专利名称：重组腺病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及趋向性改变的新型重组腺病毒。更具体的说，通过除去天然结结构并用新的细胞结合配体和外部三聚化基元取代而构建了重组腺病毒。本发明还涉及用于治疗人类疾病的新型腺病毒，还包括用于挽救重组腺病毒纤维进入腺病毒基因组的方法。
背景技术：
1989年引入了临床基因疗法。那时的目标是通过在体外将健康基因引入患者的缺陷细胞然后将处理细胞注回患者体内来矫正免疫系统中的基因缺陷。从那时起，基因疗法的可能迹象增长显著。今天，引入10年后，预计可使用基因疗法治疗如血管疾病、癌症、炎症、和传染病(诸如HIV)。
然而，现在，基因疗法在人类医学中仍然不是有用的方法。一个主要原因是基因疗法需要将待投递的基因包装到基因媒介体或载体中，然后注射到患者体内并只将基因靶向预期细胞。至今尚未获得这种载体。
腺病毒(Ad)是不含包膜的DNA病毒，形状像规则的二十面体，直径60-85nm。通过锚定在病毒粒二十面体角上的纤维蛋白质而结合细胞。纤维蛋白质对完整病毒粒的装配和释放不是必需的。病毒粒的装配发生于感染细胞的核内。
纤维蛋白质是纤维多肽的同源三聚体，包含3个功能不同的部分N端尾，将纤维非共价锚定在病毒粒的五邻体基底上，还包含核定位信号；大约15个氨基酸的纤维干基元，在Ad3中重复6次，在Ad2和Ad5中重复22次(Chrobozek J、Ruigrok RWH、和Cusack S腺病毒纤维，微生物学和免疫学现行主题。1995，第163-200页)；和C端球状结构域，即结，包含与细胞腺病毒受体结合的配体(综述见上文参考文献)。每个干重复基元中有2个三氨基酸区形成β-折叠，还有2个氨基酸区形成天然伸展纤维干的转角。已经测定了细胞结合结构域三聚体的晶体结构，显示与其它反平行β-三明治结构不同的独特拓扑学(Di Xia、Henry LJ、Gerard RD、和Deisenhofer J5型腺病毒纤维蛋白质的受体结合结构域的1.7分辨率晶体结构。结构(Structure)21259-1270，1994)。在无细胞体系中也可发生纤维与病毒粒五邻体基底的结合，即纤维可结合无纤维病毒粒(Boudin M-L和Boulanger P腺病毒五邻体基底和纤维的装配。病毒学(Virology)116589-604，1982)。
只要保留结合五邻体基底并被转运至细胞核的能力，纤维似乎有可能耐受结构改变。已经尝试改变了腺病毒纤维以改变病毒结合特性。在结的C端添加短肽配体(Michael SI、Hoy JS、Curie DT、和EnglesJT给腺病毒纤维蛋白质添加短肽配体。基因疗法(Gene Therapy)2660-668，1995)，并在结的一个“环”中引入八肽。通过将FLAG四氨基酸基元引入腺病毒五邻体，显示有可能使腺病毒靶向通常不受腺病毒感染的细胞。这是通过双重特异性抗体的靶向实现的，其中一种特异性针对FLAG肽，另一种特异性针对新的靶细胞(Wickham TJ、SegalDM、Roelv ink PW、Carrion ME、Lizonova A、Lee GM、和Kovesdi I使用双重特异性抗体使腺病毒基因疗法靶向内皮细胞和平滑肌细胞。病毒学杂志(J.Virol.)706831-6838，1996)。因此，似乎有可能使腺病毒靶向广泛的人类细胞，这对于人类基因疗法是非常有用的。因为这些原因，以及腺病毒已广泛用于基因治疗性应用的原因(Tranpnell BC和Gorziglia使用腺病毒载体的基因疗法。生物技术现行观点(Current Opinion in Biotechnology)5617-65，1994)，现在已经开发了产生可用于人类基因疗法的重新靶向重组腺病毒的方法。
因此，本发明的一个目的是提供趋向性改变的重组腺病毒。
本发明的另一个目的是用于治疗人类疾病的重组腺病毒。
本发明的还有一个目的是用于挽救重组腺病毒纤维进入腺病毒基因组的方法。
发明概述通过权利要求书中所要求保护的重组腺病毒和用于挽救病毒纤维的方法，实现了本发明的目的。
根据本发明，提供了趋向性改变的重组腺病毒。该腺病毒的特征为，包含纤维尾、纤维干、和纤维结(包括三聚化基元)的天然五邻体纤维已经改变，其中除去了含细胞结合结构和天然三聚化基元的天然结，并在病毒纤维中引入了新的细胞结合配体和外部三聚化基元。
该结构改变是通过DNA技术在基因水平进行的，或者通过化学或免疫学方法在病毒水平进行。
根据本发明的另一个方面，将如上鉴定的腺病毒用于通过体内或体外方法治疗人类疾病。
本发明的还有一个方面是用于挽救重组腺病毒纤维进入腺病毒基因组的方法，包括下列步骤a)亚克隆9kb片段(由SpeI至基因组终点)；b)进一步亚克隆SacI与KpnI之间的3kb片段；c)删除NdeI与MunI之间的纤维基因，并用序列表中含XhoI位点的SEQ ID NO13取代失去的序列；d)在上文c)构建物的NdeI与XhoI之间连接重组纤维；e)通过大肠杆菌中的同源重组将上文d)构建物重新引入用NheI切割的9kb片段；f)分离上文e)重组9kb片段，并通过粘粒克隆连接9kb片段与由基因组起点至SpeI位点的27kb片段而重新产生腺病毒基因组。
图的说明
图1概述了本发明中对天然纤维进行的改变。
图2重组腺病毒纤维。
图3用于挽救重组纤维基因进入腺病毒基因组的方法。
图4a挽救进入腺病毒基因组、能够在转染细胞上和在传代培养物中产生CPE/噬斑的重组纤维。
图4b挽救进入腺病毒基因组、能够在转染细胞上和在传代培养物中产生CPE/噬斑的重组纤维。
在本发明中，通过在纤维中引入新的细胞结合配体实现了腺病毒的重新靶向(图1)。可使用任何细胞结合肽，如单克隆抗体或其片段(无论是单链片段还是Fab)、T细胞受体或其片段、整联蛋白结合肽(诸如RGD)、或生长因子(诸如表皮生长因子)。
