专利名称：新的钩端螺旋体外膜蛋白、其编码序列及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的编码钩端螺旋体外膜蛋白-OMP120(Outer membrane protein 120kD)的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。具体地说，本发明的多肽是一种新的可作为免疫抗原。
背景技术：
钩端螺旋体病是一种分布广泛的人兽共患病，主要分布在中国南方以及东南亚、南亚等发展中国家和地区。在中国，本病1995年列入法定传染病。1955-1993年，年平均发病率为十万分之七，年平均死亡率占发病人数的1.02％。
中国钩体病的的流行菌群以黄疸出血群和波摩那群为主。黄疸出血群有15个血清型，其中以赖型最为常见。1958年，从四川温江地区赖姓患者体内分离出赖型赖株，并得到国际钩端螺旋体分类小组会确认，该菌株现保存在中国预防医学科学院流行病与微生物学研究所。
中国虽在该病的防治方面取得了巨大的成功，但对该病的致病和免疫的机理仍了解不够。
钩端螺旋体(Leptospira sp.)属格兰氏阴性菌，外膜是菌体的一个组成部分，位于钩端螺旋体细胞的最外层，外膜蛋白质具有抗原活性，是抗体和补体的主要作用对象。钩端螺旋体菌苗是钩端螺旋体病特异性预防的一种生物制品，经历了死菌苗、活菌苗、纯化菌苗、基因工程重组菌苗的发展阶段。然而，这些疫苗的效果还不令人满意。目前为止，仍没有开发出利用钩端螺旋体外膜蛋白的免疫制剂。
因此，本领域迫切需要开发新的利用钩端螺旋体外膜蛋白作为抗原的疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的钩端螺旋体外膜蛋白OMP120蛋白以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的OMP120多肽，它包含具有SEQID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性(a)编码上述钩端螺旋体OMP120多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中16-2973位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-2973位的序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备具有钩端螺旋体OMP120蛋白活性的多肽的方法，该方法包含(a)在适合表达钩端螺旋体OMP120蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有钩端螺旋体OMP120蛋白活性的多肽。
在本发明的第五方面，提供了与上述的钩端螺旋体OMP120多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的10-2973个核苷酸。
在本发明的第六方面，提供了检测样品中是否存在OMP120蛋白的方法，它包括将样品与OMP120蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在OMP120蛋白。
在本发明的第七方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明的钩端螺旋体OMP120蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。
在本发明的第八方面，提供了一种疫苗组合物，它含有安全有效量的本发明的钩端螺旋体OMP120多肽或其片段以及药学上可接受的载体。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1是本发明的钩端螺旋体的外膜蛋白质电泳图谱，其中OMP120用箭头标出。其中，泳道1为外膜蛋白质，泳道2为分子量标准从上到下为68KD，60KD，41KD，30KD，18KD，15KD。箭头所指的是目标蛋白质OMP120。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，从问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)黄疸出血群赖型赖株中分离纯化和鉴定了一种新的外膜蛋白质OMP120，该外膜蛋白可作为抗原用于疫苗的设计和制备。在此基础上完成了本发明。
在本发明中，术语“OMP120蛋白”、“OMP120多肽”或“钩端螺旋体外膜蛋白OMP120”可互换使用，都指具有钩端螺旋体外膜蛋白OMP120氨基酸序列(SEQ IDNO2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的钩端螺旋体外膜蛋白OMP120。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的OMP120蛋白或多肽”是指OMP120多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化OMP120蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括钩端螺旋体OMP120蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然钩端螺旋体OMP120蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“钩端螺旋体OMP120多肽”指具有钩端螺旋体OMP120蛋白活性或免疫原性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与钩端螺旋体OMP120蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。该术语还包括钩端螺旋体OMP120蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与钩端螺旋体OMP120 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗钩端螺旋体OMP120多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含钩端螺旋体OMP120多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了钩端螺旋体OMP120多肽的可溶性片段。通常，该片段具有钩端螺旋体OMP120多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。这些片段也可用作免疫原以诱导针对钩端螺旋体的免疫应答反应。
