与雌激素联合的选择性雌激素受体调节剂的制作方法

专利名称：与雌激素联合的选择性雌激素受体调节剂的制作方法
发明领域
本发明涉及生理活性化合物的新组合。具体地说，所述组合包括与一种雌激素联合的一种选择性雌激素受体调节剂(SERM)。在某些实施方案中，所述组合包括一种选择性雌激素受体调节剂(SERM)、一种雌激素和一种性类固醇前体或雄激素化合物。本发明也提供用于实施上述组合地试剂盒和药用组合物。将上述组合给予患者以减轻或消除热潮红(hot flash)、血管舒缩症状、阴道干燥或其它绝经症状的发生。认为接受这种联合疗法的患者患乳癌和/或子宫内膜癌的危险降低。也提供治疗骨质疏松、血胆固醇过多、血脂过多、动脉粥样硬化、高血压、早老性痴呆、失眠、心血管疾病、胰岛素抵抗、糖尿病和肥胖(尤其是腹部肥胖)或降低患上述病症的可能性的方法。
背景
已知许多疾病、病症和不希望有的症状对于给予外源性性类固醇或其前体反应良好。例如，据认为雌激素降低骨丢失的速率，而雄激素显示出通过刺激骨生成建立骨质。激素替代疗法(例如给予雌激素)可以用来治疗绝经症状。孕酮常常用来抵抗子宫内膜增生和雌激素诱发子宫内膜癌的危险。应用雌激素、雄激素化合物和/或孕酮治疗或预防因多种无力而受损害的各种各样的症状和疾病。用雄激素化合物治疗女性可能有引起某些男性化副作用的不希望有的副作用。此外，给予患者性类固醇，可能增加患者患某些疾病的危险。例如，女性乳癌由于雌激素活性而恶化。前列腺癌和良性前列腺增生都因雄激素活性而恶化。
需要更为有效的激素疗法并且降低副作用和危险。
认为本发明的联合疗法和可以用于这些疗法的药用组合物和试剂盒可满足这些需要。
发明概述
本发明的一个目的是提供一种治疗热潮红、血管舒缩症状、骨质疏松、心血管疾病、血胆固醇过多、血脂过多、动脉粥样硬化、高血压、胰岛素抵抗、糖尿病、肥胖(尤其是腹部肥胖)、不规则月经和阴道干燥或降低上述疾病的发病率或患上述疾病危险的方法。
本发明的另一个目的是提供一种治疗上述疾病或降低患上述疾病危险、而将不希望有的副作用减至最小的方法。
本发明的另一目的是提供适用于上述方法的试剂盒和药用组合物。
在一个实施方案中，本发明提供一种降低或消除绝经症状发生率的方法，所述方法包括给予需要所述消除或降低的患者治疗有效量的雌激素或其前药并结合给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂或其前药，所述调节剂是不同于所述雌激素的化合物。
在另一实施方案中，本发明提供一种治疗骨质疏松、血胆固醇过多、血脂过多、动脉粥样硬化、高血压、早老性痴呆、胰岛素抵抗、糖尿病、肌肉质量损失、肥胖、激素替代疗法诱发的阴道出血和激素替代疗法诱发的乳房触痛或降低患上述病症的危险的方法，所述方法包括给予需要所述消除或降低的患者治疗有效量的雌激素或其前药并结合给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂或其前药，所述调节剂是不同于所述雌激素的化合物。
在另一实施方案中，本发明提供一种药用组合物，所述药用组合物包含
a)一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体；
b)治疗有效量的至少一种雌激素或其前药；和
c)治疗有效量的至少一种选择性雌激素受体调节剂或其前药，其中所述调节剂是不同于所述雌激素的化合物。
在另一实施方案中，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括一个第一容器，所述第一容器含有一种包含治疗有效量的至少一种雌激素或其前药的药用制剂；并且所述试剂盒还包括一个第二容器，所述第二容器含有一种包含治疗有效量的至少一种选择性雌激素受体调节剂或其前药的药用制剂。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗骨质疏松或降低患骨质疏松危险的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的雌激素，还包括给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂(SERM)作为联合疗法的一部分。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗心血管疾病或降低患心血管疾病危险的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的雌激素，还包括给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂(SERM)作为联合疗法的一部分。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗血胆固醇过多或降低患血胆固醇过多危险的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的雌激素，还包括给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂(SERM)作为联合疗法的一部分。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗血脂过多或降低患血脂过多危险的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的雌激素，还包括给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂(SERM)作为联合疗法的一部分。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗动脉粥样硬化或降低患动脉粥样硬化危险的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的雌激素，还包括给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂(SERM)作为联合疗法的一部分。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗高血压或降低患高血压危险的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的雌激素，还包括给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂(SERM)作为联合疗法的一部分。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗失眠或降低发生失眠危险的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的雌激素，还包括给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂(SERM)作为联合疗法的一部分。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗认知功能的丧失或降低发生认知功能丧失危险的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的雌激素，还包括给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂(SERM)作为联合疗法的一部分。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗早老性痴呆或降低患早老性痴呆危险的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的雌激素，还包括给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂(SERM)作为联合疗法的一部分。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗糖尿病或降低患糖尿病危险的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的雌激素，还包括给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂(SERM)作为联合疗法的一部分。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗绝经症状或降低发生绝经症状危险的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的雌激素，还包括给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂(SERM)作为联合疗法的一部分。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗肥胖(尤其是腹部肥胖)或降低患肥胖(尤其是腹部肥胖)危险的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的雌激素，还包括给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂(SERM)作为联合疗法的一部分。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗绝经症状或降低发生绝经症状危险的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的雌激素，还包括给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂(SERM)作为联合疗法的一部分。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗由激素替代疗法诱发的乳房触痛或降低发生所述乳房触痛危险的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的雌激素，还包括给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂(SERM)作为联合疗法的一部分。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗由激素替代疗法诱发的阴道出血或降低发生所述病症危险的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的雌激素，还包括给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂(SERM)作为联合疗法的一部分。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗骨质疏松或降低骨质疏松发生率的方法，所述方法包括在需要所述治疗或所述降低的患者体内提高选自下列的性类固醇前体的水平脱氢表雄酮(DHEA)、硫酸脱氢表雄酮(DHEA-S)、雄烯二酮和雄-5-烯-3β，17β-二醇(5-diol)，还包括给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂(SERM)和治疗有效量的雌激素作为联合疗法的一部分。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种治疗热潮红和出汗或降低热潮红和出汗发生率的方法，所述方法包括在需要所述治疗或所述降低的患者体内提高选自下列的性类固醇前体的水平脱氢表雄酮(DHEA)、硫酸脱氢表雄酮(DHEA-S)和雄-5-烯-3β，17β-二醇(5-diol)，还包括给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂(SERM)和治疗有效量的雌激素作为联合疗法的一部分。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗上述疾病或降低患上述疾病危险的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的激动/拮抗雌激素(混合SERM)，还包括给予所述患者治疗有效量的纯选择性雌激素受体调节剂(纯SERM)或雌激素作为联合疗法的一部分。本文所用的“混合SERM”是指所述SERM在乳腺组织和子宫内膜组织中具有某些生理学或药理学浓度的雌激素活性。本文所用的“纯SERM”是指所述SERM在乳腺组织和子宫内膜组织中没有任何生理学或药理学浓度的雌激素活性。
在另一实施方案中，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括一个含有治疗有效量的至少一种雌激素的第一容器，并且还包括一个包含治疗有效量的至少一种选择性雌激素受体调节剂的第二容器。