至今已应用的配体包括表皮生长因子(EGF)、氨基酸基元RGD、克隆的T细胞受体单链片段(scTCR，可与结合HLA-A1的MAGE-1肽反应)(vd Bruggen P、Traversaari C、Chomez P、Lurquin D、De PlaenE、vd Eynde B、Knuth A、和Boon T编码人黑素瘤上由溶细胞T淋巴细胞识别的抗原的基因。科学(Science)1991年12月13日，1643-1647)、单克隆抗体G250的单链片段(scFv)(显示与人肾癌细胞上的蛋白质抗原高度选择性反应)(Oosterwijk E、Ruiter DJ、Hoedemaeker PhJ等人单克隆抗体G250识别肾癌细胞中存在而正常肾中不存在的决定簇。国际癌症杂志(Int J Cancer)38489-494，1986)。G250已广泛评价并应用于临床试验(见上文参考文献)。
可使腺病毒载体能够或不能够在允许细胞中复制。对于肿瘤治疗，有复制能力的腺病毒具有潜在优势，它可在肿瘤中复制并扩散(MillerR和Curiel DT通向复制型腺病毒载体用于癌症基因疗法的应用。基因疗法(Gene Therapy)3557-559)。这在理论上可导致所选择的效应器机制相对于无复制能力的载体而增加。此外，通过感染细胞中的致细胞病变效应，和通过引起可能损害感染细胞的抗病毒免疫应答，感染性病毒可促进抗肿瘤效果。重组纤维的构建、表达、和评价目标是开发用于构建结合特异性改变的功能性腺病毒纤维的通用方法，从而有可能构建重新靶向的腺病毒。
腺病毒纤维肽具有生成有活性病毒颗粒所必需保留的几种生物学功能。认为下列纤维特性在功能性重组纤维肽的构建中是关键的● 形成平行同源三聚体的能力。该功能是由野生型纤维结N端氨基酸序列提供的，它是纤维能够结合五邻体基底和形成功能性细胞结合结所必需的。● 结合五邻体基底以形成五邻体衣壳粒的能力。该功能是由野生型纤维尾提供的。● 表达能够附着于靶细胞的细胞结合配体的能力。该功能是由野生型纤维结提供的。● 既然腺病毒是在感染细胞的细胞核中装配的，那么转运进入感染细胞细胞核内的能力对病毒形成是至关重要的。核定位信号主要(但是或许不仅仅)是由野生型纤维尾提供的。
在第一阶段，构建重组纤维，并在转录/翻译偶联系统中无细胞表达后进行体外评价。通过SDS-PAGE和放射自显影进行分析，以揭示开放读码框的存在并给出关于翻译产物大小的信息。在下一阶段，将重组纤维克隆到杆状病毒中，并在昆虫细胞中表达，从而能够进行纤维的功能研究。这些研究包括通过单克隆抗体2A6.36(该抗体显示只与三聚体纤维反应)的免疫染色评价形成三聚体的能力(Shin Hong J和Engler JA腺病毒纤维蛋白质的氨基末端编码核定位信号。病毒学(Virology)185758-767，1991)，通过结合表达对应受体的细胞的能力证明功能性配体的表达，和结合溶液中或病毒粒上的五邻体基底的能力。
使用基于PCR(Clackson T、Güssow D、和Jones PTPCR用于基因克隆和操作的一般应用。《PCR，实践方法》(PCR，A PracticalApproach)，McPherson MJ、Quirke P、和Taylor GR编，IRL出版社，牛津，第187页，1992)的方法学，如PCR-连接-PCR(Alvaro AliS和Steinkasserer APCR-连接-PCR诱变用于产生基因融合和突变的方案。生物技术(BioTechniques)18746-750，1995)和交叠延伸剪接(SOE)(Horton RM和Pease LR通过PCR的DNA序列重组和诱变。《定点诱变》(Directed Mutagenesis)，McPherson MJ编，IRL出版社，第217页，1991)，构建了重组纤维。参照标准方法进行克隆。使用Perkin Elmer ABI Prism进行重组纤维测序，在哺乳动物细胞和昆虫细胞中表达，并用对纤维尾、纤维三聚体、和新的细胞结合配体特异的单克隆抗体染色。免疫染色后评价下列参数● 三聚化● 核转运● 新的细胞结合配体的表达。
最后，通过最近发明的下述流程，挽救重组纤维进入腺病毒基因组，并产生重组病毒颗粒。
本发明将由下文非限制性实施例进一步例示。
在计划中，对这些三聚化基元的DNA序列进行合成、克隆、并测序。
为了取代结的细胞结合功能，除了外部三聚化氨基酸基元，还在纤维中引入新的细胞结合配体。
为了提高重组纤维的核转运效率，在有些情况中，在纤维中添加外部核定位序列。
在另一个实施方案中，纤维还包含提高其在感染细胞细胞溶胶中存活的序列，由此增强进入细胞核的转运和病毒装配。这些序列是如野生型结或SEQ ID NO10-12中所示的序列。
通过上述方法(见图2)，构建了下列类型的纤维。序列表中的SEQID NO14显示了野生型纤维的序列。A型其中将三聚化基元融合于纤维基因中，在纤维干下游构成纤维结最初4个氨基酸的TLWT基元之后，或在任何干重复的第二个转角(转角b)下游，而除去其余干重复。在三聚化信号下游引入新的细胞结合配体，在三聚化信号与细胞结合配体之间添加氨基酸接头基元。B型与A型相似，但是紧挨三聚化信号的上游引入接头基元。C型其中在第一个干重复之后引入三聚化基元，后面是第17-21个干重复。在三聚化信号下游引入新的细胞结合配体，在三聚化信号与细胞结合配体之间添加氨基酸接头基元。D型其中在纤维干中的限制性位点NheI与HpaI之间引入细胞结合配体，在配体上游和下游都添加氨基酸接头。D/Δ型这是D型的变体，其中除去了D型中细胞结合配体下游的纤维干。由正常结和用A型和B型中的外部三聚化信号取代结来构建D型和D/Δ型。E型与A型相似，但是紧挨外部三聚化基元的上游保留了部分结。
在上述纤维构建物中使用下列氨基酸基元作为接头● SEQ ID NO3，衍生自假单胞菌外毒素● SEQ ID NO4，衍生自组织型凝血酶原激活剂● SEQ ID NO5，衍生自小鼠免疫球蛋白铰链区● SEQ ID NO6，衍生自葡萄球菌蛋白A● SEQ ID NO7，衍生自人IgG3的铰链区● SEQ ID NO8，衍生自人Ad5的第17个干重复将重组纤维克隆到杆状病毒中并在Sf9细胞中表达，和/或克隆到载体pSecTaq中并在COS细胞中作为分泌型蛋白质表达。通过单克隆抗体4D2.5(抗Ad5纤维)和2A6.36(抗Ad5纤维三聚体)免疫染色监测表达。无论长度和三聚化基元如何，表达和三聚化在所有重组纤维中都是明显的。
