专利名称：一种用于直接肌肉注射治疗糖尿病的质粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于直接肌肉注射治疗糖尿病的质粒。本发明将含人降钙素基因相关肽(CGRP)基因的重组真核表达质粒直接导入骨骼肌组织，使之表达CGRP蛋白，实现免疫调节，以对1型糖尿病进行基因治疗。
1型糖尿病的发生是遗传易感性和环境因素共同作用引起自身免疫损伤的结果。由于糖尿病易感性等位基因的存在或缺乏相应的保护性基因(推测多数可能为调节免疫反应的基因)，使得针对B细胞的自身免疫反应易于发生。免疫调节机制的失衡，主要是T细胞免疫平衡稳态的丧失，启动自身免疫反应，进而发生进行性胰岛B细胞损害和功能丧失，胰岛素分泌减少，血糖升高，最终表现为临床糖尿病。
在糖尿病的自身免疫发病机制中，T淋巴细胞，尤其是CD4+的T辅助淋巴细胞扮演了重要的角色。CD4+T细胞按其分泌的细胞因子不同，在功能上可分为Th1亚群(分泌IL-2、IFN-γ等)和Th2亚群(分泌IL-4、IL-10等)。胸腺中产生的纯真T细胞(naive T lymphocytes)受不同类型的抗原刺激，在复杂的细胞因子和免疫细胞作用下，分化为Th1、Th2亚群。两大Th亚群可保持相对的亚群稳定性，在免疫应答反应中相互拮抗，互相抑制。Th1亚群细胞分泌的致炎性细胞因子，可促进自身免疫性炎症损害；Th2亚群细胞分泌的细胞因子一般情况下则具有对抗自身免疫炎症的作用。人体和动物实验的大量证据表明，Th1/Th2亚群失衡是造成胰岛B细胞损害的重要原因。针对这种T细胞功能失衡进行免疫干预的实验性治疗，有可能获得从病因水平防治该类疾病的有效手段。
CGRP是具有重要免疫调节作用的神经肽。主要存在于人和哺乳动物的感觉神经中。已有的研究结果表明，CGRP可在离体情况下，抑制T淋巴细胞的转化和IL-2与IFN-γ的分泌，从而改变了Th1/Th2亚群对比，进而对自身免疫性病变如1型糖尿病的发病和病情产生防治作用。
我们着重研究了CGRP在体情况下对Th细胞功能的调节。CGRP作为肽类神经递质，半衰期仅有数分钟，且人工合成的多肽价昂，用CGRP直接注射进行免疫调节干预，难度很大。我们构建了含人CGRP基因的重组质粒，创立了CGRP裸质粒肌肉注射基因转移方法，很方便地获得了长期稳定的在体CGRP表达，观察到了在体情况下CGRP对Th细胞亚群的调节作用。我们取得了CGRP转基因治疗的自身免疫糖尿病小鼠的脾脏T淋巴细胞，测定了其增殖反应和细胞因子分泌，发现CGRP转基因治疗抑制了ConA活化的T细胞增殖，而且也抑制了Th1细胞因子IFN-γ的分泌，对Th2因子IL-4没有抑制作用。转基因治疗后腹腔液中由巨噬细胞分泌的IL-12也显著减少，可能从分化水平抑制了Th1亚群。这种选择性抑制将改变IFN-γ/IL-4的比率，调节了体内Th1/Th2亚群的平衡。从自身免疫糖尿病发病的T细胞免疫机制出发，我们证实转基因表达的CGRP通过对致炎性Th1亚群功能的选择性抑制，减轻了胰岛炎和胰岛B细胞损害，并最终降低了自身免疫性糖尿病的发病率，减轻了糖尿病病情。
本发明提供了一种用于直接肌肉注射治疗1型糖尿病的质粒，该质粒是含有CGRP基因的载体pcDNA3.1(-)，其中，CGRP基因可在pcDNA3.1(-)中的CMV启动子的引导下进行表达。本发明所述的CGRP基因含有人CT/CGRP基因的第2、3、5、6外显子的核苷酸序列。