在另一实施方案中，本发明提供一种药用组合物，所述药用组合物包含a)一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体；b)治疗有效量的至少一种雌激素；和c)治疗有效量的至少一种选择性雌激素受体调节剂。
如本文所用的，“结合”其它化合物给予患者的化合物的给予与所述其它化合物的给予足够接近，即使两种化合物给予的时间并不接近，但也使得患者同时获得两种化合物的生理学效应。当作为联合疗法的一部分给予化合物时，将它们相互结合给予。
雌激素替代疗法常用于绝经后妇女，以预防和治疗由绝经所致的疾病，即骨质疏松、热潮红、冠心病(Cummings 1991)，但却有与长期雌激素给予相关的某些不希望有的效应。特别是，已感觉到的由雌激素引起的子宫癌和/或乳癌危险的增加(Judd，Meldrum等1983；Colditz，Hankinson等1995)是这种疗法的主要缺点。本发明的作者已经发现，在雌激素给药中加入选择性雌激素受体调节剂(SERM)，抑制了这些不希望有的效应。
本发明提供一种治疗由激素替代疗法(HRT)诱发的乳房触痛或降低患所述乳房触痛危险的方法，因为所述SERM会引起乳腺上皮萎缩，而不是HRT引起的刺激，所以乳房触痛将被减轻或消除。
本发明也提供一种预防和治疗由激素替代疗法(HRT)诱发的阴道出血的方法。因为所述SERM将引起子宫内膜萎缩，所以不会发生阴道出血。
另一方面，单独的SERM对某些绝经症状如热潮红和出汗的有益效应很少或没有。本申请人认为，将雌激素加入绝经症状的SERM治疗中，减轻或甚至消除热潮红和出汗。重要的是注意到，热潮红和出汗是绝经的最先表现，而患者接受或不接受绝经治疗常常取决于热潮红和出汗减轻的成功与否。
如本文所用的，选择性雌激素受体调节剂(SERM)是这样的化合物，它们在乳腺组织中或者直接或者通过其活性代谢物作为雌激素受体拮抗剂(“抗雌激素”)起作用，还对骨组织和血清胆固醇水平提供雌激素或雌激素样效应(即通过降低血清胆固醇)。在体外或在人类或大鼠乳腺组织中作为雌激素受体拮抗剂非类固醇化合物(尤其是当所述化合物对人类乳癌细胞用作抗雌激素时)有可能作为SERM起作用。相反，类固醇抗雌激素往往不作为SERM起作用，因为它们往往不显示出对血清胆固醇的任何有益效应。我们已经测试和发现作为SERM起作用的非胆固醇抗雌激素包括EM-800、EM-652.HCl、雷洛昔芬、他莫昔芬、4-羟基-他莫昔芬、托瑞米芬、4-羟基-托瑞米芬、屈洛昔芬、LY 353 381、LY 335 563、GW-5638、Lasofoxifene、TSE 424和艾多昔芬，但不限于这些化合物。
但我们也发现，不是所有的SERM都以相同方式反应，可以将它们分为两个亚类“纯SERM”和“混合SERM”。因此，某些SERM如EM-800和EM-652.HCl在乳腺组织和子宫内膜组织中没有任何生理学或药理学浓度的雌激素活性，而在大鼠中具有降低血中胆固醇和降低血甘油三酯的效应。这些SERM可以被称为“纯SERM”。理想的SERM是EM-652.HCl类型的纯SERM，因为它在乳腺中有有效的纯抗雌激素活性。其它的SERM，如雷洛昔芬、他莫昔芬、屈洛昔芬、4-羟基-他莫昔芬(1-(4-二甲氨基乙氧基苯基)-1-(4-羟基苯基)-2-苯基-丁-1-烯)、托瑞米芬、4-羟基-托瑞米芬[(Z)-(2)-2-[4-(4-氯-1-(4-羟基苯基)-2-苯基-1-丁烯基)苯氧基]-N，N-二甲基乙胺)、LY 353 381、LY 335 563、GW-5638和艾多昔芬在乳腺和子宫内膜中具有某些雌激素活性。这种第二类SERM可以被称为“混合SERM”。这些“混合SERM”的不想要的雌激素活性可以如图6和图7中的乳癌体外试验以及图9中的乳癌体内试验所示，通过加入纯“SERM”来加以抑制。由于裸鼠中的人类乳癌异种移植物是最接近的可利用的人类乳癌模型，因此，我们已经比较了单独的和联合的EM-800和他莫昔芬对裸鼠体内ZR-75-1乳癌异种移植物生长的影响。
对于本文所述的所有组合，考虑了给予所述组合每个部分的单独化合物，除非另有陈述。因此，例如，给予SERM和雌激素是指给予两种不同的化合物，而不是指给予具有某些雌激素特性的SERM的单一化合物。
本申请人认为，非常重要的是，本发明的SERM在乳腺组织、子宫组织和子宫内膜组织中起纯抗雌激素的作用，因为SERM必须抵抗雌激素的可能增加这些组织中癌症危险的潜在副作用。特别是，本申请人认为，在2位具有绝对构型2S的本发明的苯并吡喃衍生物比其外消旋混合物更合适。因此，在US 6,060,503中，公开了用以治疗雌激素恶化的乳癌和子宫内膜癌的具有2S构型的旋光性苯并吡喃抗雌激素，并且这些化合物显示出比外消旋混合物显著更为有效(参见US6,060,503的

图1-5)。
2S构型的对映体在工业上难以作为纯状态获得，本申请人认为，5R对映体的污染最好低于10％、优选低于5％、更优选低于2％(重量)。
附图简述
图1显示了用单独的DHEA(10mg，经皮，每日一次)或EM-800(75μg，口服，每日一次)治疗或联合治疗9个月对大鼠体内血清甘油三酯(A)和胆固醇(B)水平的影响。数据以均数±SEM表示。**P＜0.01实验相对于相应的对照。
图2显示A)每日两次经皮给予增加剂量的DHEA(0.3mg、1.0mg或3.0mg)对补充雌酮的卵巢切除的(OVX)裸鼠体内ZR-75-1肿瘤平均大小的影响。仅接受溶媒的对照OVX小鼠用作另外的对照。将原始肿瘤大小作为100％。DHEA在0.02ml 50％乙醇-50％丙二醇的溶液中经皮(p.c)应用于背侧皮肤。B)用增加剂量的单独的DHEA或EM-800治疗或联合治疗9.5个月对补充雌酮的OVX裸鼠体内ZR-75-1肿瘤重量的影响。**，p＜0.01，经治疗的小鼠相对于补充雌酮的对照OVX小鼠。
图3显示了口服增加剂量的抗雌激素EM-800(15μg、50μg或100μg)(B)或经皮给予增加剂量的DHEA(0.3、1.0或3.0mg)联合EM-800(15μg)或单独的EM-800(A)9.5个月对补充雌酮的卵巢切除(OVX)裸鼠体内ZR-75-1肿瘤平均大小的影响。将原始肿瘤大小作为100％。仅接受溶媒的对照OVX小鼠用作另外的对照。雌酮以0.5μg的剂量每日皮下给予一次，而DHEA溶于50％乙醇-50％丙二醇中，每日两次以0.02ml的体积应用于背侧皮肤区。也与仅接受溶媒的OVX动物进行比较。
图4显示了用抗雌激素EM-800以0.25mg/Kg体重和2.5mg/Kg体重的剂量治疗65天(口服，每日一次)或用醋酸甲羟孕酮(MPA，1mgs.c.，每日两次)治疗65天或用EM-800(0.25mg/Kg体重)和MPA联合治疗65天对卵巢切除的大鼠体内E1(1.0μg，s.c.，每日两次)刺激的DMBA诱发性乳癌的生长的影响。肿瘤大小的改变以原始肿瘤大小的百分率表示。数据以均数±SEM表示。
图5显示了用给予的增加剂量(0.01、0.03、0.1、0.3和1mg/kg)的EM-800或雷洛昔芬治疗37周对卵巢切除的大鼠体内总血清胆固醇水平的影响。将带有17β-雌二醇(E2)植入物的无伤大鼠和卵巢切除大鼠进行比较；**p＜0.01，实验大鼠相对于OVX对照大鼠。
图6显示了增加浓度的EM-800、(Z)-4-OH-他莫昔芬、(Z)-4-OH-托瑞米芬和雷洛昔芬对人Ishikawa细胞中碱性磷酸酶活性的影响。在存在或缺乏1.0nM E2的情况下暴露于增加浓度的指定化合物5天后，测量碱性磷酸酶的活性。数据以4个孔的均数±SEM表示。当SEM与所用的符号重叠时，仅显示所述符号(Simard，Sanchez等，1997)。
图7显示了在人Ishikawa癌细胞中抗雌激素EM-800阻断(Z)-4-OH-他莫昔芬、(Z)-4-OH-托瑞米芬、屈洛昔芬和雷洛昔芬对碱性磷酸酶活性的刺激效应。在存在或缺乏30nM或100nM EM-800的情况下暴露于3nM或10nM指定化合物5天后，测量碱性磷酸酶活性。数据以8个孔的均数±SD表示，对照组除外，对照组的数据得自16个孔(Simard，Sanchez等，1997)。
图8显示了标准HRT(雌激素)和SERM(EM-652)对绝经参数影响的比较。将SERM加入标准HRT中，将抵抗雌激素的潜在副作用。
图9显示了他莫昔芬对人乳癌ZR-75-1异种移植物生长的刺激效应因同时给予EM-652.HCl而被完全阻断。EM-652.HCl本身根据纯抗雌激素活性，在缺乏他莫昔芬的情况下对肿瘤生长无影响。
图10显示了大鼠乳腺的切片。
A.未经治疗的动物。小叶(L)由几个小泡组成。插入.高放大倍数显示的小泡。
B.用EM-800(0.5mg/kg，bw/日)治疗12周的动物。小叶(L)的大小减小。插入.高放大倍数显示的萎缩小泡细胞。
图11显示了大鼠子宫内膜的切片。
A.未经治疗的动物。腔上皮(LE)的特征为柱状上皮细胞，而腺上皮(GE)呈立方形。基质含有几种细胞组分和胶原纤维。
B.在12周内用EM-800(0.5mg/kg，b w per day)治疗的动物。腔上皮的高度显著减少。腺上皮细胞具有不染色的胞质，且无活性的迹象。基质由于基质的胞间组分减少而呈高度细胞性的。
图12显示了给同时用雌酮治疗的卵巢切除小鼠口服9天增加浓度的EM-652.HCl、lasofoxifene(游离碱；活性和无活性对映体)和雷洛昔芬对子宫重量的影响。*p＜0.05，**p＜0.01，相对于E1治疗的对照。
图13显示了给同时用雌酮治疗的卵巢切除小鼠口服9天增加浓度的EM-652.HCl、lasofoxifene(游离碱；活性和无活性对映体)和雷洛昔芬对阴道重量的影响。**p＜0.01，相对于E1治疗的对照。
图14显示了给卵巢切除小鼠口服9天1μg和10μg EM-652.HCl、lasofoxifene(游离碱；活性和无活性对映体)和雷洛昔芬对子宫重量的影响。**p＜0.01，相对于OVX对照。
图15显示了给卵巢切除小鼠口服9天1μg和10μg EM-652.HCl、lasofoxifene(游离碱；活性和无活性对映体)和雷洛昔芬对阴道重量的影响。**p＜0.01，相对于OVX对照。
图16显示了用E2、EM-652.HCl、E2+EM-652.HCl、DHEA、DHEA+EM-652.HCl和DHEA+EM-652.HCl+E2治疗26周对已确立骨质减少的OVX大鼠腰椎BMD的影响。对照组包括无伤的对照和OVX对照动物。
图17显示了用E2、EM-652.HCl、E2+EM-652.HCl、DHEA、DHEA+EM-652.HCl和DHEA+EM-652.HCl+E2治疗26周对已确立骨质减少的OVX大鼠股骨BMD的影响。对照组包括无伤的对照和OVX对照动物。
图18显示了用E2、EM-652.HCl、E2+EM-652.HCl、DHEA、DHEA+EM-652.HCl和DHEA+EM-652.HCl+E2治疗26周对已确立骨质减少的OVX大鼠总机体脂肪的影响。对照组包括无伤的对照和OVX对照动物。
图19A显示了抗雌激素对ZR-75-1肿瘤生长的影响。用7种抗雌激素治疗161天对卵巢切除裸鼠体内雌酮诱发的人ZR-75-1乳房肿瘤生长的影响。肿瘤大小以原始肿瘤面积的百分率表示(第1天＝100％)。数据以均数±SEM表示(n＝18-30个肿瘤/组)；##p＜0.01，相对于EM-652.HCl；**p＜0.01相对于OVX。在通过用含有1∶25比率的雌酮和胆固醇的皮下0.5cm硅橡胶植入物获得的雌酮刺激下，抗雌激素以50μg/小鼠的剂量每日口服一次。
图19B显示了抗雌激素对AR-75-1肿瘤生长的影响。用7种抗雌激素治疗161天对卵巢切除裸鼠体内人ZR-75-1乳房肿瘤生长的影响。肿瘤大小以原始肿瘤面积的百分率表示(第1天＝100％)。数据以均数±SEM表示(n＝18-30个肿瘤/组)；##p＜0.01，相对于EM-652.HCl；**p＜0.01相对于OVX。在无雌激素刺激下，抗雌激素以100μg/小鼠的剂量每日口服一次。
图19B显示了抗雌激素对ZR-75-1肿瘤生长的影响。用7种抗雌激素治疗161天对卵巢切除裸鼠体内人ZR-75-1乳房肿瘤生长的影响。肿瘤大小以原始肿瘤面积的百分率表示(第1天＝100％)。数据以均数±SEM表示(n＝18-30个肿瘤/组)；##p＜0.01，相对于EM-652.HCl；**p＜0.01相对于OVX。在无雌激素刺激下，抗雌激素以200μg/小鼠的剂量每日口服一次。
图20A显示了抗雌激素对反应类别的影响。给予7种抗雌激素161天对卵巢切除裸鼠体内人ZR-75-1乳房肿瘤反应类别的影响。完全消退确定了在治疗结束时检测不到的那些肿瘤；部分消退相当于其原始大小消退≥50％的肿瘤；稳定的反应是指消退＜50％或发展≤50％的肿瘤；而发展是指与其原始大小相比，肿瘤发展超过50％。在通过用含有1∶25比率的雌酮和胆固醇的皮下0.5cm硅橡胶植入物获得的雌酮刺激下，抗雌激素以50μg/小鼠的剂量每日口服一次。