表1显示了已构建并显示能够形成三聚体且表达新的细胞结合配体的多种纤维。结果显示，本发明的技术能够产生表达新的细胞结合配体的三聚化纤维。因此，应该有可能由这些纤维产生功能性病毒。
表1.不同重组纤维的免疫染色结果检测抗体纤维 4D22A6a-EGFa-Ig a-IdA型A1 RGD + +A1 EGF + + +A1 G250 HK + ++ +A1 G250 KH + ++ +A1 G250 KHJCH2 + ++ +A1 VαLVβCβ + +A7 RGD + +A7 EGF + + +A7 G250 HK + ++ +A7 G250 KH + ++ +A7 G250 KHJCH2 + ++ +A7 VαLVβCβ + +A7 IgG3 EGF + + +A7 (Gly4Ser)4 G250VKVH + ++ +A22 EGF + + +A22 RGD + +B型B (Gly4Ser)4 RGD+ +C型C IgG3 EGF + + +C(Gly4Ser)4-G250VKVH+ ++ +D型N/D EGF + + +N/D G250 HKCKγ + ++ +F2/D EGF+ + +F3/D EGF+ + +D型/ΔF2D/ΔG250 HKCK + + +F2D/ΔG250 HKCKy+ ++ +F2D/ΔEGF + + +F3D/ΔEGF + + +表1中所用缩写2A6针对三聚化纤维的抗体4D2针对纤维的抗体a-EGF针对表皮生长因子的抗体a-Id对G250特异的抗独特型抗体a-Ig针对小鼠免疫球蛋白的抗体Cβ针对MAGE1/HLA A1的T细胞受体β链的恒定结构域(SEQ ID NO11)CH2免疫球蛋白重链恒定结构域2EGF表皮生长因子G250对肾癌特异的单克隆抗体HG250的重链可变序列(SEQ ID NO15)IgG3由人IgG3铰链区衍生的氨基酸接头(SEQ ID NO7)J免疫球蛋白连接链序列K单克隆抗体G250的轻链可变序列(SEQ ID NO16)RGD氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸Vα针对MAGE1/HLA A1的T细胞受体α链的可变结构域(SEQ ID NO10)Vβ针对MAGE1/HLA A1的T细胞受体β链的可变结构域(SEQ ID NO12)实施例2重组纤维的核定位(表2和表3)通过用相关杆状病毒克隆感染24小时后对Sf9细胞中纤维的免疫染色评价核定位。下位表2显示了一些结果。由这些实验清楚的是，有些重组纤维显示在Sf9细胞中的核定位严重受损，尽管纤维尾中存在核定址信号。
表2.天然和选定重组纤维在Sf9细胞中的核定位纤维表达纤维的Sf9细胞在感染后显示核定位的百分率野生型 100N/D EGF 100A RGD大约50A7 RGD大约100A7 EGF大约100A7 scTCR 大约50A7 G250 scFvs 0还在COS细胞中表达重组和天然纤维，其在克隆到载体pcDNA3.1中靶向表达到细胞溶胶中。在这种情况中，预计由于在纤维尾中存在天然核定位信号而将在细胞核中检测到纤维。然而，至今只在野生型纤维中和在含单链T细胞受体的纤维(即产生最有效病毒的纤维)中检测到核定位(见下文)。
由于纤维的核定位对病毒装配是至关紧要的，因此尝试通过添加外部核定位信号(NLS)来改进核定址效率，在这种情况中，是具有氨基酸序列SEQ ID NO9的SV40大T抗原NLS(Fisher-Fantuzzi L和VescoC靶向细胞核的突变型猿猴病毒40癌蛋白质中重复核信号的细胞依赖效率。分子细胞生物学(Molecular Cell Biology)85495-5503，1988)。紧挨RGD基元的上游添加外部NLS序列。发现，在已研究的情况中，外部NLS的存在显著改进核定位。事实上，如上所述，缺乏外部NLS的纤维构建物在转染细胞中是检测不到的。
表3.靶向表达到细胞溶胶中后天然和选定重组纤维在COS细胞中的核定位纤维 核定位野生型 +A VαLVβCβ +A VαLVβCβCκ+A RGD -A NLS RGD +A7 RGD -A7 NLS RGD +A22 RGD -缩写见表1上述证据支持尽管存在完整尾区域，但是重组纤维转运进入细胞核的情况很差(同样见下文)，以及这有可能通过在纤维构建物中掺入外部NLS来矫正的假设。实施例3用于挽救重组纤维进入病毒粒的方法通过下列方法将腺病毒基因组中的野生型纤维换成重组纤维(见图3)。
将以PacI-PacI片段含完整Ad5基因组的质粒pTG3602(ChartierC、Degryse E、Gantzer M、Dieterl é A、Pavirani A、和Mehtali M通过大肠杆菌中的同源重组有效产生重组腺病毒载体。病毒学杂志(JVirol)704805-4810，1996)作为起始材料。将SpeI与PacI之间含野生型纤维基因的大约9kb基因组片段分开克隆到pBluescript中。由此片段进一步亚克隆SacI与KpnI之间的3kb片段。在3kb片段中删除NdeI位点与MunI位点(起始于纤维终止密码子后第38位碱基)之间的天然纤维基因，但纤维NdeI位点上游的N端核苷酸除外。用恢复NdeI和MunI位点以及纤维终止密码子与MunI位点之间野生型基因组序列的SEQ ID NO13取代删除的序列。另外，添加的序列SEQ ID NO13包含XhoI位点，使之得以在删除纤维的3kb片段(3kb纤维穿梭体)的NdeI与XhoI之间连接重组纤维。
通过大肠杆菌中的同源重组将含重组纤维的3kb纤维穿梭体重新引入用NheI切割的9kb片段(见上文参考文献)。最后通过SpeI与PacI由载体切下产生的重组9kb片段，并通过粘粒克隆连接到分离的27kb片段中。
通过PCR在所有粘粒克隆中确认了具有预期特性的插入片段的存在。还用HindIII限制性切割粘粒克隆，并在凝胶上确认预期大小的限制性片段的存在。
用PacI限制性消化后，分离重组腺病毒基因组，并用于转染合适细胞。通过对转染细胞培养物的显微镜检查确定噬斑的产生。
由最初的转染培养物收获上清液，并用于感染传代培养物。通过显微镜检查监测致细胞病变效果和噬斑的产生。
