专利名称：5α,8α－环二氧－24－二甲基胆甾－6－稀－3β－醇及其苷类、酯类的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从海鞘中提取分离得到的5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇及其苷类、酯类及其制备方法和其作为抗病毒、抗癌药物的应用。
海鞘(Tunicate)是海洋生物中特有的一类与脊椎动物非常类似的原索动物，因其在分类学上占有特殊的地位，早已成为仿生生物、免疫化学和生理学的极好的研究材料。自80年代以来，国外学者陆续从海鞘中分离出吲哚、环肽、生物碱、含氮大环内酯等多种新的化合物，并发现具有抗病毒、抗癌等多种生理活性，且毒性较低。
海鞘在我国资源相当丰富，主要分布在渤海、黄海、东海、南海等海域，在我国已经记载有66种，优势品种主要有柄海鞘(Styelaclava)、玻璃海鞘(Ciona intestinalis)等。但我国对海鞘的研究开发还进行得不是很充分。
本发明的目的是通过对海鞘的系统和充分的研究，从中提取分离出可作为抗病毒、抗癌药物的5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇及其苷类、酯类。
本发明的第二个目的是提供从海鞘中提取分离得到5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇及其苷类、酯类的方法。
本发明的第三个目的是开发5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇及其苷类、酯类作为抗病毒、抗癌药物的应用。
本发明从海鞘中提取分离得到了结构式如下式5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇及其苷类、酯类， 式中R可为氢原子、葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、醋酸根、硝酸根、硫酸根的其中一种。
按照本发明的5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇，其中，式中R为氢原子。
按照本发明的5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇及其苷类，其中，式中R可为葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖的其中一种。
按照本发明的5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇及其酯类，其中，式中R可为醋酸根、硝酸根、硫酸根的其中一种。
本发明还涉及结构式如下式所示的5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇的提取制备方法， 其中，R可为氢原子、葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、醋酸根、硝酸根、硫酸根的其中一种。包括如下步骤(1)将新鲜海鞘用10-95％的醇水溶液或酮水溶液以1∶6-10的重量比回流提取或浸泡渗透提取至少一次，每次的时间为1-6个小时，将提取液减压浓缩得到浓缩的海鞘提取液；(2)将步骤(1)得到的提取液，过滤除去杂质后，依次用C6-C7烷烃、卤代烃、有机醚、有机酯和C3-C5脂肪醇提取，分别得到有机溶剂提取物和水提取物；(3)将步骤(2)得到的乙酸乙酯提取物经硅胶柱层析和HPLC层析分离，得到式(1)所示的5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇。
按照本发明的方法，其中，所述的醇为1-4碳醇，所述的酮为丙酮。
按照本发明的方法，其中，所述的C6-C7烷烃为石油醚、环己烷、己烷；所述的卤代烃为二氯甲烷，三氯甲烷、四氯甲烷；所述的有机醚为乙醚；所述的有机酯为乙酸乙酯、乙酸丁酯，乙酸戊酯；所述的C3-C5脂肪醇为正丁醇。
按照本发明的方法，其中，将步骤(3)得到的5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇用硅胶进行进一步纯化。
本发明还涉及结构式如下式所示的5α，8α-环二氧-24-二甲基 胆甾-6-稀-3β-醇作为抗癌、抗病毒药物的应用。
按照本发明，其中所述的药物的剂型为片剂、丸剂、胶囊剂、冲剂、喷雾剂、口服液、混悬液、外用搽剂、透皮吸收剂以及注射剂中的任何一种。
本发明的发明人对柄海鞘进行了系统深入的研究，从中首次提取分离得到了结构式如下式所示的5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇 其中，R可为氢原子、葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、醋酸根、硝酸根、硫酸根的其中一种。