图20B显示了抗雌激素对反应类别的影响。给予7种抗雌激素161天对卵巢切除裸鼠体内人ZR-75-1乳房肿瘤反应类别的影响。完全消退确定了在治疗结束时检测不到的那些肿瘤；部分消退相当于其原始大小消退≥50％的肿瘤；稳定的反应是指消退＜50％或发展≤50％的肿瘤；而发展是指与其原始大小相比，肿瘤发展超过50％。在无雌激素刺激下，抗雌激素以200μg/小鼠的剂量每日口服一次。
图20C显示了抗雌激素对反应类别的影响。给予7种抗雌激素161天对卵巢切除裸鼠体内人ZR-75-1乳房肿瘤反应类别的影响。完全消退确定了在治疗结束时检测不到的那些肿瘤；部分消退相当于其原始大小消退≥50％的肿瘤；稳定的反应是指消退＜50％或发展≤50％的肿瘤；而发展是指与其原始大小相比，肿瘤发展超过50％。在无雌激素刺激下，抗雌激素以200μg/小鼠的剂量每日口服一次。
图21显示了在每日口服补充17β-雌二醇(2mg/kg)的卵巢切除大鼠体内以0.01mg/kg至10mg/kg的增加的日剂量范围给予EM-652.HCl2周对子宫重量的影响。无伤的动物用作另外的对照。
图22显示了在每日口服补充17β-雌二醇(2mg/kg)的卵巢切除大鼠体内以0.01mg/kg至10mg/kg的增加的日剂量范围给予EM-652.HCl2周对子宫内膜上皮高度的影响。无伤的动物用作另外的对照。
图23.大鼠子宫的苏木精和曙红染色切片，显示了得自无伤对照(A)、OVX对照(B)、OVX+E2(2mg/kg)(C)和OVX+E2+EM-652.HCl(3mg/kg)治疗14天的大鼠的上皮衬细胞。雌二醇对子宫内膜上皮细胞的刺激效应因同时给予EM-652.HCl而被逆转。(放大倍数×700)。BM基底膜。
图24显示了在每日口服补充17β-雌二醇(2mg/kg)的卵巢切除大鼠体内以0.01mg/kg至10mg/kg的增加的日剂量范围给予EM-652.HCl2周对阴道重量的影响。无伤的动物用作另外的对照。
图25显示了在每日口服补充17β-雌二醇(2mg/kg)的卵巢切除大鼠体内以0.01mg/kg至10mg/kg的增加的日剂量范围给予EM-652.HCl2周对血清胆固醇的影响。无伤的动物用作另外的对照。
发明详述
在图9中可以看出，他莫昔芬对肿瘤生长的约100％刺激效应因用EM-652.HCl同时治疗而被完全阻断。EM-652.HCl根据其纯的抗雌激素活性，对裸鼠体内人乳癌ZR-75-1异种移植物的生长不会施加任何刺激效应(图9)。
我们已经测试了类固醇抗雌激素ICI 182,780，发现它不起SERM的作用。按照本发明的SERM甚至在本领域将其用作代替SERM的抗雌激素的情况下，也可以以本领域已知的相同剂量给予。
我们也注意到，SERM对血清胆固醇的有益效应和对骨的雌激素或雌激素样效应之间有相关性。SERM对高血压、胰岛素抵抗、糖尿病和肥胖(尤其是腹部肥胖)也有有益效应。虽然不希望受理论的束缚，但认为SERM中的许多最好具有1-2个碳原子连接的两个芳环，预期SERM借助所述分子中被雌激素受体最佳识别的上述部分而与雌激素受体相互作用。优选的SERM具有侧链，所述侧链可以选择性地在乳腺组织和通常的子宫组织中引起拮抗剂特性，而在其它组织中没有显著的拮抗剂特性。因此，所述SERM可能理想地在乳腺中起抗雌激素的作用，而在骨和血液(其中脂质和胆固醇的浓度受有利的影响)中意外和理想地起雌激素的作用(或提供雌激素样活性)。对胆固醇和脂质的有利效应转变为对动脉粥样硬化的有利效应，动脉粥样硬化已知受胆固醇和脂质水平不当的不利影响。
另一方面，骨质疏松、血胆固醇过多、血脂过多、认知和动脉粥样硬化对雌激素活性或雌激素样活性有利地反应。通过按照本发明将雌激素与SERM联合应用，在靶组织中提供所需效应，而在某些其它组织中无不希望有的效应。例如，雌激素和SERM的组合可以在骨(或对脂质或胆固醇)有有利的雌激素效应，而在乳腺和子宫中避免了不利的雌激素效应，因为所述SERM将充当雌激素拮抗剂，有效地阻断了雌激素在乳腺和子宫内膜中的效应，如图10和图11中可以看到的。
如图10中所表明的，虽然17β-雌二醇的循环水平从无伤动物的95.9±32.4pg/ml升至用每日口服0.5mg/kg EM-800达12周治疗的动物中的143.5±7.8pg/ml(50％升高)，但观察到乳腺显著萎缩。同样，在图11中，在接受EM-800(0.5mg/kg)的动物中观察到子宫内膜显著萎缩。在接受纯抗雌激素EM-800的这些无伤动物中，消除了雌激素在下丘脑-脑垂体水平的抑制效应，因此引起LH增加，然后继发引起卵巢的17β-雌二醇分泌增加。
在每日接受相同的0.5mg/kg剂量的EM-652的无伤大鼠中进行6个月的研究中，测量到抗雌激素EM-652的循环浓度为0.4ng/ml(URMA-05-011-94)。因为在接受每日20mg口服剂量的EM-800的妇女体内的EM-652平均血清浓度测量为7.3±0.77ng/ml，所以显然在绝经后妇女中给予雌激素替代疗法，不会影响EM-652的有效抑制效应及其预防乳癌和子宫内膜癌的能力。I期研究已经表明，EM-800和EM-652.HCl给出了几乎重叠的EM-652的血清水平。
通过本发明中使用的组合，也以协同方式减轻了不希望有的效应。对于本文讨论的所有疾病而言，在其它情况下可能由以替代剂量的雌激素所致的对乳腺组织的任何其它效应，都被所述SERM在乳腺组织中的抗雌激素效应有效地阻断，正如在图2和图3中所见的。从图10中可以得出同样的结论。
在优选实施方案中，加入性类固醇前体(脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄-5-烯-3β，17β-二醇、4-雄烯-3，17-二酮和其前药)或雄激素类药，以提供有益的雄激素效应，尤其是在降低患骨病危险或治疗骨病方面有益的雄激素效应。SERM和雌激素联合用于治疗骨质疏松，减少或甚至停止了骨的降解。而进一步加入雄激素或DHEA(和性类固醇的其它前体)允许重建受损伤的骨组织，但在血胆固醇过多、血脂过多、绝经症状、早老性痴呆、心血管疾病、乳癌、子宫癌和卵巢癌的治疗方面有其它有益效应的性类固醇前体，可以与SERM和雌激素组合协同作用，以更好地治疗上述疾病。这种协同效应是由于雄激素(或在外周组织中代谢为雄激素的性类固醇前体)和雌激素或SERM通过不同机制起作用的事实所致。
在某些实施方案中，加入孕酮以提供其它雄激素效应。孕酮可以以本领域已知的低剂量使用，而不会不利地影响所述雄激素受体以外的受体(例如糖皮质激素受体)。它们也相对无不想要的雄激素副作用(例如女性患者面部的毛)。
热潮红、心血管症状、早老性痴呆、认知功能的丧失和失眠肯定涉及位于中枢神经系统的雌激素受体。脑中低水平的雌激素可能至少部分解释这些病症。外源雌激素、尤其是雌二醇可能穿过脑屏障，并与所述雌激素受体结合，以恢复正常的雌激素作用。另一方面，如实施例9中所示，本发明的SERM、更优选EM-652.HCl类的SERM不能穿过脑屏障。因此，它们不能拮抗雌激素在脑中的正效应，但它们拮抗雌激素在乳腺、子宫和子宫内膜组织中的负效应，使得这一组合(SERM+雌激素)对于治疗上述病症或降低患上述病症危险而言特别有吸引力。联合雌激素和SERM的总体相加益处
妇女绝经时请教其医师的主要原因是发生热潮红，这是众所周知可由雌激素替代疗法消除的问题。因为引起热潮红的部位是中枢神经系统(CNS)，并且EM-652对于CNS的可及性非常差(数据已包括)，所以预期给予雌激素将控制热潮红，而不受所述SERM的干扰。另一方面，所述SERM将消除雌激素在其它部位的所有负效应，尤其是乳癌和子宫癌的危险。事实上，将EM-652加入雌激素，阻断了雌激素对乳腺和子宫的刺激效应，而在其它组织中，EM-652将发挥其自身的有益效应，例如对骨的有益效应，在骨中它部分逆转卵巢切除对骨盐密度的效应。
观察到EM-652对任何参数均无不利影响，而对于预防和治疗乳癌和子宫癌而言，它应该发挥显著的有益效应。
本发明数据表明，加入EM-652阻断了雌激素对乳腺和子宫的刺激效应(实施例4、8和10)，而在其它组织中，EM-652.HCl发挥其自身的有益效应。例如，在骨中(实施例5)，EM-652部分逆转了卵巢切除对骨盐密度的效应。这样一种效应已经导致用于治疗绝经后妇女骨质疏松的雷洛昔芬的商业化。事实上，已经发现雷洛昔芬预防大鼠体内BMD丧失的效力比EM-652效力低3-10倍(Martel等，J SteroidBiochem Molec Biol 200074，第45-56页)。虽然SERM对BMD的效应正如其它SERM如雷洛昔芬所示的，没有用雌激素获得的效应完全，但已经发现，在绝经后妇女中观察到的对骨折的效应与雌激素和SERM雷洛昔芬相同。因此，预期虽然EM-652或其它SERM不完全逆转BMD，但作为反应的最为重要的参数-对骨折的效应，与应用雌激素后观察到的一样重要。此外，正如所提出的，非常有可能BMD的测量不能提供一种化合物对骨生理学效应的完整的说明。
重要的方面是，虽然用SERM治疗对骨发挥有益效应，但主要用以阻断热潮红的它与雌激素的组合，使得可以降低与仅应用雌激素相关的乳癌和子宫癌的危险。
本文讨论的优选的SERM涉及(1)对本发明敏感的所有所述疾病；(2)治疗和预防应用；和(3)优选的药用组合物和试剂盒。
需要治疗特定疾病或降低发生特定疾病危险的患者是或者诊断有这种疾病的患者，或者是易患这种疾病的患者。
除非另有说明，本发明活性混合物的优选剂量(浓度和给药模式对于治疗和预防目的而言是相同的。本文所述每种活性组分的剂量是相同的，与待治疗的疾病(或待降低发病可能性的疾病)无关。
除非另有说明或从正文中明显看出，本文所述的剂量是指不受药用赋形剂、稀释剂、载体或其它组分影响的活性化合物的重量，虽然理想的是包括这类其它成分，正如本文的实施例中所示。通常用于制药业的任何剂型(胶囊、片剂、注射液等)适用于此，并且术语“赋形剂”、“稀释剂”或“载体”包括诸如在制药业中通常与这类剂型中与有效成分一起包括的这些非有效成分。例如，可以包括典型的胶囊、丸剂、肠衣片、固体或液体稀释剂或赋形剂、调味剂、防腐剂等。
用于本文所述任一疗法的所有有效成分均可以配制在药用组合物中，所述药用组合物也包括一种或多种所述其它有效成分。或者，可以将它们每种分别给予或在时间上足够同时给予，使得患者的血液水平最终提高，或者使得患者同时享受每种所述有效成分(或策略)的益处。在本发明的某些优选实施方案中，例如，将一种或多种有效成分配制在单一的药用组合物中。在本发明的其它实施方案中，提供包括至少两个单独容器的试剂盒，其中至少一个容器中的内容物与至少一个其它容器中的内容物在其中所含的有效成分方面完全或部分不同。
本文所述联合疗法也包括应用一种有效成分(组合)生产治疗所述疾病(或降低其危险)的药物，其中所述治疗或预防还包括按照本发明的组合的另一有效成分。例如，在一个实施方案中，本发明提供应用SERM制备与雌激素及其体内转变为雌激素的前药联合应用的药物，来治疗本发明的联合疗法认为对其有效的任一疾病(即骨质疏松、心血管疾病、血胆固醇过多、血脂过多、动脉粥样硬化、高血压、胰岛素抵抗、糖尿病、肥胖、热潮红、出汗、不规则月经、早老性痴呆、认知问题、与绝经有关的任何症状以及阴道干燥)。在另一实施方案中，本发明提供应用选自下列的雌激素以制备与SERM联合用于治疗任何所述疾病的药物17β-雌二醇、17β-雌二醇酯(即苯甲酸酯、环戊丙酸酯(cypionate)、dienanthate、戊酸酯等)、17α-雌二醇、17α-雌二醇酯、雌三醇、雌三醇酯、雌酮、雌酮酯、结合雌激素、马烯雌酮、马烯雌酮酯、17α-乙炔基雌二醇、17α-乙炔基雌二醇酯、己二烯雌酚、美雌醇、美雌醇酯、DES、植物雌激素、替勃龙、炔诺醇。
众所周知，雌激素刺激乳腺上皮细胞增生，细胞增生本身被认为通过积累可能导致瘤形成的随机遗传错误而增加了癌症的危险(Preston Martin等，Cancer.Res.507415-21，1990)。基于这一概念，已经引入了抗雌激素，以预防乳癌，目的是降低雌激素刺激的细胞分裂速率。
在雌性Sprague-Dawley大鼠10月龄后发现的卵巢周期性的丧失，伴随有血清雌激素和催乳激素水平的增加和血清雄激素和孕激素浓度的降低(Lu等，61st Annual Meeting of the Endocrine Society 106(摘要第134号)，1979；Tang等，Biol.Reprod.31399-413，1984；Russo等，Monographs on Pathology of Laboratory AnimalsIntegument andMammary Glands 252-266，1989；Sortino和Wise，Endocrinology 12490-96，1989；Cardy，Vet.Pathol.28139-145，1991)。在衰老中的雌性大鼠中自发发生的这些激素的改变，与多灶性增生和腺泡/小泡组织分泌活性增加以及乳腺腺管扩张和囊肿形成有关(Boorman等，433，1990；Cardy，Vet.Pathol.28139-145，1991)。应该提到，大鼠乳腺增生和瘤形成改变通常伴有雌激素和催乳激素水平的增加(Meites，J.Neural.Transm.4825-42，1980)。用本发明的一个SERM-EM-800治疗，诱发特征为小叶结构大小和数目减少的乳腺萎缩，并且无分泌活性的证据，显示出EM-800在乳腺中的有效抗雌激素活性(Luo等，Endocrinology 1384435-4444，1997)。
