专利名称：呼吸链泛醌抑制剂在克服溶栓再灌流损伤的应用的制作方法
技术领域：
本发明是一种呼吸链泛醌抑制剂在克服溶栓再灌流损伤方面的应用。
人体吸入的氧90％以上在线粒体中被用掉，线粒体消耗氧分子主要是用于合成三磷酸腺苷(ATP)，ATP是供给机体能量需求的主要能源分子。线粒体制造ATP是氧化磷酸化过程的结果，氧化是指呼吸链将底物电子传递给氧的过程，磷酸化是指ATP酶催化ADP+P生成ATP的过程，两个过程的偶联就是氧化磷酸化过程。
近年来科学家发现呼吸链传递电子并不是像一条绝缘很好的导线，而是像一条漏电的导线。在呼吸链的特定部位有电子漏出，漏出的电子没有进入合成ATP的氧化磷酸化过程，而是和氧分子直接反应生成了超氧自由基。超氧自由基可以歧化成双氧水并进一步产生其他一些有害的活性氧分子，活性氧分子水平过高常导致生物分子的氧化损伤即所谓自由基损伤。
呼吸链漏电子的程度与呼吸链的还原状态有关，电子充斥时的高还原状态是呼吸链容易漏电的状态。血管栓塞意味着病灶缺血，缺血即缺氧，缺氧使得呼吸链处于容易漏电的高还原态。溶栓意味着给易漏电的呼吸链充氧，有如火上浇油，加速了超氧自由基的生成，使溶栓瞬间造成严重的氧自由基损伤，这就是所说的溶栓再灌流损伤的分子机制。
目前尚无有效的临床手段克服溶栓时出现的再灌流损伤问题，文献报道(杨卫东等，“电子自旋共振直接检测心肌缺血再灌流产生的氧自由基和复方丹参对氧自由基的清除作用”，中华心血管杂志，7，178-194(1989)，采用自由基消除剂的方法达到减少再灌流损伤的目的，但氧自由基一旦瞬间大量生成就很难用自由基清除剂的手段达到完全抵偿它们的有害作用的目的。
本发明的目的是提出用具有抑制呼吸链泛醌反应的抑制剂来克服溶栓再灌流损伤。
实现本发明目的的基本原理体内生成氧自由基的主要部位是线粒体，呼吸链漏电是线粒体生成氧自由基的基本方式。本发明提出用呼吸链底物端抑制剂限制电子漏出的数量以达到减少氧自由基生成和避免产生再灌流损伤的目的，实验证明，呼吸链泛醌抑制剂具有这种功能。
本发明提出的泛醌抑制剂包括硝基水杨酰类化合物和醌类化合物一．硝基水杨酸类，通式为 式中R为C1-20烷基。
具体化合物包括3-硝基-N-甲基水杨酰胺、5-硝基-N-甲基水杨酰胺、3-硝基-N-癸基水杨酰胺。
该类化合物的制备方法见《生物化学与分子生物学学报》，15(2)308，1999。
二．醌类化合物包括下列化合物(1)卤代醌，其通式为 式中，R2、R3、R5为甲基或氯、溴取代基；R6为C1-20烷基。
具体化合物包括2，3-二甲氧基-5-溴甲基-1，4-苯醌；2，3-二甲氧基-5-溴甲基-6-癸基-1，4-苯醌；2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(1’-溴-癸基)-1，4-苯醌；2，3-二甲氧基-5-溴甲基-6-(1’-溴-癸基)-1，4-苯醌；2，3-二甲氧基-6-(1’-溴-癸基)-1，4-苯醌。它们的制备方法见“《生物化学与生物物理学报》，30(2)212-215，1998”。
(2)酰胺吡啶醌，其通式为 式中R为C1-20烷基。
具体化合物包括2-羟基-3-N-十二烷基酰胺吡啶，2-羟基-6-甲基-3-N十二烷基酰胺吡啶，3-羟基-2-N-十二烷基酰胺吡啶。它们的制备方法见“《生物化学与生物物理学报，24(6)575-579，1992”。
(3)噻唑醌，其通式为 式中，R1为H、卤素，R2为C1-20烷基或硫烷基，R3为C1-4烷基或硫氧基、羟基、卤素。