按照本发明的第二个方面，本发明提供了结构式如上式所示的5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇的提取制备方法，包括如下步骤
(1)将新鲜海鞘用浓度为10-95％(重量)的醇水溶液或酮水溶液以1∶6-10的重量比回流提取或浸泡渗透提取至少一次，每次的提取时间为1-6个小时，将提取液减压浓缩得到浓缩的海鞘提取液；(2)将步骤(1)得到的提取液，过滤除去杂质后，依次用C6-C7烷烃、卤代烃、有机醚、有机酯和C3-C5脂肪醇提取，分别得到有机溶剂提取物和水提取物；(3)将步骤(2)得到的乙酸乙酯提取物经硅胶柱层析和HPLC层析分离，得到式(1)所示的5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇。
本发明的方法中，首先将新鲜的海鞘用浓度为10-95％的低碳醇的水溶液或酮的水溶液以1∶6-10的重量比回流提取或浸泡渗透提取。该步骤的回流或浸泡渗透提取至少进行一次，优选是用不同浓度的醇或酮的水溶液分次提取，例如，先用95％的乙醇水溶液浸泡渗透提取，然后用80％的乙醇水溶液浸泡渗透提取，再用60％的乙醇水溶液浸泡渗透提取，得到提取液后，合并提取液，然后将其减压浓缩，得到其浓缩液。其中，减压浓缩时的压力为0.01～0.03Pa，温度为25～50℃，所述的醇为C1-C4醇，例如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇；所述的酮为丙酮。
然后，将得到的浓缩提取液过滤除去杂质后，依次用C6-C7烷烃、卤代烃、有机醚、有机酯和C3-C5脂肪醇提取，分别得到有机溶剂的提取物和水提取物；其中，所述的C6-C7烷烃为石油醚、环己烷、己烷；所述的卤代烃为二氯甲烷，三氯甲烷、四氯甲烷；所述的有机醚为乙醚，所述的有机酯为乙酸乙酯、乙酸丁酯，乙酸戊酯，优选为乙酸乙酯；所述的C3-C5脂肪醇优选为正丁醇。
将得到的乙酸乙酯提取物经硅胶柱层析分离，得到式(1)所示的5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇。
本发明的发明人经过充分的研究发现，结构式如下式(1)所示的 5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇具有良好的抗癌和抗病毒活性，因此进一步开发了其作为抗癌、抗病毒药物的应用。
采用本领域公知的辅剂，可以将本发明的5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇制备成各种不同的药物剂型，例如片剂、丸剂、胶囊剂、冲剂、喷雾剂、口服液、混悬液、外用搽剂、透皮吸收剂以及注射剂。用于抗癌药物时，本发明的化合物的用量为10-30毫克/公斤体重/天；用于抗病毒药物时，本发明的化合物的用量为10-25毫克/公斤体重/天。
以下用实施例和实验例对本发明进行进一步详细的说明。但应该理解的是，本发明并不仅仅限于这些实施例和实验例。实施例1 5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇(SC1)的制备取新鲜海鞘100千克，依次用浓度为95％、80％和50％的乙醇水溶液800千克、500千克和600千克各浸泡2、3和4小时，合并提取液，将其在0.02Pa和40℃下减压浓缩，得到10千克浓缩液。
将得到的浓缩液过滤除去杂质后，依次用10千克石油醚、10千克二氯乙烷、10千克乙醚、300千克乙酸乙酯和10千克正丁醇提取，分别得到石油醚、二氯乙烷、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物。
收集乙酸乙酯提取物，在硅胶(200～300目)柱上先用石油醚洗脱，然后用体积比为1∶1的石油醚、乙酸乙酯的混合液洗脱。收集用体积比为1∶1的石油醚、乙酸乙酯的混合液洗脱后得到的洗脱液，减压浓缩，放置，得到100克标样化合物，其为白色针状结晶。易溶于氯仿、乙酸乙酯、乙醇等非极性溶剂。EI-MS分子量4441HNMR(CDCI3)δ6.26(1H，d，J＝8.4Hz；H6)，6.52(1H，d，J＝8.4Hz，H7)；3.96(1H，m，H3)；0.801(3H，d，H28)；0.823(3H，d，H29)；0.852(3H，d，H21)；0.874(6H，s，H26，H27)；1.000(3H，s，H19)；1.089(3H，s，H18)。13CNMR(CDCI3)δ(C1～C29)28.2(t)，34.6(t)，66.4(d)，39.4(t)，82.1(s)，130.7(d)，135.4(d)，79.4(s)，51.0(d)，44.7(s)，20.8(t)，36.9(t)，36.9(s)，56.1(d)，23.4(t)，30.1(t)，51.5(d)，19.6(q)，12.8(q)，27.4(d)，18.5(q)，23.8(t)，35.9(t)，44.2(s)，35.2(d)，22.5(q)，22.7(q)，18.1(q)，18.1(q)。EI-MS(m/z)444(M+)，412(M-O2)，397(M-O2-CH3)，382(M-O2-CH3-CH3)，364(M-O2-CH3-CH3-H2O)，252(M-O2-CH3-CH3-H2O-C8H16)。裂解规律如下 实验例5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇(SC2)的药效学活性实验例1 抗肿瘤活性一、本发明化合物(SC2)的抗肿瘤活性1、对小鼠H22肝癌细胞荷瘤小鼠的抑瘤活性方法常规药理实验方法(见《药理实验方法学》，徐叔云主编，人民卫生出版社，1994，第1432页)结果见表1。