已知雌激素降低血清胆固醇水平，但增加血清甘油三酯水平或对血清甘油三酯水平无影响(Love等，Ann.Intern.Med.115860-864，1991；Walsh等，New Engl.J.Med.3251196-1204，1991；Barrett-ConnorAm.J.Med.95(增刊5A)40S-43S，1993；Russell等，Atherosclerosis 100113-122，1993；Black等，J.Clin.Invest.9363-69，1994；Dipippo等，Endocrinology 1361020-1033，1995；Ke等，Endocrinology 1362435-2441，1995)。图3显示，EM-800在大鼠中既有降低血中胆固醇的效应，又有降低血甘油三酯的效应，因此表现出其对血清脂质分布型的特有作用，其作用显然不同于其它SERM例如他莫昔芬(Bruning等，Br.J.Cancer 58497-499，1988；Love等，J.Natl.Cancer Inst.821327-1332，1990；Dipippo等，Endocrinology 1361020-1033，1995；Ke等，Endocrinology 1362435-2441，1995)、屈洛昔芬(Ke等，Endocrinology1362435-2441，1995)和雷洛昔芬(Black等，J.Clin.Invest.9363-69，1994)。因此，认为雌激素和EM-800的组合应该保持EM-800的降低血中胆固醇和降低血甘油三酯的效应，因此，提示这样一种组合可能对血清脂质发挥有益作用。
应该提到，血清脂质分布型在大鼠和人类之间显著不同。然而，由于雌激素受体介导的机制涉及雌激素以及抗雌激素的降低胆固醇的效应(Lundeen等，Endocrinology 1381552-1558，1997)，所述大鼠仍是用于研究雌激素和“抗雌激素”在人体中的降低胆固醇效应的有用模型。
我们也通过联合给予所述新的抗雌激素(EM-800)和性类固醇前体(DHEA)，研究了EM-800的抑制效应和DHEA对裸鼠体内人ZR-75-1乳癌异种移植物生长的抑制效应的潜在相互作用。图2和图3显示，DHEA本身在所用的剂量下，引起对肿瘤生长的50-80％抑制，而DHEA不影响用低剂量的所述抗雌激素达到的对肿瘤生长的近完全抑制。如图4所示，用EM-800和孕激素MPA在卵巢切除大鼠中观察到相似的对DMBA诱发性乳癌的E2刺激生长的影响。
骨盐密度(BMD)测量的基线是众所周知的。作为一个实例，BMD测量在用类固醇抗雌激素ICI 182780治疗的大鼠中显示出没有变化(Wakeling，Breast Cancer Res.Treat.251-9，1993)，而通过组织形态计量法观察到抑制性改变(Gallagher等，Endocrinology 1332787-2791，1993)。用他莫昔芬报道了相似的差异(Jordan等，Breast Cancer Res.Treat.1031-35，1987；Sibonga等，Breast Cancer Res.Treatm.4171-79，1996)。
应该指出，骨盐密度降低不是与骨强度降低相关的唯一的异常(Guidelines for preclinical and clinical evaluation of agents used in theprevention or treatment of postmenopausal osteoporosis，Division ofMetabolism and Endocrine Drug Products，FDA，1994年5月)。因此，重要的是分析由各种化合物和疗法诱发的骨代谢的生化参数的改变，以便获得对其作用的更好的了解。
特别重要的是指出，DHEA和EM-800的组合对骨代谢重要的生化参数发挥出乎意料的有益效应。事实上，单独的DHEA不影响骨吸收的标志-尿羟脯氨酸/肌酸酐之比。而且，对每日尿钙或磷的排泄，不能检测到DHEA的影响(Luo等，Endocrinology 1384435-4444，1997)。EM-800将尿羟脯氨酸/肌酸酐之比降低48％，而与DHEA相似，没有观测到EM-800对尿钙或磷排泄的影响。此外，EM-800对骨生成的标记-血清碱性磷酸酶活性没有影响，而DHEA将该参数的数值提高约75％(Luo等，Endocrinology 1384435-4444，1997)。
DHEA和EM-800组合出乎意料的效应之一涉及尿羟脯氨酸/肌酸酐之比，这是骨吸收的标记，当DHEA和EM-800组合时将其降低69％，这一数值与用单独的EM-800达到的48％抑制在统计学上有差异(p＜0.01)，而单独的DHEA不显示出任何的效应。因此，将DHEA加入EM-800将EM-800对骨重吸收的抑制效应提高50％。最为重要的是，将DHEA加入EM-800的另一出乎意料的效应是尿钙降低约84％(从23.17±1.55降至3.71±0.75μmol/24h/100g(p＜0.01)并且尿磷降低55％(从132.72±6.08降至59.06±4.76μmol/24h/100g(p＜0.01)(Luo等，Endocrinology 1384435-4444，1997)。
表1
此外，有意义的是注意到，用DHEA同时治疗不妨碍EM-800对血清胆固醇的有效抑制效应(Luo等，Endocrinology 1384435-4444，1997)。
虽然雷洛昔芬和相似化合物防止骨丢失并降低血清胆固醇(同雌激素一样)，但应该提到，当比较雷洛昔芬与Premarin对BMD的效应时，雷洛昔芬对BMD的效应的效力低于Premarin的效应(Minutes of theEndocrinology and Metabolism Drugs Advisory Committee，FDA Thursday，Meeting #68，1997年11月20日)。
认为在妇女绝经时观察到的骨丢失与骨吸收速率增加有关，继发的骨生成增加不可完全补偿骨吸收。事实上，骨生成和骨吸收的参数在骨质疏松中增加，而骨吸收和骨生成都被雌激素替代疗法所抑制。因而，认为雌激素替代对骨生成的抑制效应是由骨吸收和骨生成之间偶联的机制所致，使得最初的雌激素诱发的骨吸收的减少，导致骨生成的减少(parfitt，Calcified Tissue International 36增刊1S37-S45，1984)。松质骨强度和随后的对骨折的抗性不仅仅取决于松质骨的总量，也取决于小梁微观结构，正如根据小梁的数目、大小和分布测定的。绝经后妇女卵巢功能的丧失伴随有小梁骨总体积的显著减少(Melsen等，Acta Pathologica & Microbiologica Scandinavia 8670-81，1978；Vakamatsou等，Calcified Tissue International 37594-597，1985)，主要与小梁数目的减少、程度降低以及宽度减少有关(Weinstein和Hutson，Bone 8137-142，1987)。
为了推进本发明的联合疗法方面，对于本文讨论的任何适应征而言，本发明均考虑了在单一组合物中包含所述SERM和所述雌激素用于同时给药的药用组合物。所述组合物可以适用于以任何传统方式给药，包括但不限于口服、皮下注射、肌内注射或经皮给药。在其它实施方案中，提供一种试剂盒，其中所述试剂盒包含在分开的容器中或在一个容器中的一种或多种SERM和雌激素。上述药用组合物和试剂盒当用于治疗或预防骨质疏松时，可以还包含一种二膦酸盐化合物。所述试剂盒可以包含用于口服的合适材料(例如片剂、胶囊、糖浆剂等)和用于经皮给药的合适材料(例如软膏、洗剂、凝胶剂、乳油、缓释贴剂等)。
申请人认为，给予雌激素、SERM和性类固醇前体，在骨质疏松发生、血胆固醇过多、血脂过多、动脉粥样硬化、高血压、胰岛素抵抗、糖尿病、肥胖、早老性痴呆以及在治疗热潮红和出汗和/或降低热潮红和出汗的发生率方面有功效。本发明的有效成分(无论是雌激素、SERM或前体还是其它的)可以以多种方式配制和给予。当按照本发明一起给予时，所述有效成分可以同时或分开给予。
用于经皮或经粘膜给药的有效成分最好是相对于所述药用组合物总重量的0.01％-20％(重量)，更优选为2％和10％之间。用于经皮给药的17β-雌二醇、雌酮、结合雌激素的浓度应该为0.01％-1％，DHEA或5-diol的浓度应该为至少7％。或者，可以将所述有效成分置于具有本领域已知结构的经皮贴剂中，所述结构例如为欧洲专利第0279982号中所述的结构。
当配制为软膏、洗剂、凝胶剂或乳油等时，将所述有效成分与同人皮肤或粘膜相容并且增强所述化合物经皮透过所述皮肤或粘膜的合适的载体混合。合适的载体是本领域已知的，包括但不限于Klucel HF和Glaxal基质。某些是市售的，例如Glaxal基质可得自Glaxal CanadaLimited Company。其它合适的载体可以在Koller和Buri，S.T.P.Pharma3(2)，115-124，1987中找到。所述载体最好是所述有效成分于周围温度下可以使用的有效成分浓度溶于其中的载体。所述载体应该具有足够的粘度，以保持所述抑制剂在所述药用组合物施用的皮肤或粘膜局部区域上，而不会流出或蒸发，其保持时间足以允许所述前体基本透过皮肤或粘膜的所述局部区域而进入血流中，在血流中引起所需要的临床效应。所述载体通常是几种组分(例如药学上可接受的溶剂和增稠剂)的混合物。有机溶剂和无机溶剂的混合物可以有助于亲水和亲脂的溶解性，例如水和醇例如乙醇。
优选的性类固醇前体是脱氢表雄酮(DHEA)(可得自Diosynth Inc.，Chicago，Illinois，USA)。
所述载体也可以包括在化妆品和医药领域众所周知、并且通常用于软膏和洗剂中的各种添加剂。例如可以存在日用香料(fragrance)、抗氧化剂、香料、胶凝剂、增稠剂例如羧甲基纤维素、表面活性剂、稳定剂、润肤剂、着色剂和其它类似的药剂。当用于治疗系统性疾病时，应用于皮肤的部位应该改变，以便避免有效成分的局部浓度过高和可能的所述有效成分对皮肤的过度刺激。
按照本发明的治疗适用于不确定的情况。所述雌激素化合物、SERM化合物和/或所述性类固醇前体和/或二膦酸盐也可以经口途径给予，并且可以与常规的药用赋形剂例如喷干乳糖、微晶纤维素和硬脂酸镁一起配制为片剂或胶囊，以用于口服。
所述活性物质可以通过与固体粉状载体物质(例如柠檬酸钠、碳酸钙或磷酸二钙)和粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮、明胶或纤维素衍生物)、可能也加入润滑剂(例如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、“Carbowax”或聚乙二醇)混合，制成片剂或锭剂核心。当然，在口服形式的情况下，可以加入味道改进物质。
作为其它形式，人们可以使用插入式胶囊(plug capsule)，例如硬明胶插入式胶囊以及包含软化剂或增塑剂(例如甘油)的封闭式软明胶胶囊。插入式胶囊含有优选为颗粒形式的所述活性物质，例如为与填料例如乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉如马铃薯淀粉或支链淀粉、纤维素衍生物或高度分散的硅酸的混合物。在软明胶胶囊中，所述活性物质优选溶于或悬浮于合适的液体例如植物油或液态聚乙二醇中。
所述洗剂、软膏、凝胶剂或乳油应该充分擦入皮肤中，使得不会过分清楚可见，并且皮肤的该区域不应该洗，直至大部分经皮透入至少4小时，更优选至少6小时。
经皮贴剂可以用来按照已知的技术来传递前体。通常应用长得多的时间，例如1-4天，但通常使有效成分与较小的表面积接触，使得缓慢而恒定的传递有效成分。
已经开发并且正在使用的许多经皮给药系统适合于传递本发明的有效成分。释放速率通常通过基质扩散或所述有效成分通过控制膜来控制。
经皮装置的机械方面是本领域众所周知的，例如在美国专利5,162,037、5,154,922、5,135,480、4,666,441、4,624,665、3,742,951、3,797,444、4,568,343、5,064,654、5,071,644、5,071,657中有解释，上述专利的公开内容通过引用结合到本文中。在欧洲专利0279982和英国专利申请2185187中提供了另外的背景。
所述装置可以是本领域已知的一般类型的任一种，包括粘胶骨架型和贮库型经皮给药装置。所述装置可以包括掺入纤维、吸收所述有效成分和/或载体的含药物骨架。在贮库型装置中，所述贮库可以通过所述载体和所述有效成分不可透过的聚合物膜来限定。
在经皮装置中，所述装置本身保持将有效成分与所需的局部皮肤表面接触。在这种装置中，对于有效成分的载体的粘度的关注不如乳油或凝胶剂。经皮装置的溶剂体系可以包括例如油酸、直链醇乳酸酯和一缩二丙二醇，或包括本领域已知的其它溶剂体系。所述有效成分可以溶于或悬浮于所述载体中。
