ctctctccca taatacaagt gtctctatga 60ttcaaaattt gtcctacaat ataaacattt ccagcatgaa atccatacat taattttcag 120ctaatcagat gcttggaggg aaaaatctaa gcgattcaat atgcaaaaat tgatcactga 180agtaactgaa agagaatatc tcgttttaac attagtgcta gtatttatta aacaactaaa 240aaattgttta tattttagta caaatcgagt agtagcagta gcagagctag cgtaagatcg 300tgttccgatc acctgagaaa ccgtcaggtg gtttgtctgt gccgtccagc cgatcagaat 360tcggagatcc gccgtcgttt ctttcctgaa atctgcaagt cccagcagca gcagcagcag 420agcaagagca atggcgtgca gggagtttga tactttgatg cactagctag ctactaggcg 480ttcgttccat gtcgctctca cgccgtgcga atgtgccatg atcctgcatg catcatcgcc 540aagattatat tcctcacatt ttttcttcct atcgctccta gtcgtctgtt tgggagctta 600aaattatgaa aagcagctgc tgagaagcta gctggtgaga atctgaagaa tttgagttct 660acgttcattc tccagattct acaattacag attcttataa 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权利要求
1.包含启动子序列和相关联编码序列的DNA，其中启动子序列可特异驱动编码序列在花药的绒毡层、药室内壁、和药隔组织中而不在小孢子和花粉中表达；并且编码序列的表达起始于四合花粉阶段，并在空泡花粉阶段达到最高水平。
2.权利要求1的DNA，其中所述序列包含与SEQ ID NO1所示序列具有50％或更多序列同一性的核苷酸序列。
3.权利要求1的DNA，其中所述序列包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列。
4.权利要求1-3任一项的DNA，其中编码序列为反义定向。
5.权利要求1-3任一项的DNA，其中编码序列编码在花药细胞中表达时将破坏活性花粉形成的多肽。
6.权利要求5的DNA，其中编码序列编码选自下组的多肽RNase、DTA、TURF-13、果胶酸裂解酶、gin重组酶、iaaL、和cytA毒素。
7.与SEQ ID NO1任何位点的连续30个碱基具有超过80％序列同一性的DNA序列。
8.包含能够特异启动相关联编码序列在花药的绒毡层、药室内壁、和药隔组织中而不在小孢子和花粉中表达的启动子序列的DNA，其中编码序列的表达起始于四合花粉阶段，并在空泡花粉阶段达到最高水平。
9.权利要求8的DNA，其中启动子序列与SEQ ID NO3的核苷酸序列具有50％或更多的序列同一性。
10.权利要求9的DNA，其中启动子序列包含SEQ ID NO3所示核苷酸序列。
11.权利要求1-10任一项的DNA，其中启动子序列包含能够与感兴趣的编码序列可操作连接的额外序列。
12.权利要求11的DNA，其中所述额外序列包含与SEQ ID NO10具有50％或更多的序列同一性的序列。
13.权利要求11的DNA，其中所述额外序列包含SEQ ID NO10。
14.权利要求9-13的DNA，其中所述启动子序列和额外序列与SEQ IDNO2的相应序列具有50％或更多的序列同一性。
15.权利要求9-13的DNA，其中启动子序列和额外序列的特征为SEQID NO2的核苷酸序列。
16.权利要求15的DNA，其中启动子包含可以由SEQ ID NO2获得的片段。
17.一种DNA，其包含编码特征为与SEQ ID NO4具有50％或更多序列同一性之氨基酸序列的蛋白质的开放阅读框架。
18.权利要求17的DNA，其中开放阅读框架编码特征为SEQ ID NO4的氨基酸序列的蛋白质。
19.权利要求17或18的DNA，其特征为SEQ ID NO7。
20.一种表达载体，其包含具有用于在宿主有机体诸如微生物或植物中表达的权利要求1-19任一项的DNA的第一种表达盒，并任选地含有包含感兴趣基因的第二种表达盒。
21.权利要求17-19任一项的开放阅读框架编码的蛋白质。
22.用权利要求1-19任一项的DNA序列转化了的转基因植物及其有性和/或无性繁殖后代。
23.用权利要求1-19任一项的DNA序列转化了的转基因、雄性不育植物。
24.权利要求22或23的转基因植物，其中该植物是稻、小麦、玉蜀黍、Sorgghum bicolor或鸭茅。
25.产生包含具有启动子序列和相关联编码序列之DNA的转基因植物的方法，其中启动子序列可特异启动编码序列在花药的绒毡层、药室内壁和药隔组织中而不在小孢子和花粉中表达；并且编码序列的表达起始于四合花粉阶段，并在空泡花粉阶段达到最高水平。
26.权利要求25的方法，其中所述植物是稻、小麦、玉蜀黍、Sorghumbicolor或鸭茅。
全文摘要
本发明描述了作为重组或嵌合DNA序列中编码DNA序列的花药特异转录的启动子发挥功能的新的DNA序列。本发明还描述了在植物花药中特异表达的重组或嵌合DNA序列。该重组或嵌合DNA序列可以用于产生转基因植物,尤其是转基因雄性不育植物。
文档编号C12N15/11GK1334876SQ99812819
公开日2002年2月6日 申请日期1999年11月2日 优先权日1998年11月3日
发明者安镇兴, 田钟声, 郑镛伦, 李是哲 申请人:辛根塔参与股份公司