发明还提供钩端螺旋体OMP120蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然钩端螺旋体OMP120多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“钩端螺旋体OMP120蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。本发明的核苷酸序列可以根据密码子的对应关系，根据SEQ ID NO2的氨基酸推导出。
编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码OMP120蛋白的多聚核苷酸。
本发明的钩端螺旋体OMP120核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或OMP120蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的OMP120多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码钩端螺旋体OMP120多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，钩端螺旋体OMP120多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含钩端螺旋体OMP120编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的钩端螺旋体OMP120蛋白或多肽有多方面的用途，其中包括(但不限于)作为抗原用于制备疫苗。
另一方面，本发明还包括对钩端螺旋体OMP120 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于钩端螺旋体OMP120基因产物或片段。较佳地，指那些能与钩端螺旋体OMP120基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的钩端螺旋体OMP120基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的钩端螺旋体OMP120基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达钩端螺旋体OMP120蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。
疫苗组合物本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即在感染后治疗疾病)。
这些疫苗包含免疫性抗原或免疫原、免疫原性多肽、蛋白或蛋白片段、或核酸(如核糖核酸或脱氧核糖核酸)，通常与″药学上可接受的载体″组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)以及无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(″佐剂″)作用。另外，抗原或免疫原可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。
增强组合物效果的较佳的佐剂包括但不局限于(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方(有或没有其它特异性的免疫刺激剂，如胞壁酰肽(见下文)或细菌细胞壁成分)，例如，(a)MF59(PCT出版物No.WO90/14837)，其含有5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％Span 85(任选地含有不同量的MTP-PE(见下文)，虽然并不需要)，用微量流化器(如110Y型微量流化器(Microfluidics，Newton，MA))制成亚微米级颗粒；(b)SAF，其含有10％鲨烯、0.4％吐温80、5％普卢兰尼克(pluronic)嵌段聚合物L121以及thr-MDP(见下文)，微量流化成亚微米级乳剂或涡流振荡产生粒径较大的乳剂，和(c)RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，其含有2％鲨烯、0.2％吐温80以及取自单磷酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖酯(TDM)、和细胞壁骨架(CWS)的一种或多种细菌细胞壁组分，较佳的是MPL+CWS(DetoxTM)；(3)皂素佐剂，例如可采用StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)或从其产生的颗粒，如ISCOM(免疫刺激性复合物)；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如霍乱毒素CT，百日咳毒素PT或大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体，尤其是LT-K63、LT-R72，CT-S109、PT-K9/G129；参见例如WO93/13302和WO92/19265；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。
如上所述，胞壁酰肽包括但不局限于，N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰氨酰基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)等。
包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(如可包括抗原，药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。此外，包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物可含有在药学上可接受载体中的抗原、多肽、蛋白、蛋白片段或核酸。