就贴附于皮肤而言，经皮贴剂可以固定在中间有穿孔的外科胶带上。所述胶带最好被一个释放衬垫覆盖，以在使用之前保护它。适用于释放的典型材料包括聚乙烯和聚乙烯涂布纸、最好涂有硅氧烷以便于除去。为了应用所述装置，简单地将所述释放衬垫剥去，将粘胶贴到患者的皮肤上。在美国专利5,135,480(其公开内容通过引用结合到本文中)中，Bannon等描述了一种具有非粘胶装置、用于保证所述装置接触皮肤的替代装置。
唯一必不可少的是，SERM、雌激素和最后的性类固醇前体给予的方式和剂量，要足以使得每种的血清浓度达到所需水平。按照本发明的联合疗法，所述SERM的浓度维持在所需的参数内，同时雌激素的浓度维持在所需参数内。
当使用雌二醇时，血清雌二醇浓度通常应该维持在每升50纳克和300纳克之间，优选在每升100纳克和200纳克之间，最优选在每升150纳克和175纳克之间。当使用另一种雌激素时，为了顾及相对于雌二醇的雌激素活性的差异以及为了达到正常的绝经前(per-menopausal)雌激素水平，血清浓度可以按已知方式改变。例如，如果使用美雌醇，则需要较低的浓度。也可以根据绝经症状的消失，评估合适的血清雌激素水平。所述联合疗法的第二种化合物(例如EM-652.HCl)的血清浓度通常维持在每升1微克和15微克之间，或在某些实施方案中，为维持在每升2微克和10微克之间，或每升5微克和10微克之间。
所述雌激素最好是雌二醇，但可以是硫酸雌酮钠或起雌激素受体激动剂作用的任何其它化合物。当分开给予时，可以使用市售的雌激素增补剂，例如可得自Ayerst(St-Laurent，Québec，Canada)的“PREMARIN”。一种优选的性类固醇前体是DHEA，虽然DHEA-S和以下讨论的类似物由于以下所述的原因也是特别有效的。对于典型的患者，当口服时，达到所需血清浓度的雌激素的合适剂量在每天每50kg体重0.3毫克和2.5毫克PREMARIN之间。在本发明的某些实施方案中，所述雌激素可以是在贴剂中经皮给予的17β-雌二醇，可得自CIBA，名称为“ESTRADERM”，其中日剂量在每天每50kg体重0.05毫克和0.2毫克之间。可得自Squibb、商品名为“DELESTOGEN”的戊酸17β-雌二醇通过注射给予。
其它优选的本发明雌激素药品是含有17β-雌二醇的贴剂，可得自Berlex Canada，商品名为CLIMARA，或可得自Novartis Pharma，商品名为VIVELLE；含有17β-雌二醇的阴道装置，可得自Pharmacia &Upjohn，商品名为ESTRING；含有17β-雌二醇的凝胶剂，可得自Schering，商品名为ESTROGEL；含有己二烯雌酚的乳油，可得自JANSSEN-ORTHO，商品名为ORTHO DINESTROL。
在某些实施方案中，口服给予所述优选的雌激素。例如微粉化17β-雌二醇，可得自Roberts，商品名为ESTRACE；乙炔基雌二醇，可得自Schering Canada，商品名为ESTINYL；硫酸雌酮(estropipate)，可得自PHARMACIA UPJOHN，商品名为OGEN。
在某些实施方案中，优选使用混合的雌激素/雄激素化合物来代替雌激素。所述化合物之一是替勃龙[(7α，(7α)-17-羟基-7-甲基-19-去甲孕-5(10)-烯-20-炔-3-酮(-19-norpregn-5(10)-en-20-yn-3-one)；专利号U.S.3,340,279(1967)；U.S.3,475,465(1969)和J.de Visser等描述的内分泌学分布型，Arzneimittel-Forsch，34，1010，1984)，可得自ORGANON(荷兰)，商品名为LIVIAL。
也优选含有雌激素和孕酮或雄激素的混合物的药品。所述药物可得自Novartis Pharma，商品名为ESTRACOM；得自Sabex，商品名为CLIMACTERON。
本发明的经皮或经粘膜给药系统也可以用作预防和/或治疗骨质疏松或其它疾病的新型的改进给药系统。
可以使用任何雌激素，所述雌激素按照生产商的建议，根据功效需要使用。合适的剂量是本领域已知的。具有雌激素活性或类似活性或对雌激素受体具有激动剂活性或类似活性的任何化合物或化合物的混合物可以按照本发明使用(植物雌激素、合成雌激素等)。
本发明的选择性雌激素受体调节剂的分子式具有以下特征a)由1-2个间插碳原子间隔的两个芳环，两个芳环或者是未取代的，或者被一个羟基或一个在体内转变为羟基的基团取代；和b)具有一个芳环和一个叔胺官能或其盐的侧链。
一种优选的本发明SERM是PCT/CA96/00097(WO 96/26201)中报道的EM-800。EM-800的分子结构是
另一种优选的本发明SERM是EM-01538
EM-1538(也称为EM-652.HCl)是与EM-800相比为有效的抗雌激素EM-652的盐酸盐，EM-1538是一种更为简单、更易于合成的盐。它也容易分离、纯化、可结晶和显示出良好的固态稳定性。当给予或者EM-800或者EM-1538时，认为在体内产生相同的活性化合物。
其它优选的本发明SERM包括他莫昔芬((Z)-2-[4-(1，2-二苯基-1-丁烯基)苯氧基]-N，N-二甲基乙胺)(可得自Zeneca，UK)；托瑞米芬((Z)-2-[4-(4-氯-1，2-二苯基-1-丁烯基)苯氧基]-N，N-二甲基乙胺)(可得自Orion-Farmos Pharmaceuticla，Finland，或可得自Schering-Plough)；屈洛昔芬((E)-3-[1-[4-[2-(二甲氨基)乙氧基]苯基]-2-苯基-1-丁烯基]苯酚)和CP-336，156(Lasofoxifene)(顺式-1R[4’-吡咯烷基-乙氧基苯基]-2S-苯基-6-羟基-1，2，3，4-四氢化萘D-(-)-酒石酸盐)(Pfizer Inc.，USA)；雷洛昔芬([2-(4-羟基苯基)-6-羟基苯并[b]噻吩-3-基][4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-甲酮盐酸盐)(Eli Lilly and Co.，USA)、LY 335563(6-羟基-3-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯氧基]-2-(4-羟基苯基)苯并[b]噻吩盐酸盐)和LY353381(Arzoxifene，6-羟基-3-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯氧基]-2-(4-甲氧基苯基)苯并[b]噻吩盐酸盐)(Eli Lilly and Co.，USA)；艾多昔芬((E)-1-[2-[4-[1-(4-碘苯基)-2-苯基-1-丁烯基]苯氧基]乙基]吡咯烷)(SmithKline Beecham，USA)；Levormeloxifene(3，4-反式-2，2-二甲基-3-苯基-4-[4-(2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基]-7-甲氧基苯并二氢吡喃)(Novo Nordisk，A/S，Denmark)，它公开于Shalmi等WO 97/25034，WO97/25035，WO 97/25037，WO 97/25038；和Korsgaard等WO97/25036)；GW5638(由Willson等描述，Endocrinology，138(9)，3901-3911，1997)和吲哚衍生物(由Miller等描述，EP 0802183A1)；和TSE424，由Wyeth Ayers(USA)研制，公开于JP10036347(American homeproducts corporation)；和WO 97/32837中描述的非类固醇雌激素衍生物。也包括得自Taiho(日本)的Iproxifen(TAT 59；磷酸二氢(E)-4-[1-[4-[2-(二甲氨基)乙氧基]苯基]-2-[4-(1-甲基乙基)苯基]-1-丁烯基]苯酚)、得自Orion(芬兰)的FC 1271((Z)-2-[4-(4-氯-1，2-二苯基-1-丁烯基)苯氧基]乙醇)、得自Hoechst Marion Roussel的HMR 3339和HMR3656、得自德国Schering AG的SH 646、得自Wyeth Ayerst(USA)的ERA 923、得自Eli Lilly(USA)的LY 335124和LY 326315。
可以使用根据功效需要使用的任何SERM，按照生产商的建议使用。合适的剂量是本领域已知的。可以按照本发明使用任何其它的市售非类固醇抗雌激素。可以使用具有类似SERM活性的任何化合物(例如雷洛昔芬)。
按照本发明给予的SERM最好以下述剂量范围使用对于平均体重的人而言，当口服时，优选为0.01-10mg/kg体重/天(优选0.05-1.0mg/kg)、每天5mg，尤其是每天10mg，分为两个等分剂量；对于平均体重的人而言，当胃肠外给予(即肌内、皮下或经皮给药)时，优选为0.003-3.0mg/kg体重/天(优选0.015-0.3mg/ml)、每天1.5mg，尤其是每天3.0mg，分为两个等分剂量。最好是如下所述将所述SERM与药学上可接受的稀释剂或载体一起给予。
在用于治疗骨质疏松的联合疗法中作为有效成分给予的本发明的优选二膦酸盐包括阿仑膦酸盐[(4-氨基-1-羟基亚丁基)二膦酸二钠盐水合物，可得自Merck Shape and Dohme，商品名为Fosamax；依替膦酸盐[(1-羟基亚乙基)二膦酸，2，2’-亚氨基二乙醇]，可得自Procter andGamble，商品名为Didrocal和Didronel；氯膦酸[(二氯亚甲基)二膦酸二钠盐]，可得自Rhne-Poulenc Rorer，商品名为Bonefos，或可得自Boehringer Mannheim，商品名为Ostac；和帕米膦酸盐(3-氨基-1-羟基亚丙基)二膦酸二钠盐)，可得自Geigy，商品名为Aredia。利塞膦酸盐(1-羟基-2-(3-吡啶基)亚乙基二膦酸一钠盐)正在临床研制中。可以按照本发明使用任何其它的市售二膦酸盐，所有均按生产商建议的剂量使用。同样，可以以现有技术建议的剂量使用性类固醇前体，其剂量优选将循环水平恢复20-30岁健康男性水平或绝经前成年妇女的水平。
关于本文建议的所有剂量，主治医师应该监测各个患者的反应并据此调节剂量。
实施例
实施例1
在乳腺中，雄激素由前体类固醇脱氢表雄酮(DHEA)生成。临床证据表明，雄激素对乳癌有抑制效应。另一方面，雌激素刺激乳癌的发生和生长。我们研究了单独DHEA或与新近描述的纯抗雌激素EM-800联合的DHEA对卵巢切除裸鼠中由人乳癌细胞系ZR-75-1形成的肿瘤异种移植物生长的影响。
小鼠在卵巢切除后立即每日接受皮下注射的0.5μg雌酮(一种雌激素类激素)。每日口服1次EM-800(15、50或100μg)。DHEA或者单独或者结合15μg每日口服剂量的EM-800每日两次应用(总剂量0.3、1.0或3.0mg)于背侧皮肤上。定期评价相对于第一天测量结果的对所述治疗反应的肿瘤大小的变化。实验结束时，解剖肿瘤并将其称重。
与没有接受雌酮的小鼠相比，在仅接受雌酮的卵巢切除小鼠中观察到9.5个月内肿瘤大小增加9.4倍。在补充雌酮的卵巢切除小鼠中给予15、50或100μg EM-800，导致对肿瘤大小的抑制分别为88％、93％和94％。另一方面，0.3、1.0或3.0mg剂量的DHEA将终末肿瘤重量分别抑制67％、82％和85％。用每日15μg口服剂量的EM-800并且给予或不给予不同剂量的经皮DHEA，获得相当的对肿瘤大小的抑制作用。
DHEA和EM-800独立地抑制雌酮刺激的ZR-75-1小鼠异种移植肿瘤在裸鼠体内的生长。给予所述特定剂量的DHEA不改变EM-800的抑制效应。材料和方法ZR-75-1细胞
ZR-75-1人乳癌细胞得自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)，常规按照已描述的方法(Poulin和Labrie，Cancer Res.464933-4937，1986；Poulin等，Breast Cancer Res.Treat.12213-225，1988)，在95％空气/5％CO2的潮湿环境中、于37℃在补充2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100IU青霉素/ml、100μg链霉素/ml和10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中作为单层培养。用0.05％胰蛋白酶0.02％EDTA(w/v)处理之后，将细胞每周传代。用于该报道中所述实验的细胞培养物得自细胞系ZR-75-1的第93代。动物
雌性纯合Harlan Sprague-Dawley(nu/nu)无胸腺小鼠(28-42日龄)得自HSD(Indianapolis，Indiana，USA)。小鼠关养在空气层流罩超净台中具有空气过滤罩的乙烯笼子中，并且在限制病原体的条件下维持。笼子、褥草和食物在使用之前进行高压灭菌。将水高压灭菌，酸化至pH2.8，任意供应。细胞接种