CMV-巨细胞病毒；PolyA-多聚腺苷酸；EcoRI，BamHI，HindIII-限制性内切酶；T7-启动子代号；BGHpA-牛生长激素多腺苷酸；Ampicilin-氨苄青霉素基因；ColEl-质粒复制起始点；SV40 ori-猴肾病毒复制起始点；SV40pA-猴肾病毒多聚腺苷酸；fl ori-丝状噬菌体复制起始点；kb-千碱基对；Neomycin-新霉素；ori-复制起始点；pCMV-巨细胞病毒启动子；内切酶NheI PmeI之间的片段为pcDNA(-)的多克隆位点，目的DNA连接在该多克隆片段的内切酶EcoRI/HindII之间和EcoRI/BamHI之间。图2 CGRP重组质粒构建示意图。
CGRP基因被克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(-)中并受启动子CMV的控制。图3 多次小剂量STZ注射后小鼠血糖和胰岛素的变化。
每天腹腔注射40mg/kg剂量的streptozotocin(STZ)，连续注射5天，分别于注射后的不同时间从小鼠的尾静脉取1滴血，用Glucotrend血糖测定仪测定血糖浓度，观察血糖浓度变化；从小鼠眼球取血约0.5mL，4000g离心10分钟，用人胰岛素多抗抗体和放免方法测定小鼠血清胰岛素浓度，观察胰岛素水平变化(图3A为血糖，B为胰岛素。n＝5；*p＜0.05)图4 CGRP质粒肌肉注射后骨骼肌组织和血浆中CGRP蛋白含量增加。
质粒注射后骨骼肌匀浆和血浆中CGRP由放射免疫方法测定，图4A为骨骼肌匀浆，B为血浆。可见转基因治疗后，小鼠血浆和骨骼肌中CGRP的含量均较转基因前明显增高，增高幅度为1-3倍，表达时间可持续4周以上。(n≥6；*p＜0.05)图5 RT-PCR方法测定CGRP质粒肌肉注射后骨骼肌CGRP mRNA的表达。
分别于转基因后第3、14、28天提取质粒注射区域的骨骼肌，用RT-PCR方法测定其CGRP mRNA的水平，发现正常对照C57BL小鼠、注射空质粒对照小鼠均无CGRP mRNA表达，而CGRP转基因小鼠的骨骼肌中，在转基因3天时即有CGRP mRNA的表达，且可持续达4周以上。RT-PCR电泳照片1正常C57BL小鼠，2 pcDNA3.1空质粒转基因，3 CGRP质粒转基因3天，4 CGRP质粒转基因14天，5 CGRP质粒转基因28天，6无扩增模板的阴性对照，7 CGRP质粒的阳性对照，MMarker。图6CGRP质粒注射对自身免疫糖尿病小鼠T细胞增殖的影响。
使用3H-TdR掺入方法，比较了空质粒对照组与CGRP转基因组糖尿病小鼠脾脏T淋巴细胞在外来抗原ConA刺激下的增殖效应，结果如图6。CGRP转基因治疗糖尿病小鼠的T淋巴细胞在ConA(2μg/ml)刺激下，其增殖效应显著低于空质粒注射对照组(n＝5；*p＜0.05)。图7CGRP转基因对自身免疫糖尿病小鼠脾脏T淋巴细胞因子分泌的影响。
通过测定活化T淋巴细胞分泌的细胞因子分析其功能状态，其中IFN-γ反映致炎性Th1亚群的功能，而IL-4则反映Th2亚群功能。图7A和B显示在ConA(2μg/ml)或抗小鼠CD3抗体/PMA(0.005μg/ml)刺激下，空质粒对照组和CGRP转基因治疗组小鼠T细胞IFN-γ和IL-4分泌量的差别。可见CGRP转基因治疗显著降低了致炎性Th1因子IFN-γ的分泌，但对抑炎性Th2因子IL-4的分泌无影响。T细胞取自STZ注射后7天(CGRP转基因后12天)的小鼠。*p＜0.05，n＝4。图8CGRP转基因对小鼠自身免疫性糖尿病发病率的影响。