更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。″免疫学有效量″指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如非人灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。
通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，在上述药学上可接受的载体下增强佐剂效果。
常规方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。适合其它给药方式的其它配方包括口服制剂、栓剂和透皮应用。治疗剂量可以是单剂方案或多剂方案。疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予。
作为以蛋白质为基础的疫苗的一种替代方案是，可以采用DNA疫苗接种。
在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从人树突状细胞cDNA文库中分离出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全长为2973个碱基，其开放读框位于16-2973位，编码全长为986个氨基酸的钩端螺旋体OMP120蛋白(SEQ ID NO2)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1菌体培养1)培养基使用EMJH液体培养基，配制5×的EMJH培养基1000，称取BSA 50g。无水醋酸钠0.5g，丙酮酸钠1g，硫酸亚铁0.25g，1.5％的氯化镁3.5ml，0.4％的硫酸锌5ml，0.15的硫酸铜1ml，磷酸氢二钠12.6g，磷酸二氢钾1.5g，氯化钠5g，氯化铵1.25g，0.05％的VB122ml，VB10.025g，调pH为7.27.6，定容至1000ml分别以0.7、0.45、0.2nm孔径的硝酸纤维素膜过滤除菌。使用时，用无菌水其5倍稀释。
2)培养条件30℃，100转/分钟摇动培养40小时。
3)菌株问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株。
实施例2外膜蛋白质提取按以下步骤提取外膜蛋白质1)约100mg湿重活菌悬浮在0.5ml 50mM Tris-HCL(pH7.3)中。
2)在French Press压力细胞破碎仪中，采用20000psi破碎细胞三次，至溶液澄清。
3)2500g离心10分钟，取上清。
4)上清加入4.5ml碳酸钠(pH11)稀释，摇匀，置于冰上1小时。
5)11500g离心1小时。
6)取沉淀，用1ml Tris-HCL(pH7.3)洗一次。
7)11500g离心20分钟。
8)沉淀中即包含外膜蛋白质(混合物)。
对外膜蛋白质的混合物进行SDS-PAGE电泳，条件是4％浓缩胶，12.5％分离胶。电泳结果如图1所示。泳道1为外膜蛋白质，泳道2为分子量标准从上到下为68KD，60KD，41KD，30KD，18KD，15KD。箭头所指出的是目标蛋白质OMP120。
实施例3胶内蛋白质酶解将图1中条带1切下，置于50％水-40％甲醇-10％醋酸中漂洗脱色后，冻干。依次加入5mM二硫苏糖醇用水泡涨后，捣碎置于100mM碳酸氢氨(pH8.3)，加入TPCK-胰蛋白酶，37℃保温24小时。酶解后，凝胶内蛋白质经0.1％三氟乙酸-60％ACN(乙睛)抽提2-3次后，冻干浓缩。
实施例4液相色谱-电喷雾离子阱质谱鉴定蛋白质和数据库检索测定在Finnigan MAT LCQ离子阱质谱仪上进行，毛细管温度，200℃；喷雾电压，4.25kV；鞘气流速，50；联用的HPLC为HP-1100型，反相C8柱(RP-300，ABI公司产品)，50x1.0 I.D.mm，流速0.05ml/min；洗脱液，A液，0.01％TFA-1％HAc-H2O；B液，0.01％TFA-1％HAc-ACN。MS/MS能量为42％-45％。
经质谱鉴定和分析，采用质谱测序功能，获得了该蛋白质6段肽的氨基酸序列
FGISNLDRFK(SEQ ID NO3)FGILAGTTYNR(SEQ ID NO4)ASGNNAYDASQALR(SEQ ID NO5)SFSISAGNSFKTEK(SEQ ID NO6)TIFNNTLGGEHEVR(SEQ ID NO7)AIPFVEGDRFGGIPTNLMK(SEQ ID NO8)随后根据这几段肽的氨基酸序列，采用Sequest软件，在本申请人构建的蛋白质数据库中检索，得到唯一的开放阅读框的序列。ttgtacgtac ggaacatgaa acataaaatt ctaagcttat tcttttttct ctctctaata 60acaagtccgg tattaggtca atccaccggt aaactggttg gtaaaatcgt ggattcggaa 120tcaggggatc ctgtttttgg aaccgtgatc atcgttcgat ccatcaaagc cgctactcga 180agcgactttg atggtaaata cgaattgaac cttccaccag gcgaacattc agttgaattc 240caaatgattg gttttgccac tcaatttaaa aaaattacga tctctccagg tgctcgggtt 300tctatgaacg tagtaatggg agctcaggtt ctagatacag tagaagtaaa aggtagaggt 360ctagaaaatt ctgaatccgc cttattggct ctacaaagaa aaagtggggt cgtctccgac 420gcgatcagcg aagaagcgat taaaaaaagt ccggattctt ctgctggaga cgttttgaga 480agagtgactg gaattactct tgtgggtggt agatttattt tcgttcgagg tttaggagaa 540agatattcaa ataccatttt aaacgattcc gtaatacctt ctcccgaacc agataaaaga 600atcgttcctt tggatttatt tcctgcgggt gtaattaaaa atattcgagt tattaaaacg 