表1 SC2对小鼠H22肝癌细胞荷瘤小鼠的抑瘤活性药物名称 药物用量(mg/Kg/d)平均抑瘤率SC222.6 45.94±1.23SC245.2 55.60±0.87SC290.4 62.71±0.98SC020～200 ＜10环磷酰氨 100(腹腔注射)82.72±0.68注SC0为分离活性产物后剩余产物结论SC2大、中、小剂量对小鼠肝癌有明显的抑制作用，抑制率均大于40％，而且呈量效关系。
2、SC2对小鼠Lewis肺癌的抗肿瘤作用方法常规药理实验方法(见《药理实验方法学》，徐叔云主编，人民卫生出版社，1994，第1432页)
结论SC2浓度为20～40mg/Kg/d时，对小鼠Lewis肺癌的抑瘤活性在36-45％左右3、SC2对小鼠S180肉瘤的抗肿瘤作用方法常规药理实验方法(见《药理实验方法学》，徐叔云主编，人民卫生出版社，1994，第1429页)结论SC2浓度为20～40mg/Kg/d时，对S180肉瘤的抑瘤活性在36-45％左右。
4、SC2体外对Hela细胞、KB细胞、HCT-8细胞、KETR3人肾癌细胞、A549人肺腺癌、Ht29等7株人癌细胞株的抗肿瘤活性方法常规药理实验方法(见《药理实验方法学》，徐叔云主编，人民卫生出版社，1994，第1440-1445页)结果体外MTT法检测SC2对Hela细胞、KB细胞、HCT-8细胞、KETR3人肾癌细胞、A549人肺腺癌、Ht29等7株人癌细胞株的细胞毒活性，IC50为0.05～0.2ug/ml。二、本发明化合物(SC2)的抗病毒活性1、SC2抗肝炎病毒活性(1)、SC2对2215细胞表达HBsAg的抑制活性方法常规药理实验方法(见《现代医学实验方法学》，汪谦主编，人民卫生出版社，1997，第196页)结果见表2表2SC2对2215细胞表达HBsAg的抑制活性ug/ml HBsAg(抑制率％)3天6天9天0.3 984.3(80.3) NN0.15 1230.6(75.3) NN对照 4991.0 4991.53888.5结论0.15-0.30ug/ml SC2对2215细胞表达HbsAg有明显的抑制作用。(2)、SC2对鸭血清HBV-DNA(DHBV-DNA)复制抑制活性方法应用32P标记DHBV-DNA探头进行鸭血清中DHBV-DNA斑点杂交，斑点密度在O.D490nm比色，成组t检验，分析差异显著性及抑制率。分析软件为pharmcologic calculation system-version4.1版本。
结论当SC2用量为10～20mg/Kg/次时(口服，每天2次)，给药组在用药后第5、10天(P＜0.05)和停药后3天(P＜0.01)对鸭血清HBV-DNA复制的斑点杂交抑制率可达65-80％左右，对照组为环鸟苷(抑制率70-88％)和生理盐水。(3)、SC2口服对接种鸭HBV的肝组织病理学检测结果相对于表2，接种鸭HBV-DNA的鸭在SC2用量为90.4ug/Kg/次，血清斑点杂交试验表明对鸭HBV-DNA的抑制率为80％左右；肝组织病理切片表明炎症反应轻，其炎症反应似与血清中HBV-DNA的含量呈正相关，病毒水平下降愈迅速，炎症病变愈轻。三、本发明SC2的免疫药理活性(1)、SC2对对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响方法常规药理实验方法(见《药理实验方法学》，徐叔云主编，人民卫生出版社，1994，第1233页)结果见表3。
表3 SC2对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响组别 小鼠数量 OD.(490nm)对照组 80.155±0.063CTX80.070±0.015CTX+SC2 20mg/ml80.417±0.184**CTX+SC2 45mg/ml80.348±0.145**CTX+SC2 90mg/ml80.168±0.120*注*P＜0.05，**P＜0.01；CTX＝环磷酰胺0.2ml/dx3结论SC2大、中、小不同剂量组对由环磷酰胺造成的免疫抑制有不同程度的增强作用，并呈一定的量效关系。(2)、SC2对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响方法常规药理实验方法(见《药理实验方法学》，徐叔云主编，人民卫生出版社，1994，第1233页)结果见表4。
