专利名称：十二烷基哌嗪和十二烷基二乙醇胺以及它们的衍生物在体外净化骨髓中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及十二烷基哌嗪和十二烷基二乙醇胺以及它们的衍生物在体外净化骨髓中的应用。
白血病占青少年恶性肿瘤首位，化疗的缓解率可达70％，但五年生存率仅10％左右。缓解病人如果病情复发就导致死亡。近二十年来骨髓移植已成为治疗急性白血病的新方法，化疗缓解病人进行骨髓移植可以降低复发率，五年无病存活可达50％。骨髓移植分异体骨髓移植和自体骨髓移植。我国近二十年来也先后开展了异体骨髓移植和自体骨髓移植。在同胞兄弟姐妹中骨髓供体与受体配型合格的几率为四分之一；而在正常人群中，合格的几率仅有1-5人/10万。由于我国实行独生子女政策，致使异体供髓来源受到制约，限制了急性白血病病人做异体骨髓移植的可行性。自体骨髓移植虽不受供髓来源的制约，但存在无法避免的严重缺陷，即缓解期病人骨髓中残留白血病细胞可引起复发。因此采取体外骨髓净化手段清除骨髓中残留的白血病细胞(RLC)，保留正常造血干细胞，是消除自体骨髓移植后急性白血病复发的关键。在自体骨髓移植的病例中，净化组比不净化组长期生存率提高20％左右。最近Brenner等(Brenner MK，Rill DK，Moen RC等人，Gene-marking to trace origin ofrelapse after autologous bone marrow transplantation，Lancet，1993，34185-86)用分子生物学的方法证明，残存于骨髓中的肿瘤细胞可导致或有助于骨髓移植后白血病的复发，这一发现更加验证了在自体骨髓移植中骨髓净化的重要性。
目前净化的方法有多种，包括药物法、免疫单克隆抗体净化法和细胞因子净化法等。国外报道的骨髓净化药物有10余种，其中4-HC、ASTA-Z用于AML移植患者骨髓净化已取得了一定的效果。经净化的骨髓移植后复发率为21％～38％，长期无病生存率为61％～76％；而未经净化的骨髓移植后复发率为49％～67％，长期无病生存率为26％～44％。其它药物的研究仅限于体外实验阶段。免疫学净化方法是采用单抗加补体或免疫毒素法，其现有的抗体都是针对肿瘤相关抗原的抗体，但由于急性白血病细胞有不同类型，同一类型又有不同的分化阶段，特别是急性粒细胞白血病细胞表面标记多与正常造血干细胞某一分化阶段交叉，目前还没有发现针对急性白血病细胞的特异性抗原。相比较而言药物净化法价格低廉，方法简便，适于临床上推广应用。
关于亲溶酶体剂的药物净化骨髓研究，国外由法国学者Douay和Gorin于1982年率先报道(Douay L.等人，In vitro treatment Leukemia bone marrowfor autologous transplantation，Exp.Hematol，l982，10(suppl.12)113)，十二烷基吗啉(NDM)对人的白血病祖细胞(CFU-L)的杀灭作用远远高于对正常造血祖细胞的损伤，其选择性甚至优于环磷酰胺的衍生物4-HC。NDM是一种具有碱性pK值和较长疏水链的胺类化合物，经细胞吞饮作用可进入细胞内并聚集在溶酶体内，待达到一定浓度时可使溶酶体膜破裂，释放水解酶，导致细胞溶解和死亡。但如1988年Lopez等人报告(Lopez M.等人，Lack of differential sensitivity of normal hematopoieticstem cells and murine lymphoblastic leukemic cells to a lysosomotropic agent，N-dodecylmorpheline，Leukemia，1988，2697)，用NDM净化L1210细胞做动物回输实验的结果并不理想，故此类药物至今仍未应用于临床。