具体化合物包括2-氯-5-正十二硫烷基-6-甲基-4，7-苯并噻唑醌(2-CL-DMMDBT)、2-氯-5-正丁烷氨基-6-甲基-4，7-苯并噻唑醌(2-CL-BAMDBT)。它们的制备方法见“《生物化学与生物物理进展》，22(6)536-540，1995”本发明的泛醌抑制剂可以注射使用。
为了说明泛醌抑制剂减少再灌流损伤的效果，我们建立了大鼠脑栓塞模型。检测了缺血再灌流(即栓塞一定时间后进行溶栓)期间大鼠脑线粒体生成活性氧(以H2O2的生成为指标)、以及线粒体受到氧化损伤的情况(生成的脂过氧化产物丙二醛(MDA)为指标)。观察了呼吸链泛醌抑制剂限制病灶组织线粒体生成氧自由基的程度和减少氧化损伤的效果。表1给出了大鼠脑线粒体在缺血再灌注期间生成H2O2及MDA的情况。
表1缺血再灌注期间大鼠脑线粒体H2O2的产生量及MDA含量的变化
注缺血组1／2h和再灌注各组R／均与假手述组(Sham)相比较；*P＜0．05。
大鼠缺血后会出现缺血损伤，通常大鼠缺血两小时(1／2h)H2O2的产生量(34．2±16．0)假手术组Sham(26．0±10．7)，说明电子漏程度增高约30％。线粒体损伤程度1／2h(60．8±21．8)假手术组Sham(40．8±7．7)，氧化损伤程度高约49％。
溶栓后可发现再灌流损伤，再灌流一小时出现氧自由基产生的高峰值达39．0±8．1*，说明电子漏程度比假手术组高出50％。线粒体损伤在再灌流2小时后明显增高，R／2h达67．4±15．1*，比假手术组高出65％。再灌流4小时R／4h依然高达63．8±23．0*，比假手术组还高出56％。
如果在溶栓前先注射一定计量的泛醌反应抑制剂，溶栓后就不再出现双氧水生成量的高峰和MDA含量的增高，这说明泛醌抑制剂具有减少或避免再灌流损伤的效果。
下面通过具体实例进一步说明本发明特点。
实例1本实例为硝基水杨酰胺类化合物对泛醌反应的抑制作用，详见
图1-图3，其中3-硝基-N-甲基水杨酰胺抑制剂(3-NSMA)和5-硝基-N-甲基水杨酰胺(5-NSMA)抑制剂对琥珀酸泛醌还原酶和泛醌细胞色素C还原酶均有50％的抑制作用(见图1)。而长侧链的硝基-N-癸基水杨酰胺可以抑制接近完全(见图2)。
图1为3-硝基-N-甲基水杨酰胺(Ⅰ)和5-硝基-N-甲基水杨酰胺(Ⅱ)对泛醌-细胞色素C还原酶的抑制作用。图中·-·曲线为3硝基-N-甲基水杨酰胺；0-0曲线为5-硝基-N-甲基水杨酰胺。
检测条件(A)1．2ml反应液中含0．1摩尔磷酸缓冲液(PH=7．4)、20毫摩尔琥珀酸钠、0．3毫摩尔EDTA(乙二胺四乙酸钠盐)、0．1毫摩尔细胞色素C、30微摩尔Q2H2(还原型短链)和指定量的Ⅰ和Ⅱ。(注泛醌Q2为含两个异戊二烯侧链)。
图2为3-硝基-N-癸基水杨酰胺对电子从琥珀酸到2，6-二氯酚吲哚酚的抑制效应。图中0-0曲线用琥珀酸-细胞色素C还原酶测定的；△-△曲线是用心肌制剂测定的。检测条件反应液含0．1摩尔磷酸缓冲液(PH=7．4)、20毫摩尔琥珀酸钠、0．053毫摩尔2，6-二氯酚吲哚酚。
图3为3-硝基-N-癸基水杨酰胺对电子从泛醌到细胞色素C传递的抑制效应。图中·-·曲线是用琥珀酸-细胞色素C还原酶测定的；▲-▲曲线是用心肌制剂测定的。检测条件反应液含0．1摩尔磷酸缓冲液(PH=7．4)、0．1毫摩尔细胞色素C、30微摩尔Q2H2。
实例2本实例是2，3-二甲氧基-5-溴甲基-1，4-苯醌(Ⅰ)、2，3-二甲氧基-5-溴甲基-6-癸基-1，4-苯醌(Ⅱ)、2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(1’-溴-癸基)-1，4-苯醌(Ⅲ)、2，3-二甲氧基-5-溴甲基-6-(1’-溴-癸基-1，4-苯醌(Ⅳ)、2，3-二甲氧基-6-(1’-溴-癸基-1，4-苯醌(Ⅴ)对琥珀酸泛醌还原酶的抑制作用。检测结果见表2和表3。