表4 SC2对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响组别小鼠数量 OD.(490nm)对照组 8 0.058±0.019CTX 8 0.026±0.015CTX+SC2 20mg/ml 8 0.020±0.010CTX+SC2 45mg/ml 8 0.085±0.015*CTX+SC2 90mg/ml 8 0.104±0.025**注*P＜0.05，**P＜0.01；CTX＝环磷酰胺0.2ml/dx3结论不同剂量的SC2对由环磷酰胺引起的小鼠脾淋巴细胞增殖抑制有不同程度的升高作用，并呈一定的量效关系。四、本发明SC2的毒性试验方法常规药理实验方法(见《药理实验方法学》，徐叔云主编，人民卫生出版社，1994，第201页)结论200～1000mg/Kg/d采用最大容积法，用药量相当于成人用量的20～30倍灌胃，进行小鼠毒性耐受测定预试验，观察2周，未见毒性反应出现。五、小结药效学实验表明，本发明化合物SC2具有优异的抗癌和抗病毒活性，并且毒性很低。
权利要求
1.结构式如下式(1)所示的5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6- 稀-3β-醇及其苷类、酯类，式中R可为氢原子、葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、醋酸根、硝酸根、硫酸根的其中一种。
2.按照权利要求1所述的5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇及其苷类，式中R为氢原子。
3.按照权利要求1所述的5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇及其苷类，式中R可为葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖的其中一种。
4.按照权利要求1所述的5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇及其酯类，式中R可为醋酸根、硝酸根、硫酸根的其中一种。
5.按照权利要求1所述的结构式如上(1)式所示的5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇及其苷类、酯类的制备方法，其中，R为氢原子、葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、醋酸根、硝酸根、硫酸根的其中一种。包括如下步骤(1)将新鲜海鞘用10-95％的醇水溶液或酮水溶液以1∶6-10的重量比回流提取或浸泡渗透提取至少一次，每次的时间为1-6个小时，将提取液减压浓缩得到浓缩的海鞘提取液；(2)将步骤(1)得到的提取液，过滤除去杂质后，依次用C6-C7烷烃、卤代烃、有机醚、有机酯和C3-C5的脂肪醇提取，分别得到有机溶剂提取物和水提取物；将步骤(2)得到的酯提取物经硅胶柱层析分离，石油醚、石油醚∶乙酸乙酯(1∶10-1∶1)不同比例的混合液梯度洗脱得到式(1)所示的5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述的醇为1-4碳醇，所述的酮为丙酮。
7.如权利要求5所述的方法，其中，所述的C6-C7的烷烃为石油醚、环己烷、己烷；所述的卤代烃为二氯甲烷，三氯甲烷、四氯甲烷；所述的醚为乙醚，所述的有机酯为乙酸乙酯、乙酸丁酯，乙酸戊酯；所述的C3-C5脂肪醇为正丁醇。
8.如权利要求5所述的方法，其中，将步骤(3)得到的5α，8α-环二氧-24-二甲基胆甾-6-稀-3β-醇用硅胶进行进一步纯化。
9.结构式如下式(1)所示的 作为抗癌、抗病毒药物的应用，其中，R为氢原子、葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、醋酸根、硝酸根、硫酸根的其中一种。
10.如权利要求9所述的应用，其中所述的药物的剂型为片剂、丸剂、胶囊剂、冲剂、喷雾剂、口服液、混悬液、外用搽剂、透皮吸收剂以及注射剂中的任何一种。
全文摘要
本发明公开了从海鞘中提取分离得到的结构式如下式所示的5α,8α－环二氧－24－二甲基胆甾－6－稀－3β－醇及其苷类、酯类,式中R可为氢原子、葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、醋酸根、硝酸根、硫酸根的其中一种。本发明还公开了该类化合物的制备方法和作为抗癌和抗病毒药物的应用。含有本发明化合物的药物体内体外均具有很强的抗肿瘤活性和抗病毒活性。葡萄糖基;鼠李糖基;阿拉伯糖基;木糖基;硫酸根;硝酸根;醋酸根。
文档编号A61P31/12GK1358734SQ0012827
公开日2002年7月17日 申请日期2000年12月15日 优先权日2000年12月15日
发明者程云, 林文翰, 雷海民, 高蓉, 董志锋, 李伯安, 张英起, 李靖, 罗清华 申请人:中国人民解放军传染病研究所, 北京中医药大学