AML细胞含有较丰富的溶酶体，细胞的吞饮作用也较强。正常骨髓细胞没有溶酶体或溶酶体功能不健全。针对亲溶酶体剂是否可作为骨髓净化剂用于临床，本申请的发明人从1985年起首先在国内独家开展亲溶酶体剂体外净化骨髓的研究。先期研究结果显示十二烷基吗啉对富含溶酶体的小鼠白血病细胞L7811和急性髓系白血病M3和M5在体外均有特异性的杀灭作用，若联合42℃加温，其杀灭AML细胞的效果更佳，但动物模拟人骨髓移植实验的效果不佳，与Lopez等报告的(同上)相一致。
本申请的发明人发现十二烷基吗啉虽然对富含溶酶体的白血病细胞有特异性的杀灭作用，但需用酒精配制，在大剂量骨髓净化时，随着十二烷基吗啉剂量的增加，酒精用量也随之增加。而酒精是一种表面活性剂，它可以破坏细胞膜和杀害细胞；同时发现化合物分子通过细胞膜进入溶酶体，在溶酶体的酸性环境中质子化并堆积，这一过程可能既与分子的酸碱平衡常数(pK)有关，又与分子的亲脂亲水性即油水分配系数(LogP)有关。
因此，本发明的目的是提供十二烷基哌嗪衍生物和十二烷基二乙醇胺在体外净化骨髓中的应用，其消除了酒精对正常细胞的非特异性影响，简化净化时联合42℃加温，避免十二烷基吗啉亲水性较差、在细胞悬液中形成油滴影响药物作用等缺陷，同时提高了亲溶酶体剂的选择性，保护正常造血干细胞不受损害。
根据本发明，提供以下式之十二烷基哌嗪和十二烷基二乙醇胺以及它们的衍生物在体外净化骨髓中的应用 其中，R为H、C1-12烷基、C1-4烷氧基、琥珀酰基、赖氨酰基、咪唑基、二(C1-4烷基醇)氨基、吗啉基， 其中，X为-CH2OH或者-CH2Y，而Y为其他亲水性基团，例如羧基、取代或未取代的氨基。
C1-12烷基中优选甲基、乙基、丙基、丁基和辛基。C1-4烷氧基优选为乙氧基，而二(C1-4烷基醇)氨基优选为二乙醇氨基。
本专利申请的发明人根据急性粒细胞白血病细胞吞饮能力强，溶酶体丰富和pH低以及亲溶酶体剂的作用特点，并在现有技术的基础上，保留亲溶酶体必需的结构部分即长的脂肪烃链和叔胺结构，从增加分子的亲水性和亲脂性两方面着手，对某些基团进行修改，设计合成了十二烷基哌嗪衍生物以及十二烷基二乙醇胺，并且发现它们可提高亲溶酶体剂的选择性，保护正常造血干细胞不受损害。
发明人首先对十二烷基哌嗪和十二烷基二乙醇胺以及它们的衍生物的合成技术及构效关系的研究。通过对比烷基、芳基以及杂环不同取代的胺基比较，我们选择出烷基哌嗪作为先导化合物，合成三个先导化合物，即、N，N′-双十二烷基哌嗪(IHW1)、N-十二烷基哌嗪(IHW3)、和十二烷基二乙醇胺(IHW2)。继而合成12个系列衍生物，具体的取代基见表1所示。
然后测定各化合物的IC50，并计算油水分配系数LogP，进行定量构效关系分析，结果总结于表1。每个化合物的细胞毒性由它们对L1210细胞的半数抑制率(IC50)来表示，并计算出油水分配系数LogP。构效关系分析表明此类化合物疏水性与生物活性有密切关系，即增加分子脂溶性导致杀肿瘤细胞活性降低，增加水溶性则活性增加。增加pH值会增加活性；降低pH值则减低活性。经Hansch法分析计算，得出方程1和方程2对于哌嗪衍生物方程1log 1/IC50＝3.09+1.18Pi-0.15(Pi)2n＝8r＝0.8s＝0.283(Pi)0＝3.9
对于十二烷基二乙醇胺衍生物方程2log 1/C＝1.354(0.781)+1.215(0.213)log P-0.089(0.013)(logP)2n＝12r＝0.959s＝0.23F＝46.75logP0＝6.82方程1是表1所列1～8号化合物，均为哌嗪衍生物，方程2是在方程1的基础上扩增所得的。
表1亲溶酶体剂的理化参数
以下将参考实施例更为详细地说明本发明。
应用实验动物模拟人骨髓移植，了解白血病骨髓的净化意义和净化药物对白血病细胞杀伤作用以及对正常造血干细胞的保护作用，是评价骨髓净化剂不可缺少的依据。用药物净化骨髓的效果应以白血病祖细胞(CFU-L)和骨髓干细胞(CFU-GM)培养的回收率作为主要的衡量指标。当CFU-L为零，CFU-GM保留5％以上，骨髓移植即可取得成功。