表2中数据检测条件1毫升反应液中含50毫摩尔磷酸缓冲液(PH为7．4)、20毫摩尔琥珀酸钠、0．2毫摩尔EDTA、0．05毫摩尔2，6-二氯酚吲哚酚、0．3毫摩尔Q0C10H2(一种代替Q10作为底物的醌类似物，Q10为含十个异戊二烯侧链)。加0．5克／升的酶制剂20微升启动反应，600nm波长监测2，6-二氯酚吲哚酚的还原速率。
表3中数据检测条件1毫升反应液中含50毫摩尔磷酸缓冲液(PH为7．4)、20毫摩尔琥珀酸钠、0．2毫摩尔EDTA、0．1毫摩尔细胞色素C和0．3毫摩尔Q0C10H2、加0．5克／升的泛醌-细胞色素C还原酶20微升启动反应，550nm波长监测的细胞色素C还原速率。表2溴代醌类化合物对琥珀酸-泛醌还原酶的抑制作用
表3溴代醌类化合物对泛醌-细胞色素C还原酶的抑制作用
实例3本实例是酰胺吡啶类化合物2-羟基-3-N-十二烷基酰胺吡啶(A)、2-羟基-6-甲基-3-N-十二烷基酰胺吡啶(B)、3-羟基-2-N-十二烷基酰胺吡啶(C)对呼吸链酶反应的抑制作用。检测结果见表4。
检测条件同实例1。表4中SCR代表琥珀酸细胞色素C还原酶，SQR代表琥珀酸泛醌还原酶，NCR代表NADH细胞色素C还原酶，NQR代表NADH泛醌还原酶，QCR代表泛醌细胞色素C还原酶。表4酰胺吡啶类化合物对呼吸链酶反应的抑制作用
实例4本实例为苯并噻唑醌类化合物2-氯-5-正十二硫烷基-6-甲基-4，7-苯并噻唑醌(2-CL-DMMDBT)和2-氯-5-正丁烷基-6-甲基-4，7-苯并噻唑醌(2-CL-BAMDBT)对呼吸链的抑制作用。检测结果见图4。图4为2-CL-DMMDBT和2-CL-BAMDBT对心肌制剂琥珀酸氧化酶活力的抑制浓度曲线。图中0-0曲线为2-CL-DMMDBT抑制剂；X-X曲线为2-CL-BAMDBT抑制剂。
检测方法同实例1。
实例5本实例选用3-硝基-N-甲基水杨酰胺(NSMA)考察了泛醌抑制剂减少或避免再灌流损伤的效果。在溶栓前注射泛醌抑制剂硝基水杨酰胺(NSMA)240 μg／100g大鼠体重，由表5可知，溶栓后没有出现双氧水生成量的高峰和MDA量的增高，这一结果说明泛醌抑制剂具有减少或避免再灌流损伤的效果。
表5 NSMA对缺血后再灌注不同时间线粒体H2O2产生量及脂质过氧化水平的(MDA含量)的影响
注D组分别与相对应的S组比较无明显统计学差异P＞0．05。
权利要求
1．一种呼吸链泛醌抑制剂在克服溶栓再灌流损伤的应用，其特征在于所述的抑制剂包括硝基水杨酰胺类化合物和醌类化合物。
2．按照权利要求1所述的呼吸链泛醌抑制剂在克服溶栓再灌流损伤的应用，其特征在于所述的硝基水杨酰胺类化合物的通式为 式中R为C1-20烷基。
3．按照权利要求1所述的呼吸链泛醌抑制剂在克服溶栓再灌流损伤的应用，其特征在于所述的醌类化合物包括卤化醌、酰胺吡啶醌、噻唑醌，所述的卤代醌通式为 式中，R2、R3、R5为甲基或氯、溴取代基，R6为C1-20烷基，所述的酰胺吡啶醌通式为 式中R为C1-20烷基，所述的噻唑醌通式为 式中，R1为H、卤素，R2为C1-20烷基或硫烷基，R3为C1-4烷基或硫氧基、羟基、卤素。
全文摘要
本发明是一种呼吸链泛醌抑制剂在克服溶栓再灌流损伤方面的应用,所述的呼吸链泛醌抑制剂包括硝基水杨酰胺类化合物和醌类化合物。本发明的泛醌抑制剂可减少氧自由基的生成,从而达到使再灌流损伤减小或不再发生,它们可以作为筛选溶栓辅助药物的原材料。
文档编号A61P7/00GK1283460SQ0012346
公开日2001年2月14日 申请日期2000年8月17日 优先权日2000年8月17日
发明者徐建兴 申请人:中国科学院生物物理研究所