图4a和4b显示了已成功挽救进入病毒的特定纤维构建物。结论对于可用于治疗人类疾病的基因疗法，需要能够靶向特定细胞或特定组织的可注射载体(Miller N和Vile R用于基因疗法的靶向载体。FASEB J9190-199，1995)。
本发明描述了可用于产生不含结、能三聚化、包含新的细胞结合配体的纤维并挽救进入病毒的方法，且鉴定了纤维干中耐受外来配体插入的位置。还鉴定了重组纤维胞内运输的重要性。使用本发明技术生产的重组病毒在人类医学中应当非常有用。通过联合本文所述技术与细胞结合配体的噬菌体展示鉴定，可开发事实上不受限制的靶向基因疗法。
至今已产生含人scTCR、能三聚化的纤维并挽救进入功能性病毒。由于单链抗体是大型且高度复杂的肽，因此似乎很有可能也可使用相同技术，将其它scAb和细胞结合配体(如通过噬菌体展示方法由肽文库鉴定的肽)掺入腺病毒纤维并挽救进入病毒。
有许多方法可将通过本发明重新靶向的腺病毒应用于人类基因疗法。在肿瘤疾病的情况中，存在下列选择I.使用载体将转基因引入肿瘤，诸如● 抗癌基因● “自杀”基因● 免疫调控物质或肿瘤抗原的基因● 抗血管发生性因子的基因II.使用可感染病毒。这相对于使用非复制型载体具有更多价值，因为该病毒可在肿瘤内由此细胞扩散至彼细胞，由此在肿瘤上扩大初始打击。不仅可通过插入载体的破坏细胞机制，还可通过与病毒感染自身有关的破坏细胞机制，和通过机体免疫应答对病毒感染细胞的攻击，来破坏肿瘤细胞。早已在人体内通过肿瘤内直接注射经基因操作而只在p53突变肿瘤细胞中复制的腺病毒测试了这一原理。来自大型“头和颈”肿瘤的这些有限试验的经验多少令人鼓舞，其中耐受任何形式已知治疗的11个受处理肿瘤中有2个完全消退。
序列表<110>Got-A-Gene AB<120>重组腺病毒<130>2001575<160>16<170>MS Word 97<210>1<211>36<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)<301>Hoppe HJ、Barlow PN、Reid KBM<302>位于胶原蛋白三股螺旋结构成核位点的平行三链α-螺旋束<303>FEBS通讯(FEBS Letters)<304>344<305>191-195<307>1994<400> 1Pro Asp Val Ala Ser Leu Arg Gln Gln Val Glu Asp Leu Gln Gly1 5 10 15Gln Val Gln His Ley Gln Ala Ala Phe Ser Gln Tyr Lys Lys Val20 25 30Glu Leu Phe Pro Asn Gly35<210>2<211>31<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)<301>Harbury PB、Zhang T、Kim PS、Alber T<302>GCN4亮氨酸拉链突变体中双链、三链、和四链卷曲螺旋之间的转变<303>科学(Science)<304>262<306>1401-1407<307>1993<400> 2Met Lys Gln Ile Gly Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His1 5 10 15Ile Glu Asn Gly Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu20 25 30<210>3<211>6<212>PRT<213>铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)<301>Brinkmann U、Buchner J、Pastan I<302>假单胞菌外毒素和单链免疫毒素的独立结构域折叠结构域间联系的影响<303>美国国家科学院进展(Proc Natl Acad Sci USA)<304>89<306>3075-3079<307>1992<400> 3Ala Ser Gly Gly Pro Glu1 5<210>4<211>7<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)<301>Brinkmann U、Buchner J、Pastan I<302>假单胞菌外毒素和单链免疫毒素的独立结构域折叠结构域间联系的影响<303>美国国家科学院进展(Proc Natl Acad Sci USA)<304>89<306>3075-3079<307>1992<400>4Ala Ser Glu Gly Asn Ser Asp1 5<210>5<211>8<212>PRT<213>Mus musculus<301>Brinkmann U、Buchner J、Pastan I<302>假单胞菌外毒素和单链免疫毒素的独立结构域折叠结构域间联系的影响<303>美国国家科学院进展(Proc Natl Acad Sci USA)<304>89<306>3075-3079<307>1992<400> 5Ala Ser Thr Pro Glu Pro Asp Pro1 5<210>6<211>13<212>PRT<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)<400> 6Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ser Asp1 5 10<210>7<211>11<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)<301>Dangl JL、Wensel TG、Morrison SL、Streyer L、HerzenbergLA、和Oi T<302>遗传工程嵌合型人、兔、和小鼠抗体的区段柔性和互补固定性<303>欧洲分子生物学杂志(EMBO Journal)<304>7<306>1989<307>1988<400> 7Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Ser