对比观察空质粒对照组和CGRP质粒注射转基因组小鼠糖尿病的发病率，以血糖高于12mmol/L为糖尿病发病标准。可见CGRP转基因显著降低了STZ致自身免疫性糖尿病的发病率，4周时由73％降至23％。CGRP转基因治疗组和空质粒注射对照组各30只小鼠，以χ2检验比较两组发病率，*p＜0.05。图9CGRP转基因对糖尿病小鼠血糖和血浆胰岛素水平的影响。
比较CGRP转基因治疗组与空质粒对照组的平均血糖水平，CGRP质粒注射组显著降低，持续4周以上，在4周时血糖降低幅度达3mmol/L(图9A)。CGRP转基因治疗组和空质粒注射对照组各30只小鼠，以两组间t检验比较血糖均数。*p＜0.05。
采用放射免疫法测定血浆胰岛素水平，与血糖改善的结果相一致，CGRP治疗组胰岛素水平较空质粒对照组显著增高(图9B)。两组各随机取7只小鼠取血测定胰岛素，以两组间t检验比较胰岛素均数。*p＜0.05。
给糖尿病小鼠注射CGRP质粒后第3、14、28天切取小鼠胫前肌注射局部骨骼肌组织约0.5g，提取总RNA，用RT-PCR方法检测外源DNA在肌肉组织中转录产物mRNA。以注射pcDNA3.1(-)的小鼠为对照。以β-action的mRNA为PT-PCR内参对照。结果表明正常对照C57BL小鼠、注射空质粒对照小鼠均无CGRP mRNA表达，而CGRP转基因小鼠的骨骼肌中，在转基因3天时即有CGRP mRNA的表达，且可持续达4周以上(图5)。这证明了本发明使用的肌肉直接注射的方法，可以使外源人CGRP基因在骨骼肌内表达。5CGRP质粒注射对T淋巴细胞免疫功能及自身免疫反应的影响为观察导入的重组质粒表达的CGRP对小鼠T细胞免疫的作用，我们分离培养脾脏T淋巴细胞，测定CGRP转基因后T细胞增殖和细胞因子分泌的改变。转基因组糖尿病小鼠脾脏T淋巴细胞在外来抗原ConA刺激下的增殖效应显著低于空质粒对照(图6)；而CGRP转基因治疗也显著降低了致炎性Th1因子IFN-γ的分泌，但对抑炎性Th2因子IL-4的分泌无影响(图7A和B)。这种对Th1细胞的选择性抑制可改变IFN-γ/IL-4的比率，调节了体内Th1/Th2亚群的平衡。从自身免疫疾病发病的T细胞免疫机制出发，CGRP基因治疗将抑制自身免疫炎症反应的发生。6CGRP质粒注射后对1型糖尿病发病率的影响我们比较了空质粒注射对照组和CGRP质粒注射转基因小鼠糖尿病的发病率，以血糖高于12mmol/L为糖尿病发病标准。由图8可见CGRP转基因显著降低了STZ致自身免疫性糖尿病的发病率，4周时由73％降至23％。7CGRP注射后对糖尿病小鼠血浆胰岛素水平和血糖水平的影响我们又测定并比较了对照组和CGRP转基因治疗组小鼠的平均血糖水平，见图9A。质粒注射后CGRP治疗组血糖较空质粒对照组降低，持续4周以上，4周时降低幅度达3mmol/L。
采用放射免疫法测定血浆胰岛素水平。图9B比较了两组小鼠的血浆胰岛素的改变，与血糖改善的结果相一致，CGRP治疗组胰岛素水平较空质粒对照组显著增高。持续时间亦达4周以上。说明我们构建的重组CGRP质粒肌肉注射后能够显著降低糖尿病的发病率并减轻糖尿病的病情。
参考文献1.Amara SG，Jones V，Rosenfeld MG，Ong ES，Evans RM.AlternativeRNA processing in calcitonin gene expression generates mRNAs encodingdifferent polypeptide products.Nature，1982，298240-244.