与已知的十二烷基吗啉比较，IHW1增加油水分配系数LogP，IHW2降低LogP，IHW3降低LogP同时增加pKa。对这三个先导化合物进行体外杀L7811白血病实验结果表明，不联合42℃加温，在37℃和一定药量作用30分钟即可杀灭几乎全部L7811小鼠白血病细胞。100％杀灭L7811的最小浓度分别为十二烷基吗啉15μg/ml，IHW1＞25μg/ml，IHW2＞10μg/ml，IHW3＞5μg/ml。IHW3由于分子中引入了亲水基团，亲水性强，易于进入细胞内，增加水溶性又增加碱性，故作用最强；IHW3杀灭细胞的作用虽比IHW2强约1倍，但是可供选择的用药剂量范围较小(42μg/l×107细胞)，这使其在应用上受到一定限制。IHW2细胞毒作用强，体内毒性低，对小鼠半数致死量LD50约80mg/kg，此剂量远远超过净化所用剂量。将最大净化剂量30μg鼠，直接从尾静脉注射给3只615小鼠，无任何毒性反应，小鼠长期存活大于40天，可作为骨髓净化安全有效药物(见表2和表3)。与IHW2和IHW3相比，IHW1的亲脂性比十二烷基吗啉强，体外几乎没有细胞毒作用。
表2IHW2对CFU-AML和正常CFU-GM的杀伤作用
表3IHW3对CFU-AML和正常CFU-GM的杀伤作用
我们还发现，小剂量IHW2对正常615小鼠骨髓CFU-GM集落生长没有影响，说明IHW2对正常造血干细胞有一定的保护作用(表4)。另外，在骨髓移植时观察到输注用IHW2净化处理的白血病骨髓，结果净化组绝大多数小鼠没有因造血功能衰竭死于放射病，而且大剂量净化组有30％小鼠获得长生存(＞60天)，说明用IHW2净化后，对正常造血干细胞的损伤较轻，移植后小鼠有恢复造血能力(表4)。
表4IHW2对L7811及CFU-GM的影响
实施例3IHW2对混在骨髓中微量白血病细胞的净化作用将L7811白血病细胞和正常小鼠骨髓细胞按1∶400的比例混合，制成4×109/L白血病骨髓细胞悬液，分成4组1组为对照，不加药物；其余3组分别加入6.8mg/L、10.25mg/L、20.49mg/L的IHW2进行净化处理，然后腹腔接种于正常615小鼠，每组6只，观察36天以上。结果发现净化组小鼠可长期存活，说明IHW2对白血病骨髓具有较强的净化作用(见表5)。
表5IHW2净化白血病骨髓的作用
实施例4IHW2净化小鼠白血病骨髓的骨髓移植实验1、材料和方法1.1净化剂IHW2配成13.66g/L的溶液，于4℃冰箱中保存，用时稀释。1.2瘤株小鼠腹水型可移植性淋巴细胞白血病L7811，为本单位所建细胞系。腹水中白血病细胞占98％，接种成功率100％。1.3 动物近交系615小鼠，体重20～25g，雌性。由本所动物室及中国医学科学院动物中心提供。1.4 照射加拿大Gammacell40机，放射源为137Se，615小鼠致死照射剂量为8Gy，剂量率为0.0195Gy/s。2、方法2.1 IHW2净化方法取带盖无菌试管，加入1×107/ml细胞悬液，然后加入IHW2，对照管中不加药物。混匀后放在37℃水浴中孵育30分钟，每10分钟摇动1次。30分钟后取出试管，立即放在冰水中停止药物反应。用RPMI1640液洗涤2次后细胞悬液恢复为原体积(1ml)。做细胞计数，台盼蓝拒染测定和白血症祖细胞(CFU-L，AML骨髓)或干细胞粒—单祖细胞(CFU-GM，正常骨髓)培养。CFU-L培养体系每毫升中含2×105细胞，20％马血清，15％PHA-p条件刺激液，0.3％琼脂。CFU-GM培养体系每毫升中含2×105细胞，20％马血清，10％AB血清，15％胎肌浸液，0.3％琼脂。每个样品同时用3个平皿(平皿直径为35mm)，每个平皿中放入1ml培养体系。然后放在37℃含5％CO2的湿空气中培养7天(CFU-L)和10天(CFU-GM)。用倒置显微镜记数集落数。与对照样品比较，算出回收百分率。