Gly1 5 10<210>8<211>11<212>PRT<213>5型腺病毒<301>Stouten PFW、Sander C、Ruigrok WH、Cusack S<302>腺病毒纤维干的三股螺旋新模型<303>分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)<304>226<306>1073-1084<307>1992<400> 8Phe Thr Ala Ser Asn Asn Ser Lys Lys Leu Glu1 5 10<210>9<211>8<212>PRT<213>猿猴病毒40<301>Fisher-Fantuzzi L和Vesco C<302>靶向细胞核的突变型猿猴病毒40癌蛋白质中重复核信号的细胞依赖性效率<303>分子细胞生物学(Molecular Cell Biology)<304>8<306>5495-5503<307>1992<400> 9Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val1 5<210>10<211>119<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)<400> 10Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Thr Glu Ile Ser Val Val Glu Lys Glu1 5 10 15Asp Val Thr Leu Asp Cys Val Tyr Glu Thre Arg Asp Thr Thr Tyr20 25 30Tyr Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Pro Ser Gly Glu Leu Val Phe Leu Ile35 40 45Arg Arg Asn Ser Phe Asp Glu Gln Asn Glu Ile Ser Gly Arg Tyr Ser50 55 60 65Trp Asn Phe Gln Lys Ser Thr Ser Ser Phe Asn Phe Thr Ile Thr Ala70 75 80Ser Gln Val Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Gly Val85 90 95Asn Asn Asn Ala Gly Asn Met Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg100 105 110Leu Met Val Lys Pro115<210>11<211>133<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)<400> 11Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu1 5 10 15Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thre Leu Val Cys20 25 30Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Lys Ser Trp Trp35 40 45Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Set Thr Asp Pro Gln Pro50 55 60Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser65 70 75Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe80 85 90Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr95 100 105 110Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly115 120 125Arg Ala Asp Ala Ala Ala130<210>12<211>114<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)<400> 12Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp Leu Ser Val20 25 30Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe Leu Ile His35 40 45Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu Glu Arg Phe50 55 60 65Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn Leu Ser Ser70 75 80Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Val Phe Cys Ala Ser Asn Ile Ala85 90 95Gly Gly Ser Tyr Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val100 105 110Leu<210>13<211>52<212>DNA<213>人工序列<223>取代在纤维尾的NdeI限制性位点与起始于纤维终止密码子后第38位碱基的MunI位点之间删除的纤维基因序列的序列。该序列恢复NdeI和MunI位点，以及纤维终止密码子与MunI位点之间的野生型基因组序列。另外，添加的序列包含XhoI位点，使之得以连接重组纤维。