660gcttccgcag aagactcggc agaattttcg ggcggtatcg ttaagattga aaccaaagaa 720tatccagata ctctttctct ttcagtttcc ttaggtgtgg gaaaaaacac tcaggtagcc 780ggtcataaat tcaaaacgtt tgataccgga gaaatgaaca ataacttcgg tttggtttct 840aaaaaacaag aacttccaga tatgatctct ggtttaccaa aagcaattcc ttttgtagaa 900ggagatcgtt ttggcggaat ccctaccaat ctgatgaaag taggagcttt atcttttaac 960caagaatggt ctccaaaaga agaagattct ccttttaaca aatcctttag tatttccgca 1020ggaaattctt tcaaaacgga aaagtgggga agatttggaa tccttgcggg aactacatat 1080aatagaagtt ataactatag agaagaagca aacgcacgtt ttcaagcttc caatcctatt 1140tctatttatt taaaagattc taatatgtta cgtcctctga accaaaataa tctcaaaatt 1200tacggtgagg aagttctttg gggtaacaat ttaaatttag cttacgaacc taaaatcgga 1260caacagttct ttataaaaac attatattca gtgcagtcag ataaaatcgt ccgagaagga 1320gacggcgcta attacataga caatttcaat tttaaatcta caaacctaaa cttcatcagt 1380aggacaatct ttaataacac attaggtgga gaacacgaag tcagagcgtt tagcgcaaga 1440cctcataaag tggaatggaa cgtcaattac gcgttagccg aaagagacga accagacgca 1500agaaatcaag cttggtctca aggtggaacc gatcttgcaa acggttatag aagattagga 1560aacaatcctg acggaaccag atatttttcg agcaccgcgg atactgtcag aagccaatct 1620ctaaaatacg aaattccttt caatcaatgg gatggacttc aaagtaagtt gaagttcgga 1680atcagcaatt tagatcgttt taaacatttt gaatttaggg aaatcgcaca aagaaatttt 1740acaggcagcg atagagacgt gatttatcca attcctggag aagtgattta taatcctttg 1800gcctatgcta atggaaatag aaaaatctac gaacgagcct ctggaaataa cgcttacgac 1860gcttcccaag cgttacgcgc tgcttttgct cagttagaag ttccgattct tgcaaaatta 1920aaatcgattg ttggagttag atacgaagat agttaccaaa aaactaaaac ctacgatctt 1980aaaaacagtt ggaacggctt taataccagt tacggatgta aaactaattc cgaagaagaa 2040agactattgt tagtcagagc caatatttgc gacgcgacta acgttggaat cggggaactt 2100agaacaaaag ataaacttcc ttccgcaaac gtggtctggg aatttgcaaa agatatgaat 2160cttagattag gttattctca aacccttaca agaccggatc taagagaact ttctcctttc 2220ggttttgccg cttacttcca agcggacaga attttcggaa atgcaagtct tcaaaggact 2280tacattcata actatgatct tagatgggaa tactatatta caaacacaga ttatatcgga 2340gttggagcct tttttaaaaa tctttccaat ccgatcgagt taatcggtct accagttgcg 2400ggaagcgcga gtttagtgta taaatacgct aacgctcaac aagctacgat ccgaggaatc 2460gaattagatt atcgcaaaga actcctttgg tggcttagag tggaagcgaa cgttttcttt 2520attaagtcaa gagtggacgt gatcgattct aaaatttacg gtttgatcag cacaggacag 2580gtggaccctc tttccacata cgcggcctac tctccgacta ctctcaatag acctctacaa 2640ggtcaatcag actttgtagc taacttgaaa gtagatgtgt tcgtaagtaa aagcaaaaaa 2700cataatatag gattttacta taattacttt agcgacagaa ttgcgctggt aggatcggac 2760ggagttccaa acgcaattca aaaaggaact ggaacctcgg acgtagttta cacttacaga 2820cataacgatc gtcttgattt tagatcttct gtcagaaacg tcatgaacac acaatttaaa 2880attacacaaa cagatccttt aacaggacaa gaatacgtat ttcaaaaata caggaccggt 2940ttggacgttt ctttttctgc aacgtataaa cta 2973(SEQ ID NO1)其开放阅读框位于16-2973位，编码的蛋白质序列如下MKHKILSLFF FLSLITSPVL GQSTGKLVGK IVDSESGDPV FGTVIIVRSI 50KAATRSDFDG KYELNLPPGE HSVEFQMIGF