2.Xing L，Guo J，Wang X.Induction and expression of β-calcitoningene-related peptide in rat T lymphocytes and its significance.J Immunol，2000，1654359-4366.
序列表<110> 北京大学<120> 一种用于直接肌肉注射治疗糖尿病的质粒<130> I2001259<160> 2<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 405<212> DNA<213> Homo sapiens<220><221> CDS<222> (1)..(405)<223><400> 1atg gac ttc tgg aag ttc ttt cct ttt ctg gct ctc agc agc atg tgg 48Met Asp Phe Trp Lys Phe Phe Pro Phe Leu Ala Leu Ser Ser Met Trp1 5 10 15gtc ctg tgc ctg gcc agc agc ctc cag gca gcc cct ttc agg tca gct 96Val Leu Cys Leu Ala Ser Ser Leu Gln Ala Ala Pro Phe Arg Ser Ala20 25 30ttg gag agc agc cta gac ctg ggc acc ctc agc gac cag gaa aaa cac 144Leu Glu Ser Ser Leu Asp Leu Gly Thr Leu Ser Asp Gln Glu Lys His35 40 45ctc ttg ctt gct gca ttg ata cag gac tat gaa cag aag gcc agg aag 192Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ile Gln Asp Tyr Glu Gln Lys Ala Arg Lys50 55 60ctg gaa cag gag gag caa gag act gag ggc tcc agg aaa ggc tcc tcc 240Leu Glu Gln Glu Glu Gln Glu Thr Glu Gly Ser Arg Lys Gly Ser Ser65 70 75 80tcc agt gtc att tcc cag aag aga tcc tgc aac acc gcc acc tgt gtg 288Ser Ser Val Ile Ser Gln Lys Arg Ser Cys Asn Thr Ala Thr Cys Val85 90 95acc cat cgg ctg gca ggc ttg ctg cgc cgg tcg gga ggt gtg gtg aag 336Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu Arg Arg Ser Gly Gly Val Val Lys
100 105 110gac aac ttt gtg ccc acc aat gtg ggc tcc aaa gcc ttt ggc cgg cgc 384Asp Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe Gly Arg Arg115 120 125cgc agg gac ctt cgg gtc tga 405Arg Arg Asp Leu Arg Val130<210> 2<211> 134<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 2Met Asp Phe Trp Lys Phe Phe Pro Phe Leu Ala Leu Ser Ser Met Trp1 5 10 15Val Leu Cys Leu Ala Ser Ser Leu Gln Ala Ala Pro Phe Arg Ser Ala20 25 30Leu Glu Ser Ser Leu Asp Leu Gly Thr Leu Ser Asp Gln Glu Lys His35 40 45Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ile Gln Asp Tyr Glu Gln Lys Ala Arg Lys50 55 60Leu Glu Gln Glu Glu Gln Glu Thr Glu Gly Ser Arg Lys Gly Ser Ser65 70 75 80Ser Ser Val Ile Ser Gln Lys Arg Ser Cys Asn Thr Ala Thr Cys Val85 90 95Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu Arg Arg Ser Gly Gly Val Val Lys100 105 110Asp Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe Gly Arg Arg115 120 125Arg Arg Asp Leu Arg Val130
权利要求
1.一种用于直接肌肉注射治疗糖尿病的质粒，该质粒是含有CGRP基因的载体pcDNA3.1(-)，其中，CGRP基因可在pcDNA3.1(-)中的启动子的引导下进行表达。
2.按照权利要求1所述的质粒，其中，所述的CGRP基因具有SEQID NO1所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明提供了一种用于直接肌肉注射治疗糖尿病的质粒，该质粒是含有CGRP(人降钙素基因相关肽)基因的载体pcDNA3.1(－)，其中，CGRP基因可在pcDNA3.1(－)中的CMV启动子的引导下进行表达。
文档编号A61P3/10GK1410128SQ01141448
公开日2003年4月16日 申请日期2001年9月25日 优先权日2001年9月25日
发明者王宪, 孙威, 王留义 申请人:北京大学