<400> 13tatgcactcg agtaaagaat cgtttgtgtt atgtttcaac gtgtttatttt tc<210>14<211>1746<212>DNA<213>5型人腺病毒<221>CDS<222>1-1746<223>1-129纤维尾130-1200纤维干1201-1746纤维结<400>14atg aag cgc gca aga ccg tct gaa gat acc ttc aac ccc gtg tat cca 48Met Lys Arg Ala Arg Pro Ser Glu Asp Thr Phe Asn Pro Val Tyr Pro1 5 10 15tat gac acg gaa acc ggt cct cca act gtg cct ttt ctt act cct ccc 96Tyr Asp Thr Glu Thr Gly Pro Pro Thr Val Pro Phe Leu Thr Pro Pro20 25 30ttt gta tcc ccc aat ggg ttt caa gag agt ccc cct ggg gta ctc tct 144Phe Val Ser Pro Asn Gly Phe Gln Glu Ser Pro Pro Gly Val Leu Ser35 40 45ttg cgc cta tcc gaa cct cta gtt acc tcc aat ggc atg ctt gcg ctc 192Leu Arg Leu Ser Glu Pro Leu Val Thr Ser Asn Gly Met Leu Ala Leu50 55 60aaa atg ggc aac ggc ctc tct ctg gac gag gcc ggc aac ctt acc tcc 240Lys Met Gly Asn Gly Leu Ser Leu Asp Glu Ala Gly Asn Leu Thr Ser65 70 75 80caa aat gta acc act gtg agc cca cct ctc aaa aaa acc aag tca aac 288Gln Ash Val Thr Thr Val Ser Pro Pro Leu Lys Lys Thr Lys Ser Asn85 90 95ata aac ctg gaa ata tct gca ccc ctc aca gtt acc tca gaa gcc cta 336Ile Asn Leu Glu Ile Ser Ala Pro Leu Thr Val Thr Ser Glu Ala Leu100 105 110act gtg gct gcc gcc gca cct cta atg gtc gcg ggc aac aca ctc acc 384Thr Val Ala Ala Ala Ala Pro Leu Met Val Ala Gly Asn Thr Leu Thr115 120 125atg caa tca cag gcc ccg cta acc gtg cac gac tcc aaa ctt agc att 432Met Gln Ser Gln Ala Pro Leu Thr Val His Asp Ser Lys Leu Ser Ile130 135 140gcc acc caa gga ccc ctc aca gtg tea gaa gga aag cta gcc ctg caa 480Ala Thr Gln Gly Pro Leu Thr Val Ser Glu Gly Lys Leu Ala Leu Gln145 150 155 160aca tca ggc ccc ctc acc acc acc gat agc agt acc ctt act atc act 528Thr Ser Gly Pro Leu Thr Thr Thr Asp Ser Ser Thr Leu Thr Ile Thr165 170 175gcc tca ccc cct cta act act gcc act ggt agc ttg ggc att gac ttg 576Ala Ser Pro Pro Leu Thr Thr Ala Thr Gly Ser Leu Gly Ile Asp Leu180 185 190aaa gag ccc att tat aca caa aat gga aaa cta gga cta aag tac ggg 624Lys Glu Pro Ile Tyr Thr Gln Asn Gly Lys Leu Gly Leu Lys Tyr Gly195 200 205gct cct ttg cat gta aca gac gac cta aac act ttg acc gta gca act 672Ala Pro Leu His Val Thr Asp Asp Leu Asn Thr Leu Thr Val Ala Thr210 215 220ggt cca ggt gtg act att aat aat act tcc ttg caa act aaa gtt act 720Gly Pro Gly Val Thr Ile Asn Asn Thr Ser Leu Gln Thr Lys Val Thr225 230 235 240gga gcc ttg ggt ttt gat tca caa ggc aat atg caa ctt aat gta gca 768Gly Ala Leu Gly Phe Asp Ser Gln Gly Asn Met Gln Leu Asn Val Ala245 250 255gga gga cta agg att gat tct caa aac aga cgc ctt ata ctt gat gtt 816Gly Gly Leu Arg Ile Asp Ser Gln Asn Arg Arg Leu Ile Leu Asp Val260 265 270agt tat ccg ttt gat gct caa aac caa cta aat cta aga cta gga cag 864Ser Tyr Pro Phe Asp Ala Gln Asn Gln Leu Asn Leu Arg Leu Gly Gln275 280 