将小鼠两侧卵巢切除(OVX)，一周后在麻醉条件下，通过腹膜内注射0.25ml/只动物的三溴乙醇(戊醇0.8g/100ml 0.9％NaCl；和三溴乙醇2g/100ml 0.9％NaCl)实现肿瘤细胞的接种。在用0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA(w/v)处理单层后，收获对数生长期的1.5×106 ZR-75-1细胞，将所述细胞悬浮于0.1ml含有25％Matrigel的培养基中，用1英寸长的20号针头，如先前描述的方法(Dauvois等，Cancer Res.513131-3135，1991)，皮下接种到动物的两侧胁腹。为了促进肿瘤的生长，每只动物每日接受皮下注射由0.9％NaCl 5％乙醇1％明胶组成的溶媒中的10μg雌二醇(E2)，注射5周。出现触知的ZR-75-1肿瘤后，用测径规测量肿瘤的直径，选择肿瘤直径在0.2cm和0.7cm之间的小鼠进行该项研究。激素治疗
除对照OVX组动物外，所有动物每日接受皮下注射0.2ml 0.9％NaCl 5％乙醇1％明胶中的0.5μg雌酮(E1)。在指定组中，每日两次经皮给予0.3、1.0或3.0mg/只动物DHEA，将0.02ml体积的DHEA应用于肿瘤生长区之外的背侧皮肤区。将DHEA溶于50％乙醇50％丙二醇中。如先前所描述(Gauthier等，J.Med.Chem.402117-2122，1997)，在Laboratory of Molecular Endocrinology of the CHUL Research Center的医药化学部，合成EM-800，即((+)-7-新戊酰氧基-3-(4’-新戊酰氧基苯基)-4-甲基-2-(4”-(2’”-哌啶子基乙氧基)苯基)-2H-苯并吡喃)。将EM-800溶于4％(v/v)乙醇4％(v/v)聚乙二醇(PEG)600 1％(w/v)明胶0.9％(w/v)NaCl中。指定组的动物接受口服日剂量为15μg、50μg或100μg单独的EM-800或联合DHEA，而OVX组的动物仅接受溶媒(0.2ml 4％乙醇4％PEG 600 1％明胶0.9％NaCl)。每周一次用Vernier测径规测量肿瘤。记录以cm计的两个垂直的直径(L和W)，用以下公式计算肿瘤面积(cm2)L/2×W/2×π(Dauvois等，Cancer Res.513131-3135，1991)。将治疗的第一天测量的面积作为100％，以原始肿瘤面积的百分率表示肿瘤大小的变化。一般在皮下肿瘤的情况下，不可能精确地获得肿瘤的三维体积，因此，仅测量肿瘤的面积。治疗291天(或9.5个月)之后，处死所述动物。
按照已描述的方法(Dauvois等，Breast Cancer Res.Treat.14299-306，1989；Dauvois等，Eur.J.Cancer.Clin.Oncol.25891-897，1989；Labrie等，Breast Cancer Res.Treat.33237-244，1995)，评估反应的类别。简而言之，部分消退对应于消退等于或大于其原始大小的50％的肿瘤；稳定的反应是指消退小于原始大小的50％或发展小于其原始大小的50％的肿瘤，而完全消退是指在治疗结束时检测不到的肿瘤。发展是指与其原始大小相比发展超过50％的肿瘤。在实验结束时，通过断头术杀死所有动物。立即取出肿瘤、子宫和阴道，去除结缔组织和脂肪组织，并称重。统计学分析
用评估由DHEA、EM-800和时间所致效应的方差分析(ANOVA)，评价治疗对肿瘤大小影响的统计学显著性，在治疗开始和结束时在相同的动物中进行重复测定(组内受治疗者因素)。0时和治疗9.5个月后的重复度量构成动物的随机区组。因此，将时间作为区组内影响来分析，而将两种治疗作为区组间影响来评价。主要影响之间的所有相互作用都包括在该模型中。采用组内受治疗者作为误差项，分析治疗因素及其相互作用的显著性。将数据转化为log。构成所述ANOVA基础的假设，假设残差正态性和方差齐性。
对于最小显著差数，采用费歇耳检验进行后验配对比较(posterioripairwise comparison)。治疗对体重和器官重量的主要影响和相互作用采用标准两因素ANOVA与相互作用来分析。所有的ANOVA均采用SAS程序(SAS Institute，Cary，NC，USA)来进行。采用双尾检验，以5％的总体水平宣布差异的显著性。
对于有序聚类(ordered categorical)反应变量(完全反应、部分反应、稳定反应和肿瘤发展)，用Kruskall-Wallis检验分析聚类数据。在对治疗效应进行总体评价后，调节多重比较的p界值，分析表4所示结果的亚组(subset)。采用StatXact程序(Cytel，Cambridge，MA，USA)，计算p精确值。
数据以每组12-15只小鼠的均数±均数的标准误(SEM)表示。结果
如图2A所示，在用皮下给予的0.5μg日剂量雌酮治疗的卵巢切除裸鼠中，在291天(9.5个月)内人ZR-75-1肿瘤增加9.4倍，而在仅接受溶媒的对照OVX小鼠中，在该项研究期间肿瘤大小降至原始数值的36.9％。
用增加剂量的经皮DHEA治疗，导致对E1刺激的ZR-75-1肿瘤生长的进行性抑制。用每只动物0.3mg、1.0mg和3.0mg日剂量的DHEA治疗9.5个月时，分别达到50.4％、76.8％和80.0％的抑制(图2A)。与总肿瘤荷载减少一致，用DHEA治疗导致在实验结束时肿瘤平均重量的显著降低。事实上，平均肿瘤重量从对照补充E1的卵巢切除裸鼠的1.12±0.26g降至分别接受0.3mg、1.0mg和3.0mg日剂量DHEA的动物组中的0.37±0.12g(P＝.005)、0.20±0.06g(P＝.001)和0.17±0.06g(P＝.0009)(图2B)。
当与对照动物9.5个月时的肿瘤大小比较时，抗雌激素EM-800在15μg、50μg和100μg的日剂量下，对雌激素刺激的肿瘤大小分别抑制87.5％(P＜.0001)、93.5％(P＜.0001)和94.0％(P＝.0003)(图3A)。用三种EM-800剂量达到的肿瘤大小的减少，在相互之间没有显著性差异。如图2B所示，9.5个月的研究结束时肿瘤的重量从对照补充E1的OVX小鼠的1.12±0.26g降至分别用15μg、50μg和100μg日剂量的EM-800治疗动物的0.08±0.03g、0.03±0.01g和0.04±0.03g(在所有剂量下的EM-800相对于补充E1的OVX，P＜.0001)。
如上所述，15μg口服日剂量的抗雌激素EM-800引起在9.5个月时测量的对雌酮刺激的肿瘤生长的87.5％的抑制。加入所用的三种剂量的DHEA，对用15μg日剂量的抗雌激素EM-800达到的对肿瘤大小的已经显著的抑制作用没有显著影响(图5B)。因此，平均肿瘤重量从补充雌酮的对照小鼠中的1.12±0.26g分别显著降至在接受单独的或与0.3mg、1.0mg和3.0mg剂量的DHEA联合的15μg日剂量的所述抗雌激素的动物中的0.08±0.03g(P＜.0001)、0.11±0.04g(P＝.0002)、0.13±0.07g(P＝.0004)和0.08±0.05g(P＜.0001)(注意到在所述4组之间没有显著性差异)(图2B)。
也有兴趣地研究了用上述治疗达到的反应类别。因此，用增加剂量的DHEA的治疗虽然没有将进行性肿瘤的数目降至统计学显著性的水平(P＝.088)，但将进行性肿瘤的数目从补充雌酮的对照OVX动物中的87.5％降至用0.3mg、1.0mg和3.0mg日剂量的DHEA治疗动物中的50.0％、53.3％和66.7％(表4)。另一方面，完全反应从补充雌酮的小鼠中的0％提高至接受0.3mg、1.0mg和3.0mg日剂量的经皮DHEA的动物中的28.6％、26.7％和20.0％。另一方面，在补充E1的对照小鼠和接受上述剂量的DHEA的三组动物中，稳定反应分别测定为12.5％、21.4％、20.0％和13.3％。在对照卵巢切除小鼠中，完全反应率、部分反应率和稳定反应率分别测量为68.8％、6.2％和18.8％，而仅在6.2％的肿瘤中观察到发展(表2)。
在接受单独的(15μg)抗雌激素EM-800(P＝.0006)或与0.3mg、1.0mg和3.0mg的DHEA联合的所述动物中，分别在29.4％、33.3％、26.7％和35.3％的肿瘤中达到完全反应或肿瘤消失(表4)。另一方面，在上述组的动物中，分别在35.3％、44.4％、53.3％和17.6％的肿瘤中观察到发展。在用单独或与DHEA联合的EM-800治疗的组之间，没有显著性差异。
对于根据肿瘤重量调节的体重，没有观察到DHEA或EM-800治疗的显著性效应。用雌酮治疗OVX小鼠，子宫重量从OVX对照小鼠的28±5mg增加至132±8mg(P＜.01)，而增加剂量的DHEA引起对雌酮刺激效应的进行性的但却相对小的抑制，所述抑制在所用的最高剂量DHEA下达到26％(P＝.0008)。在同一图中可以观察到，雌酮刺激的子宫重量从补充雌酮的对照小鼠中的132±8mg分别降至使用15μg、50μg或100μg口服日剂量的EM-800的49±3mg、36±2mg和32±1mg(在所有剂量下，相对于对照，P＜.0001)(总体上P＜.0001)。与0.3mg、1.0mg和3.0mg日剂量的DHEA联合的15微克(15μg)EM-800，测量到子宫重量分别为49±3mg、59±5mg和69±3mg。
另一方面，用雌酮治疗，将阴道重量从OVX动物的14±2mg增加至31±2mg(P＜.01)，而加入DHEA没有显著性效应。在用15μg、50μg或100μg日剂量的EM-800治疗后，阴道重量则分别降低23±1mg、15±1mg和11±1mg(在所有剂量下，相对于对照而言，总体p和配对P＜.0001)。将0.3mg、1.0mg和3.0mg剂量的DHEA与EM-800联合，阴道重量分别测量为22±1mg、25±2mg和23±1mg(相对于15μg EM-800，所有的组均为N.S.)。应该提到，在所用的最高剂量即100μg日剂量下，EM-800将补充雌酮的OVX动物中的子宫重量降至不是与OVX对照有差异的数值，而将阴道重量降低至在OVX对照中所测量数值以下(P＜.05)。DHEA可能由于其雄激素效应，部分抵消EM-800对子宫重量和阴道重量的影响。表2.经皮给予DHEA或口服单独的或联合的EM-800达9.5个月对裸鼠中人ZR-75-1乳房肿瘤异种移植物反应(完全、部分、稳定和发展)的影响。E1＝雌酮；DHEA＝脱氢表雄酮；OVX＝卵巢切除的
实施例2
雄烯-3β，17β-二醇(5-diol)具有固有的雌激素活性。另外，作为前体性类固醇，它在外周颅内组织中可以转化为活性雄激素和/或其它雌激素。为了评价5-diol对骨质作用的雄激素组分和雌激素组分的相对重要性，将21周龄大鼠卵巢切除，用每日经皮1次单独的2、5或12.5mg 5-diol或与抗雄激素氟他胺(FLU，10mg，s.c，每日一次)和/或抗雌激素EM-800(100μg，s.c.，每日一次)联合的2、5或12.5mg 5-diol治疗12个月。治疗11个月后，测量骨盐密度(BMD)。卵巢切除(OVX)导致股骨BMD降低12.8％(p＜0.01)，而用最高剂量的5-diol治疗，在OVX后11个月期间恢复34.3％的损失的股骨BMD(p＜0.01)。与单独的5-diol的效应相比，同时给予FLU完全防止了5-diol对股骨BMD的刺激效应，而加入EM-800导致附加的28.4％的刺激。同时给予5-diol、FLU和EM-800，仅显示出EM-800(27％)的效应，因为5-diol的效应被FLU完全阻断。对腰椎BMD获得相当的结果，虽然接受12.5mg单独的5-diol、12.5mg 5-diol+EM-800或5-diol+FLU+EM-800的OVX大鼠中，腰椎BMD恢复至与无伤动物无显著性差异的数值。组织形态计量分析表明，5-diol对骨体积、小梁数目的刺激效应和对近端胫骨干骺端区的继发松质骨的小梁分离的抑制效应，被FLU消除，但被EM-800进一步增强。在用5-diol治疗后获得的血清碱性磷酸酶活性的显著刺激被同时给予FLU逆转57％(p＜0.01，相对于12.5mg单独的5-diol)。用5-diol治疗对尿钙与肌酸酐之比没有统计学显著性抑制效应。最高剂量的5-diol引起血清胆固醇显著降低23％(p＜0.01)，而加入EM-800将血清胆固醇降低62％(p＜0.01)。本发明的数据清楚地显示出5-diol对骨生成的刺激效应，并且提示，虽然5-diol是一种弱雌激素，但它对骨生成的刺激效应主要由雄激素效应介导。此外，EM-800和5-diol对骨质的相加刺激效应证明了抗雌激素EM-800在大鼠中节约骨(bone-sparing)的效应。5-diol和EM-800两者降低胆固醇的活性可能在心血管疾病预防方面有有趣的效用。
实施例3
本发明优选化合物的合成实施例(S)-(+)-7-羟基-3-(4’-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-(2’”-哌啶子基乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃盐酸盐EM-01538(EM-652，HCl)的合成