ATQFKKITIS PGARVSMNVV 100MGAQVLDTVE VKGRGLENSE SALLALQRKS GVVSDAISEE AIKKSPDSSA 150GDVLRRVTGI TLVGGRFIFV RGLGERYSNT ILNDSVIPSP EPDKRIVPLD 200LFPAGVIKNI RVIKTASAED SAEFSGGIVK IETKEYPDTL SLSVSLGVGK 250NTQVAGHKFK TFDTGEMNNN FGLVSKKQEL PDMISGLPKA IPFVEGDRFG 300GIPTNLMKVG ALSFNQEWSP KEEDSPFNKS FSISAGNSFK TEKWGRFGIL 350AGTTYNRSYN YREEANARFQ ASNPISIYLK DSNMLRPLNQ NNLKIYGEEV 400LWGNNLNLAY EPKIGQQFFI KTLYSVQSDK IVREGDGANY IDNFNFKSTN 450LNFISRTIFN NTLGGEHEVR AFSARPHKVE WNVNYALAER DEPDARNQAW 500SQGGTDLANG YRRLGNNPDG TRYFSSTADT VRSQSLKYEI PFNQWDGLQS 550KLKFGISNLD RFKHFEFREI AQRNFTGSDR DVIYPIPGEV IYNPLAYANG 600NRKIYERASG NNAYDASQAL RAAFAQLEVP ILAKLKSIVG VRYEDSYQKT 650KTYDLKNSWN GFNTSYGCKT NSEEERLLLV RANICDATNV GIGELRTKDK 700LPSANVVWEF AKDMNLRLGY SQTLTRPDLR ELSPFGFAAY FQADRIFGNA 750SLQRTYIHNY DLRWEYYITN TDYIGVGAFF KNLSNPIELI GLPYAGSASL 800VYKYANAQQA TIRGIELDYR KELLWWLRVE ANVFFIKSRV DVIDSKIYGL 850ISTGQVDPLS TYAAYSPTTL NRPLQGQSDF VANLKVDVFV SKSKKHNIGF 900YYNYFSDRIA LVGSDGVPNA IQKGTGTSDV VYTYRHNDRL DFRSSVRNVM 950NTQFKITQTD PLTGQEYVFQ KYRTGLDVSF SATYKL 986(SEQ ID NO2)OMP120蛋白的理论分子量为110456Da，与电泳图谱完全吻合。
实施例5蛋白质结构研究采用PSORT软件进行，证明该蛋白质可能有N端可剪切信号肽(位置是该蛋白的前24个氨基酸)，用于装运到细胞膜外，所以该蛋白质可能位于膜间质或外膜。尽管外膜蛋白质也是跨膜蛋白，但并没有通常膜蛋白的疏水穿膜结构域。而氨基酸组成分析认为该蛋白质有可能在外膜上。
采用Wu-Blast软件进行蛋白质结构比较，发现相似性最高的蛋白质为TONB-依赖受体(TONB-dependent receptor)。OMP120蛋白与其他细菌如脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)中的外膜蛋白质117都有一定的同源性。因此可以确定该蛋白质为一种外膜蛋白质。
实施例6免疫制剂用常规基因工程方法将膜蛋白基因克隆入融合表达载体，融合表达的受体菌选用大肠杆菌或结核杆菌(卡介苗)。在大肠杆菌中表达的外膜蛋白须先将其分离、浓缩、提纯，加入福氏佐剂制备成膜蛋白免疫原。在卡介苗中表达的膜蛋白，可直接作为免疫原，即疫苗。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究中心国家人类基因组南方研究中心中国预防医学科学院流行病与微生物研究院<120>新的钩端螺旋体外膜蛋白、其编码序列及用途<130>016034<160>8<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>2973<212>DNA<213>Leptospira interrogans<220><221>CDS<222>(16)..(2973)<400>1ttgtacgtac ggaac atg aaa cat aaa att cta agc tta ttc ttt ttt ctc 51Met Lys His Lys Ile Leu Ser Leu Phe Phe Phe Leu1 5 10tct cta ata aca agt ccg gta tta ggt caa tcc acc ggt aaa ctg gtt99Ser Leu Ile Thr Ser Pro Val Leu Gly Gln Ser Thr Gly Lys Leu Val15 20 25ggt aaa atc gtg gat tcg gaa tca ggg gat cct gtt ttt gga acc gtg 147Gly Lys Ile Val Asp Ser Glu Ser Gly Asp Pro Val Phe Gly Thr Val30 35 40atc atc gtt cga tcc atc aaa gcc gct act cga agc gac ttt gat ggt 195Ile Ile Val Arg Set Ile Lys Ala Ala Thr Arg Ser Asp Phe Asp Gly45 50 55 60aaa tac gaa ttg aac ctt cca cca ggc gaa cat tca gtt gaa ttc caa 243Lys Tyr Glu Leu Asn Leu Pro Pro Gly Glu His Ser Val Glu Phe Gln65 70 75atg att ggt ttt gcc act caa ttt aaa aaa att acg atc tct cca ggt 291Met Ile Gly Phe Ala Thr Gln Phe Lys Lys Ile Thr Ile 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Ile525 530 535 540cct ttc aat caa tgg gat gga ctt caa agt aag ttg aag ttc gga atc 1683Pro Phe Asn Gln Trp Asp Gly Leu Gln Ser Lys Leu Lys Phe Gly Ile545 550 555agc aat