2.2骨髓移植净化试验将致死量照射的小鼠随机分成6组，每组7只I组小鼠照射后不做任何处理，为放射病对照组II组由尾静脉回输1×107/只正常细胞，使小鼠造血功能恢复，为正常骨髓对照组；III组回输白血病骨髓，白血病细胞与骨髓细胞的比例是1∶1000，为白血病对照组；IV、V、VI组分别回输不同剂量的IHW2净化处理的白血病骨髓，药物剂量分别为2μg/万MNC，2.5μg/万MNC，3μg/万MNC为净化组，(处理方法同上)。然后观察小鼠的生存时间及死亡原因，死后进行大体解剖及心、肝、脾、肺及肾的病理切片检查。结果见表6。
表6小鼠白血病骨髓净化移植试验
***P＜0.01从表6可以看出，净化组小鼠的平均生存时间分别为13.70±3.50天(IV)、19.36±7.80天(V)、25.93±23.59天(VI)，均比不净化的对照组(10.1±0.61天)明显延长，说明移植的骨髓具有明显的净化效果。净化组绝大多数小鼠没有因造血功能衰竭死于放射病，而且大剂量净化组(VI)有30％小鼠获得长生存(＞60天)，说明用IHW2净化后，对正常造血干细胞的损伤较轻，移植后小鼠有恢复造血能力。
3.2单个核细胞分离将采集的骨髓每100ml置于预先装有80ml淋巴细胞分离液的无菌空血袋的液面上，在4℃大容量离心机中以1500r/min的速度离心18分钟，弃上清，收集单核细胞(NMC)层，将所收集的NMC汇集后用TC199细胞培养液洗涤两次，其1/3，约相当于1×108/kg个有核细胞的量用于净化处理。
3.3药物来源实施例2中合成的十二烷基二乙醇胺(IHW2)，为无色透明水溶性药物。
3.4净化方法将用于净化的骨髓单核细胞(MNC)盛入无菌塑料空袋中，用含10％人AB血清的TC199液稀释成1×107/ml的细胞浓度，然后加入IHW2，浓度为20μg/ml。将血袋放入37℃水浴中孵育30分钟，每10分钟摇动混匀1次，孵育结束后再将袋子放入冰水5分钟终止药物反应。取出袋子，加入TC199液洗涤两次，再用TC199液将细胞稀释至100ml左右，使细胞浓度不超过5×107/ml。冷冻前取细胞做细胞计数、台盼蓝拒染率和CFU-GM、CFU-L测定。
3.5冷冻保存及回输将保底及净化后的MNC分别盛于低温冷冻袋(上海血液中心制造，100ml)中，再与配制好的预冷于4℃的防冻液按1∶1比例缓慢混匀(防冻液的成分为20％DMSO，10％AB血清，70％TC199)，放入Cryo Med程控降低温机中按1℃/min的速度降温到-40℃，再以10℃/min的速度降温到-80℃。取出装有净化后骨髓的袋子投入到液氮中保存。回输时将骨髓放入42℃水浴中在1分钟内快速融化，立即全速回输。并留样品做细胞计数及CFU-GM测定。
3.6 临床净化疗效至2000年底，1例于移植后24天因并发急性呼吸窘迫综合症(ARDS)死亡，2例于移植后3、17个月复发，2例无病生存分别为80和82个月。
权利要求
1.下式之十二烷基哌嗪衍生物在体外净化骨髓中的应用 其中，R为H、C1-12烷基、C1-4烷氧基、琥珀酰基、赖氨酰基、咪唑基、二(C1-4烷基醇)氨基、吗啉基。
2.如权利要求1所述的应用，其中R为甲基、乙基、丙基、丁基、辛基、乙氧基、二乙醇氨基。
3.下式之十二烷基二乙醇胺及其衍生物在体外净化骨髓中的应用 其中，X为-CH2OH或者-CH2Y，而Y为亲水性基团。
4.如权利要求3所述的应用，其中Y为羧基、取代或未取代的氨基。
全文摘要
本发明涉及十二烷基哌嗪和十二烷基二乙醇胺以及它们的衍生物在体外净化骨髓中的应用,其提高了亲溶酶体剂的选择性,保护正常造血干细胞不受损害。
文档编号A61K31/133GK1374084SQ01109460
公开日2002年10月16日 申请日期2001年3月12日 优先权日2001年3月12日
发明者杨纯正, 王军, 刘健, 彭晖, 张广宇, 朱惠芳, 姜蓉, 卓家才, 韩明哲 申请人:中国医学科学院血液学研究所