方案1
步骤ABF3·Et2O，甲苯；100℃，1小时。
步骤C3，4-二氢吡喃，对甲苯磺酸一水合物，乙酸乙酯；25℃氮气下，16小时，然后在异丙醇中结晶。
步骤D、E和F
(1)哌啶，甲苯，Dean & Stark仪器，氮气下回流；(2)1，8-二氮杂二环[5，4，0]十一-7-烯、DMF，回流3小时；
(3)CH3MgCl、THF，-20至0℃，然后室温24小时；
步骤G、H(1S)-(+)-10-樟脑磺酸，丙酮，水，甲苯，室温，48小时。
步骤HH95％乙醇，70℃，然后室温3天。
步骤HHR母液和步骤HH洗涤液的再循环
(S)-10-樟脑磺酸，回流；36小时，然后室温16小时。
步骤I
(1)DMF水溶液，Na2CO3，乙酸乙酯；
(2)乙醇，稀盐酸；
(3)水。
2-四氢吡喃氧基-4-羟基-2’-(4”-四氢吡喃氧基苯基)苯乙酮(4)的合成。将3，4-二氢吡喃(218ml，3.39mole)和乙酸乙酯(520ml)中的2，4-二羟基-2’-(4”-羟基苯基)苯乙酮3(97.6g，0.4mole)(可得自ChemsynScience Laboratories，Lenexa，Kansas)的悬浮液用对甲苯磺酸一水合物(0.03g，0.158mmole)于约25℃处理。将反应混合物在氮气、无外部加热下搅拌约16小时。然后用碳酸氢钠(1g)和氯化钠(5g)的水(100ml)溶液洗涤混合物。分离各相，有机相用盐水(20ml)洗涤。每次的洗涤液用50ml乙酸乙酯反萃取。合并所有的有机相，并通过硫酸钠过滤。
在大气压下经蒸馏除去溶剂(约600ml)，并加入异丙醇(250ml)。在大气压下蒸馏出额外的溶剂(约300ml)，加入异丙醇(250ml)。在大气压下蒸馏出额外的溶剂(约275ml)，加入异丙醇(250ml)。约12小时后，将溶液于约25℃在搅拌下冷却，滤出结晶固体，用异丙醇洗涤并干燥(116.5g，70％)。
4-羟基-4-甲基-2-(4’-[2”-哌啶子基]乙氧基)苯基-3-(4’”-四氢吡喃氧基)苯基-7-四氢吡喃氧基-苯并二氢吡喃(10)的合成。用Dean &Stark装置，将2-四氢吡喃氧基-4-羟基-2’-(4”-四氢吡喃氧基苯基)苯乙酮4(1kg，2.42mole)、4-[2-(1-哌啶子基)乙氧基]苯甲醛5(594g，2.55mole)(可得自Chemsyn Science Laboratories，Lenexa，Kansas)和哌啶(82.4g，0.97mole)(可得自Aldrich Chemical Company Inc.，Milwaukee，Wis)在甲苯(8L)中的溶液在氮气下回流，直至收集到一个相当量的水(44ml)。
通过在大气压下蒸馏，除去溶液中的甲苯(6.5L)。加入二甲基甲酰胺(6.5L)和1，8-二氮杂二环[5，4，0]十一-7-烯(110.5g，0.726mole)。将溶液于室温搅拌约8小时，以将查耳酮8异构化为苯并二氢吡喃-4-酮9，然后将其加入到水和冰(8L)和甲苯(4L)的混合物中。分离各相，甲苯层用水(5L)洗涤。合并的水性洗涤液用甲苯(3×4L)萃取。合并的甲苯萃取液最后用盐水(3×4L)洗涤，在大气压下浓缩至5.5L，然后冷却至-10℃。
继续外部冷却并在氮气下搅拌，加入3M氯化甲基镁的THF溶液(2.5L，7.5mole)(可得自Aldrich Chemical Company Inc.，Milwaukee，Wis.)，将温度维持低于0℃。加入所有的格氏试剂后，除去外部冷却，让混合物温至室温。将混合物在该温度下搅拌约24小时。
将混合物再次冷却至约-20℃，继续外部冷却和搅拌，缓慢加入饱和氯化铵溶液(200ml)，将温度维持低于20℃。将混合物搅拌2小时，然后加入饱和氯化铵溶液(2L)和甲苯(4L)，搅拌5分钟。分离各相，水层用甲苯(2×4L)萃取。合并的甲苯萃取液用稀盐酸洗涤，直至溶液变为均一，然后用盐水(3×4L)洗涤。甲苯溶液最终于大气压下浓缩至2L。该溶液直接用于下一步骤。
(2R，S)-7-羟基-3-(4’-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2’”-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1S)-10-樟脑磺酸盐(±12)的合成。向4-羟基-4-甲基-2-(4’-[2”-哌啶子基]乙氧基)苯基-3-(4’”-四氢吡喃氧基)苯基-7-四氢吡喃氧基苯并二氢吡喃(10)的甲苯溶液中加入丙酮(6L)、水(0.3L)和(S)-10-樟脑磺酸(561g，2.42mole)(可得自Aldrich Chemical CompanyInc.，Milwaukee，Wis.)。在氮气下将混合物搅拌48小时，此后过滤出固体(2R，S)-7-羟基-3-(4’-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2’”-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1S)-10-樟脑磺酸盐(12)，用丙酮洗涤并干燥(883g)。该物质不用进一步纯化，用于下一(HH)步骤。
(2R)-7-羟基-3-(4’-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2’”-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1S)-10-樟脑磺酸盐(13，(+)-EM-652(1S)-CSA盐)的合成。将(2R，S)-7-羟基-3-(4’-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2’”-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1S)-10-樟脑磺酸盐±12(759g)在95％乙醇中的悬浮液在搅拌下加热至约70℃，直至固体溶解。让溶液下搅拌下冷却至室温，然后用少量用(2R)-7-羟基-3-(4’-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2’”-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1S)-10-樟脑磺酸盐13的晶体接种。将该溶液于室温下搅拌总共约3天。过滤出晶体，用95％乙醇洗涤并干燥(291g，76％)。该产物的de为94.2％，纯度为98.8％。
(S)-(+)-7-羟基-3-(4’-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-(2’”-哌啶子基乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃盐酸盐EM-01538(EM-652，HCl)的合成。将化合物13(EM-652-(+)-CSA盐，500mg，0.726mmol)在二甲基甲酰胺(11μl，0.15mmol)中的悬浮液用0.5M碳酸钠水溶液(7.0ml，3.6mmol)处理，并搅拌15分钟。该悬浮液用乙酸乙酯(7.0ml)处理并在4小时内搅拌。然后，有机相用饱和碳酸钠水溶液(2×5ml)和盐水(1×5ml)洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。所得的粉红色泡沫(EM-652)在乙醇(2ml)中的溶液用2N盐酸(400μl，0.80mmol)处理，搅拌1小时，用蒸馏水(5ml)处理，在30分钟内搅拌。将所得的悬浮液过滤，用蒸馏水(5ml)洗涤，风干并在高度真空(65℃)下干燥，得到奶油状粉末(276mg，77％)细灰白色粉末；扫描量热法熔点开始于219℃，ΔH＝83J/g；[α]24D＝154°，在10mg/ml甲醇中；1H NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.6(broad，2H，H-4)，1.85(broad，4H，H.3″″and 5″″)，2.03(s，3H，CH3)，3.0 and 3.45(broad，4H，H-2″″and 6″″)，3.47(t，J＝4.9Hz，2H，H-3)，4.26(t，J＝4.9Hz，2H，H-2)，5.82(s，1H，H-2)，6.10(d，J＝2.3Hz，1H，H-8)，6.35(dd，J＝8.4，2.43Hz，1H，H-6)，6.70(d，J＝8.6Hz，2H，H-3′，and H-5＇)，6.83(d，J＝8.7Hz，2H，H-3″and H-5″)，7.01(d，J＝8.5Hz，2H，H-2′and H-6′)，7.12(d，J＝8.4Hz，1H，H-5)，7.24(d，J＝8.6Hz，2H，H-2″and H-6″)；13C RMN(CD3OD，75MHz)δppm 14.84，22.50，23.99，54.78，57.03，62.97，81.22，104.38，109.11，115.35，116.01，118.68，125.78，126.33，130.26，130.72，131.29，131.59，134.26，154.42，157.56，158.96，159.33.元素组成C，H，N，Cl理论值70.51，6.53，2.84，7.18％；实测值70.31，6.75，2.65，6.89％。
实施例4材料和方法动物
重18-20g的雌性BALB/c小鼠(BLAB/cAnNCrlBR)得自Charles-River，Inc.(St-Constant，Quebec，Canada)，在温度(23±1℃)和光(12h光照/天，于715开灯)受控的环境中，每只笼子关养5只。饲喂小鼠啮齿动物饲料，并让其自由获取自来水。在异氟烷麻醉下，通过两侧胁腹切开，对动物进行卵巢切除(OVX)，随机指定到各组，每组10只动物。10只小鼠保持无伤作为对照。治疗
在第一个实验(图12-15)中，从卵巢切除后2天开始，通过管饲法，每日一次以1、3或10μg/只动物的剂量口服试验化合物即EM-652.HCl、lasofoxifene(作为游离碱；活性和无活性对映体)和雷洛昔芬9天。在第二个实验(表3)中，从卵巢切除后2天开始，通过管饲法，每日一次以1、3、10或30μg/只动物的剂量口服TSE 424达9天。在两个实验中，为了评估抗雌激素活性，在卵巢切除后5天开始用雌酮治疗(E1，0.06μg，s.c.注射，每日两次)，并给予6天。将化合物溶于乙醇(4％终浓度)，并在0.4％甲基纤维素中给予。无伤对照组和OVX对照组的小鼠在所述9天期间仅接受溶媒(4％ETOH-0.4％甲基纤维素)。在卵巢切除后第11天早晨，通过在腹主动脉进行驱血法杀死动物。快速解剖出子宫和阴道，称重，并将其保持在10％缓冲的福尔马林中，以供进一步的组织学检查。结果实验1
如图12所示，以1μg、3μg和10μg的口服日剂量给予的EM-652.HCl分别引起对雌酮刺激的子宫重量的24％、48％和72％的抑制(对于所有剂量而言，相对于对照，p＜0.01)，而以相同剂量给予的雷洛昔芬分别引起该参数的6％(NS)、14％(p＜0.01)和43％(p＜0.01)的抑制。另一方面，lasofoxifene(作为游离碱)在所用的最低剂量下没有抑制效应，而它在3μg和10μg的日剂量下分别引起对雌酮刺激的子宫重量的25％(p＜0.01)和44％(p＜0.01)的抑制。lasofoxifene的无活性对映体在所用的任何剂量下都对该参数没有抑制效应。
上述化合物对阴道重量有相似的效应。每日口服EM-652.HCl在1μg、3μg和10μg剂量下分别引起对阴道重量的10％(NS)、25％和53％的抑制(对于两个最高剂量而言，p＜0.01)(图13)，而雷洛昔芬仅在最高剂量(10μg)下对该参数有显著24％(p＜0.01)的抑制效应。与雷洛昔芬类似，lasofoxifene(作为游离碱)仅在所用的最高剂量下引起显著的37％(p＜0.01)的抑制效应，而无活性对映体在所用的任何剂量下对阴道重量都无抑制效应。当将化合物以1μg和10μg的口服日剂量单独给予卵巢切除小鼠时(在无雌酮的情况下)，EM-652.HCl在所用的两种剂量下对子宫重量都无显著刺激效应，而用10μg lasofoxifene和雷洛昔芬治疗，分别引起对子宫重量的93％(p＜0.01)和85％(p＜0.01)的刺激(图14)，因此表明后两种化合物对该参数有雌激素效应。同样，EM-652.HCl对阴道重量无显著的刺激效应(图15)，而给予10μglasofoxifene和雷洛昔芬，分别引起对阴道重量的73％(p＜0.01)和56％(p＜0.01)的刺激。另一方面，lasofoxifene的无活性对映体对子宫重量和阴道重量均无刺激效应。实验2