tta gat cgt ttt aaa cat ttt gaa ttt agg gaa atc gca caa 1731Ser Asn Leu Asp Arg Phe Lys His Phe Glu Phe Arg Glu Ile Ala Gln560 565 570aga aat ttt aca ggc agc gat aga gac gtg att tat cca att cct gga 1779Arg Asn Phe Thr Gly Ser Asp Arg Asp Val Ile Tyr Pro Ile Pro Gly575 580 585gaa gtg att tat aat cct ttg gcc tat gct aat gga aat aga aaa atc 1827Glu Val Ile Tyr Asn Pro Leu Ala Tyr Ala Asn Gly Asn Arg Lys Ile590 595 600tac gaa cga gcc tct gga aat aac gct tac gac gct tcc caa gcg tta 1875Tyr Glu Arg Ala Ser Gly Asn Asn Ala Tyr Asp Ala Ser Gln Ala Leu605 610 615 620cgc gct gct ttt gct cag tta gaa gtt ccg att ctt gca aaa tta aaa 1923Arg Ala Ala Phe Ala Gln Leu Glu Val Pro Ile Leu Ala Lys Leu Lys625 630 635tcg att gtt gga gtt aga tac gaa gat agt tac caa aaa act aaa acc 1971Ser Ile Val Gly Val Arg Tyr Glu Asp Ser Tyr Gln Lys Thr 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Leu Glu Asn Ser Glu Ser Ala Leu Leu Ala Leu Gln Arg115 120 125Lys Ser Gly Val Val Ser Asp Ala Ile Ser Glu Glu Ala Ile Lys Lys130 135 140Ser Pro Asp Ser Ser Ala Gly Asp Val Leu Arg Arg Val Thr Gly Ile145 150 155 160Thr Leu Val Gly Gly Arg Phe Ile Phe Val Arg Gly Leu Gly Glu Arg165 170 175Tyr Ser Asn Thr Ile Leu Asn Asp Ser Val Ile Pro Ser Pro Glu Pro180 185 190Asp Lys Arg Ile Val Pro Leu Asp Leu Phe Pro Ala Gly Val Ile Lys195 200 205Asn Ile Arg Val Ile Lys Thr Ala Ser Ala Glu Asp Ser Ala Glu Phe210 215 220Ser Gly Gly Ile Val Lys Ile Glu Thr Lys Glu Tyr Pro Asp Thr Leu225 230 235 240Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly Val Gly Lys Asn Thr Gln Val Ala Gly245 250 255His Lys Phe Lys Thr Phe Asp Thr Gly Glu Met Asn Asn Asn Phe Gly260 265 270Leu Val Ser Lys Lys Gln Glu Leu Pro Asp Met Ile Ser Gly Leu Pro275 280 285Lys Ala Ile Pro Phe Val Glu Gly Asp Arg Phe Gly Gly Ile Pro Thr290 295 300Asn Leu Met Lys Val Gly Ala Leu Ser Phe Asn Gln Glu Trp Ser Pro305 310 315 320Lys Glu Glu Asp Ser Pro Phe Asn Lys 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权利要求
1.一种分离的钩端螺旋体OMP120多肽，其特征在于，它包含具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中16-2973位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-2973位的序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.一种具有钩端螺旋体OMP120蛋白活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达钩端螺旋体OMP120蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有钩端螺旋体OMP120蛋白活性的多肽。
9.一种能与权利要求1所述的钩端螺旋体OMP120蛋白特异性结合的抗体。
10.一种疫苗组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽和药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明提供了一种新的钩端螺旋体外膜蛋白－OMP120蛋白，编码OMP120蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种OMP120蛋白的方法。OMP120蛋白是一种有用的制备疫苗的免疫原。本发明还公开了编码这种OMP120蛋白及其编码序列用于制备疫苗的用途。
文档编号A61P31/00GK1414015SQ0113200
公开日2003年4月30日 申请日期2001年10月26日 优先权日2001年10月26日
发明者曾嵘, 夏其昌, 任双喜, 陈竺, 赵国屏, 徐建国, 黄红垒 申请人:中国科学院上海生命科学研究院, 国家人类基因组南方研究中心, 中国预防医学科学院流行病与微生物学研究所