285ggc cct ctt ttt ata aac tca gcc cac aac ttg gat att aac tac aac 912Gly Pro Leu Phe Ile Asn Ser Ala His Asn Leu Asp Ile Asn Tyr Asn290 295 300aaa ggc ctt tac ttg ttt aca gcttca aac aat tcc aaa aag ctt gag960Lys Gly Leu Tyr Leu Phe Thr Ala Ser Asn Asn Ser Lys Lys Leu Glu305 310 315 320gtt aac cta agc act gcc aag ggg ttg atg ttt gac gct aca gcc ata 1008Val Asn Leu Ser Thr Ala Lys Gly Leu Met Phe Asp Ala Thr Ala Ile325 330 335gcc att aat gca gga gat ggg ctt gaa ttt ggt tca cct aat gca cca 1056Ala Ile Asn Ala Gly Asp Gly Leu Glu Phe Gly Ser Pro Asn Ala Pro340 345 350aac aca aat ccc ctc aaa aca aaa att ggc cat ggc cta gaa ttt gat 1104Asn Thr Asn Pro Leu Lys Thr Lys Ile Gly His Gly Leu Glu Phe Asp355 360 365tca aac aag gct atg gtt cct aaa cta gga act ggc ctt agt ttt gac 1152Ser Asn Lys Ala Met Val Pro Lys Leu Gly Thr Gly Leu Ser Phe Asp370 375 380agc aca ggt gcc att aca gta gga aac aaa aat aat gat aag cta act 1200Ser Thr Gly Ala Ile Thr Val Gly Asn Lys Asn Asn Asp Lys Leu Thr385 390 395 400ttg tgg acc aca cca gct cca tct cct aac tgt aga cta aat gca gag 1248Leu Trp Thr Thr Pro Ala Pro Ser Pro Asn Cys Arg Leu Asn Ala Glu405 410 415aaa gat gct aaa ctc act ttg gtc tta aca aaa tgt ggc agt caa ata 1296Lys Asp Ala Lys Leu Thr Leu Val Leu Thr Lys Cys Gly Ser Gln Ile420 425 430ctt gct aca gtt tca gtt ttg gct gtt aaa ggc agt ttg gct cca ata 1344Leu Ala Thr Val Ser Val Leu Ala Val Lys Gly Ser Leu Ala Pro Ile435 440 445tct gga aca gtt caa agt gct cat ctt att ata aga ttt gac gaa aat 1392Ser Gly Thr Val Gln Ser Ala His Leu Ile Ile Arg Phe Asp Glu Asn450 455 460gga gtg cta cta aac aat tcc ttc ctg gac cca gaa tat tgg aac ttt 1440Gly Val Leu Leu Asn Asn Ser Phe Leu Asp Pro Glu Tyr Trp Asn Phe465 470 475 480aga aat gga gat ctt act gaa ggc aca gcc tat aca aac ggt gtt gga 1488Arg Asn Gly Asp Leu Thr Glu Gly Thr Ala Tyr Thr Asn Gly Val Gly485 490 495ttt atg cct aac cta tca gct tat cca aaa tct cac ggt aaa act gcc 1536Phe Met Pro Asn Leu Ser Ala Tyr Pro Lys Ser His Gly Lys Thr Ala500 505 510aaa agt aac att gtc agt caa gtt tac tta aac gga gac aaa act aaa 1584Lys Ser Asn Ile Val Ser Gln Val Tyr Leu Asn Gly Asp Lys Thr Lys515 520 525cct gta acacta acc att aca cta aac ggt aca cag gaa aca gga gac 1632Pro Val Thr Leu Thr Ile Thr Leu Asn Gly Thr Gln Glu Thr Gly Asp530 535 540aca act cca agt gca tac tct atg tca ttt tca tgg gac tgg tct ggc 1680Thr Thr Pro Ser Ala Tyr Ser Met Ser Phe Ser Trp Asp Trp Ser Gly545 550 555 560cac aac tac att aat gaa ata ttt gcc aca tcc tct tac act ttt tca 1728His Asn Tyr Ile Asn Glu Ile Phe Ala Thr Ser Ser Tyr Thr Phe Ser565 570 575tac att gcc caa gaa taaTyr Ile Ala Gln Glu ***<210>15<211>120<212>PRT<213>Mus musculus<400> 15Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Leu Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr20 25 30Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val35 40 45Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Phe Tyr Cys80 85 90 95Ala Arg His Arg Ser Gly Tyr Phe Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Ser115<210>16<211>116<212>PRT<213>Mus musculus<400> 16Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Arg Phe Met Ser Thr Thr Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Val Ser Ala20 25 30Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Leu Ala Asp Phe Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala100 105 110Pro Thr Val Ser11权利要求
1.趋向性改变的重组腺病毒，其特征为包含纤维尾、纤维干、和包括三聚化基元的纤维结的天然五邻体纤维已经改变，除去了含细胞结合结构和天然三聚化基元的天然结，并在病毒纤维中引入了新的细胞结合配体和外部三聚化基元。
2.权利要求1的腺病毒，其特征为所述结构改变是通过DNA技术在基因水平进行的，或者通过化学或免疫学方法在病毒水平进行。
3.权利要求1的腺病毒，其有复制能力或无复制能力。
4.权利要求1的腺病毒，其特征为在纤维干中引入了新的细胞结合配体。
5.权利要求1的腺病毒，其特征为在纤维干重复的下游引入了新的细胞结合配体。
6.权利要求4的腺病毒，其特征为在纤维干的限制性位点NheI与HpaI之间引入了新的细胞结合配体。
7.权利要求4的腺病毒，其特征为在细胞结合配体的上游和下游引入了氨基酸接头。
8.权利要求4的腺病毒，其特征为除去了限制性位点HpaI下游的干重复。
9.权利要求1的腺病毒，其特征为在纤维干与三聚化基元之间和/或三聚化基元与细胞结合配体之间添加了氨基酸接头基元作为接头。
10.权利要求9的腺病毒，其特征为氨基酸接头基元是下列任一种SEQ ID NO3，衍生自假单胞菌外毒素；SEQ ID NO4，衍生自组织型凝血酶原激活剂；SEQ ID NO5，衍生自小鼠免疫球蛋白铰链区；SEQ ID NO6，衍生自葡萄球菌蛋白A；SEQ ID NO7，衍生自人IgG3的铰链区；SEQ ID NO8，衍生自人乙Ad5的第17个干重复。
11.权利要求1-10任一项的腺病毒，其特征为新的细胞结合配体是任何细胞结合肽。
12.权利要求11的腺病毒，其特征为细胞结合配体是单克隆抗体或其片段，无论是单链片段或Fab，T细胞受体或其片段，整联蛋白结合肽诸如RGD，或生长因子诸如表皮生长因子。
13.权利要求12的腺病毒，其包含SEQ ID NO10-12的任何序列。
14.权利要求12的腺病毒，其特征为单链片段是单克隆抗体G250的单链片段，具有重链可变区序列SEQ ID NO15，轻链可变区序列SEQID NO16。
15.权利要求1的腺病毒，其特征为外部三聚化基元是α-螺旋卷曲螺旋基元，或能够形成功能性三聚化纤维的任何其它肽。
16.权利要求15的腺病毒，其特征为外部三聚化基元是人肺表面活性剂蛋白D的颈区肽(SEQ ID NO1)，或用异亮氨酸残基替代第1和4位亮氨酸残基的31个氨基酸的“拉链”基元SEQ ID NO2。
17.上述任一项权利要求的腺病毒，其特征为在纤维中引入了外部核定位信号(NLS)。
18.权利要求17的腺病毒，其特征为NLS是SV40大T抗原NLS。
19.上述任一项权利要求的腺病毒，其特征为纤维还包含提高其在感染细胞细胞溶胶中存活的序列，由此增强进入细胞核的转运和病毒装配。
20.权利要求19的腺病毒，其特征为序列存在于野生型结中。
21.权利要求20的腺病毒，其特征为序列如SEQ ID NO10-12所示。
22.权利要求1-21的腺病毒，用于通过体内或体外方法治疗人类疾病。
23.用于生产趋向性改变的重组腺病毒的方法，包括I.通过下列步骤挽救重组腺病毒纤维进入腺病毒基因组a)亚克隆9kb片段(由SpeI至基因组终点)，b)进一步亚克隆SacI与KpnI之间的3kb片段，c)删除NdeI与MunI之间编码天然五邻体纤维的天然纤维基因，并用含XhoI位点的序列SEQ ID NO13取代失去的序列，d)在上文c)构建物的NdeI与XhoI之间连接编码重组纤维的基因，e)通过大肠杆菌中的同源重组将上文d)构建物重新引入用NheI切割的9kb片段，f)分离上文e)的重组9kb片段，并通过粘粒克隆连接9kb片段与由基因组起点至SpeI位点的27kb片段而重新产生腺病毒基因组；并II.用步骤f)中获得的腺病毒转染细胞，使之得以表达重组腺病毒。
全文摘要
本发明涉及趋向性改变的重组腺病毒。在腺病毒中,包含纤维尾、纤维干、和纤维结(包括三聚化基元)的天然五邻体纤维已经改变,除去了含细胞结合结构和天然三聚化基元的天然结,并在病毒纤维中引入了新的细胞结合配体和外部三聚化基元。此外,本发明涉及用于通过体内或体外方法治疗人类疾病的重组腺病毒,还涉及用于挽救重组腺病毒纤维进入腺病毒基因组的方法。
文档编号A61K48/00GK1359391SQ0080988
公开日2002年7月17日 申请日期2000年6月30日 优先权日1999年7月6日
发明者L·林德霍尔姆 申请人:哥德－A－基因股份公司