如表3所示，以1μg、3μg、10μg或30μg的口服日剂量给予的TSE 424分别引起对雌酮刺激的子宫重量的12％(NS)、47％、74％和94％的抑制(对于三种最高剂量而言，相对于E1对照，p＜0.01)。另一方面，以3μg、10μg和30μg的剂量每日口服TSE 424，分别引起对阴道重量的16％(NS)、56％(p＜0.01)和93％(p＜0.01)的抑制。
当以3μg和30μg的口服日剂量将所述化合物单独给予(在无雌酮的情况下)卵巢切除小鼠时，TSE 424在所用的两种剂量下对子宫重量和阴道重量均无显著的刺激效应(表3)。表3将增加浓度的TSE 424口服9天给予同时用或不用雌酮治疗的卵巢切除小鼠对子宫重量和阴道重量的影响。**p＜0.01，相对于E1治疗的对照。
实施例55A对骨丢失、血清脂质和总体脂肪的预防效应。动物和治疗
使用在治疗开始时重约220-270g的10-12周龄雌性Sprague-Dawley大鼠(CrlCD(SD)Br)(Charles River Laboratory，St-Constant，Canada)。在实验开始之前，让动物适应环境条件(温度22±3℃；湿度50±20％；12h光照-12h黑暗周期，于0715开灯)至少1周。将动物单独关养，并让其自由获取自来水和粒状合格的啮齿动物饲料(Lab Diet 5002，Ralston Purina，St-Louis，MO)。在Canadian Council onAnimal Care(CCAC)和the Association for Assessment and Accreditationof Laboratory Animal Care(AAALAC)批准的动物设备中，按照实验动物护理和使用的CCAC指南，进行实验。
在第一个实验中，将154只大鼠随机分配在每组14只动物的如下11个组中1)无伤对照；2)OVX对照；3)OVX+E2(1mg/kg)；4)OVX+EM-652.HCl(2.5mg/kg)；5)OVX+E2+EM-652.HCl；6)OVX+脱氢表雄酮(DHEA；80mg/kg)；7)OVX+DHEA+EM-652.HCl；8)OVX+DHEA+E2；9)OVX+DHEA+E2+EM-652.HCl；10)OVX+GW5638；11)OVX+E2+GW 5638。该研究的第1天，在异氟烷麻醉下，将合适组别的动物的两侧卵巢切除(OVX)。将DHEA作为在50％乙醇-50％丙二醇中的溶液，局部应用于背侧皮肤，而另一种试验化合物作为在0.4％甲基纤维素中的悬浮液经管饲法口服。治疗始于该研究的第2天，在3个月期间每日进行一次。
在第二个实验中，将132只大鼠随机分配在每组14或15只动物的如下9个组中1)无伤对照；2)OVX对照；3)OVX+Premarin(0.25mg/kg)；4)OVX+EM-652.HCl(2.5mg/kg)；5)OVX+Premarin+EM-652.HCl；6)OVX+TSE 424(2.5mg/kg)；7)OVX+Premarin+TSE424；8)OVX+lasofoxifene(酒石酸盐；外消旋物；2.5mg/kg)；9)OVX+Premarin+lasofoxifene。该研究的第1天，在异氟烷麻醉下，将合适组别的动物的两侧卵巢切除(OVX)。试验化合物作为在0.4％甲基纤维素中的悬浮液经管饲法口服。治疗始于该研究的第2天，在26周内每日进行一次。在两个实验中，在同一时期内，不接受试验物质的动物仅用合适的溶媒治疗。骨盐密度的测量
治疗3个月(实验1)或26周(实验2)之后，用双能x射线吸收测量法(DEXA；QDR 4500A，Hologic，Waltham，MA)和区域高分辨率扫描软件，在异氟烷麻醉下对各只大鼠进行全身骨骼和腰椎扫描。测定腰椎(脊椎L2至L4)的骨盐密度(BMD)和总机体组成(脂肪百分率)。血清分析
治疗3个月(实验1)或26周(实验2)之后，从禁食过夜的动物在颈静脉收集血样(在异氟烷麻醉下)。加工样品以进行血清制备，将其于-80℃冷冻直至分析。用Boehringer Mannheim Diagnostic Hitachi 911分析仪(Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems)，测定血清胆固醇水平和碱性磷酸酶活性(ALP)。统计学分析
数据以均数±SEM表示。按照Duncan-Kramer的多重极差检验(multiple-range test)(Kramer CY；Biometrics 1956；12307-310)，测定统计学显著性。结果
如表4所示，在卵巢切除3个月之后，腰椎BMD在OVX对照动物中比在无伤动物中低10％(p＜0.01)。在所用的剂量下，单独给予雌二醇和EM-652.HCl，分别以98％(p＜0.01)和65％(p＜0.05)预防腰椎BMD损失，而用E2与EM-652.HCl联合治疗，61％预防OVX诱发的腰椎BMD降低(p＜0.05)。另一方面，虽然单独给予DHEA 43％预防腰椎BMD降低(p＜0.05)，用DHEA+E2+EM-652.HCl联合治疗，91％预防OVX诱发的腰椎BMD降低，并导致BMD数值与无伤对照没有差异。
在表5中，卵巢切除后26周时，与无伤对照相比，腰椎BMD降低18％(p＜0.01)。单独给予的Premarin、EM-652.HCl、TSE 424和lasofoxifene，分别以54％、62％、49％和61％预防腰椎BMD的降低(相对于OVX对照，所有化合物，p＜0.01)。将Premarin加入EM-652.HCl、TSE 424或lasofoxifene，导致腰椎BMD的数值与通过给予每种单独的SERM获得的数值无显著性差异(表5)。同样，将DHEA加入E2或EM-652.HCl，完全预防OVX诱发的腰椎BMD的降低(表4)。DHEA对BMD的正效应也得到其对骨生成和更新标记的血清碱性磷酸酶活性(ALP)的效应的支持。ALP活性从OVX对照动物中的73±6IU/L分别增加至DHEA、DHEA+EM-652.HCl、DHEA+E2以及DHEA+E2+EM-652.HCl治疗的动物中的224±18IU/L、290±27IU/L、123±8IU/L和261±20IU/L(所有的，p＜0.01)，因此，表明DHEA对骨生成有刺激效应(表6)。
除对骨丢失的预防效应外，给予EM-652.HCl、TSE 424、lasofoxifene、GW 5638、DHEA和E2，对总体脂肪百分率和血清脂质有某些有益效应。卵巢切除3个月后，总体脂肪增加22％(p＜0.05；表6)。给予EM-652.HCl完全预防OVX诱发的脂肪百分率的增加，而将DHEA和/或E2加入所述SERM中，导致脂肪百分率的数值低于在无伤对照动物中观察到的数值。卵巢切除26周后，在给予Premarin、EM-652.HCl、TSE 424或lasofoxifene后，雌激素缺乏诱发的40％的脂肪增加分别被74％、78％、75％和114％逆转，而将Premarin加入每种SERM中，完全预防OVX诱发的脂肪百分率的增加(表7)。
如表6所示，在卵巢切除后3个月，与无伤对照相比，在OVX对照大鼠中观察到血清胆固醇水平增加22％(p＜0.01)。事实上，血清胆固醇从无伤动物的2.01±0.11mmol/L增加至OVX对照中的2.46±0.08mmol/L。仅给予E2或DHEA，将血清胆固醇水平分别降至1.37±0.18mmol/L和1.59±0.10mmol/L，而仅给予EM-652.HCl或联合E2和/或DHEA给予EM-652.HCl，导致胆固醇水平显著低于(在0.65mmol/L和0.96mmol/L之间)无伤动物中发现的水平(2.01±0.11mmol/L)。同样，单独或联合E2或Premarin给予GW 5638、TSE 424和lasofoxifene，完全预防OVX诱发的血清胆固醇水平增加，并导致数值低于在无伤动物中发现的数值(表6和表7)。表4.在用单独给予或联合给予的雌二醇、EM-652.HCl、GW 5638或DHEA治疗卵巢切除雌性大鼠3个月后对预防骨丢失的影响*，p＜0.05；**，p＜0.01，实验大鼠相对于OVX对照大鼠。表5.在用单独给予或联合Premarin给予的Premarin、EM-652.HCl、TSE 424或lasofoxifene治疗卵巢切除雌性大鼠26周后对预防骨丢失的影响*，p＜0.01，实验大鼠相对于OVX对照大鼠。表6.在用单独给予或联合给予的雌二醇、EM-652.HCl、GW 5638或DHEA治疗卵巢切除雌性大鼠3个月后对总体脂肪百分率、血清胆固醇水平和碱性磷酸酶活性的影响*，p＜0.05；**，p＜0.01，实验大鼠相对于OVX对照大鼠。表7.在用单独给予或联合Premarin给予的Premarin、EM-652.HCl、TSE 424或lasofoxifene治疗卵巢切除雌性大鼠26周后对总体脂肪百分率、血清胆固醇水平和碱性磷酸酶活性的影响*，p＜0.05；**，p＜0.01，实验大鼠相对于OVX对照大鼠。5B对骨丢失和总体脂肪的治疗效应动物和治疗
在该实验中使用至多9月龄的雌性Sprague-Dawley大鼠(CrlCD(SD)Br)(Charles River Laboratory，St-Constant，Canada)。在卵巢切除之前，让动物适应环境条件(温度22±3℃；湿度50±20％；12h光照-12h黑暗周期，于0715开灯)至少1周。在异氟烷麻醉下，将动物两侧卵巢切除(OVX)。将20只动物保持无伤作为对照。将动物单独关养，并让其自由获取自来水和粒状合格的啮齿动物饲料(LabDiet 5002，Ralston Purina，St-Louis，MO)。在Canadian Council on AnimalCare(CCAC)和the Association for Assessment and Accreditation ofLaboratory Animal Care(AAALAC)批准的动物设备中，按照实验动物护理和使用的CCAC指南，进行实验。
在OVX后10周，将139只大鼠随机分配在每组17-20只动物的如下8个组中1)无伤对照；2)OVX对照；3)OVX+E2(1mg/kg)；4)OVX+EM-652.HCl(2.5mg/kg)；5)OVX+E2+EM-652.HCl；6)OVX+脱氢表雄酮(DHEA；80mg/kg)；7)OVX+DHEA+EM-652.HCl；8)OVX+DHEA+EM-652.HCl+E2。将DHEA作为在50％乙醇-50％丙二醇中的溶液，局部应用于背侧皮肤，而E2和EM-652.HCl作为在0.4％甲基纤维素中的悬浮液经管饲法口服。在卵巢切除后10周开始治疗，并且在26周内每日进行一次治疗。在同一时期内，不接受试验物质的动物仅用合适的溶媒治疗。骨盐密度的测量
在OVX之前、治疗第一天(OVX后10周)之前以及在治疗26周之后，用双能x射线吸收测量法(DEXA；QDR 4500A，Hologic，Waltham，MA)和区域高分辨率扫描软件，在异氟烷麻醉下对各只大鼠进行全身骨骼、腰椎和右侧股骨扫描。测定腰椎(脊椎L2至L4)、股骨的骨盐密度(BMD)和总机体组成(脂肪百分率)。统计学分析
数据以均数±SEM表示。按照Duncan-Kramer的多重极差检验(Kramer CY；Biometrics 1956；12307-310)，测定统计学显著性。结果
在以上描述的前项研究(实施例5A)中，在OVX时开始给予试验化合物，以便研究对骨丢失的预防效应。在本项研究中，在OVX后10周开始给予试验化合物，以便研究所给予的治疗的可能的治疗效应。在OVX之前(基线值)以及在开始治疗之前测量BMD，以便确立在开始治疗之前存在骨质减少。如图16所示，卵巢切除10周后，腰椎BMD降低8％，在OVX后动物仅接受溶媒的的另外26周之后，进一步降低12％(对照组)。每日给予确立骨质减少的动物E2、EM-652.HCl、E2+EM-652.HCl、DHEA或DHEA+EM-652.HCl达26周，完全预防在OVX对照动物中观察到的腰椎BMD的进一步降低，而给予E2+EM-652.HCl+DHEA，导致BMD值略高于在治疗开始之前观察到的BMD值。另一方面，如图17中所示，股骨BMD在卵巢切除后10周降低4％，在仅用溶媒治疗的另外26周之后进一步降低6％。与腰椎BMD相似，每日给予E2、EM-652.HCl、E2+EM-652.HCl、DHEA或DHEA+EM-652.HCl达26周，完全预防在OVX对照动物中观察到的股骨BMD的进一步降低。另一方面，给予E2+EM-652.HCl+DHEA，导致股骨BMD值甚至略高于在OVX之前观察到的BMD值，因此表明这种联合治疗对骨生成的有益效应。用EM-652.HCl+E2+DHEA联合治疗，不仅在骨质减少的动物完全预防进一步的OVX诱发的骨丢失，而且也有某些治疗效应。
除对骨的效应外，如图18中所示，给予DHEA、E2和/或EM-652.HCl预防OVX诱发的总体脂肪的增加。事实上，在OVX对照动物中，脂肪百分率在卵巢切除10周后增加47％，在仅用溶媒治疗的26周内进一步增加17％(对照组)。每日给予E2、DHEA、EM-652.HCl、E2+EM-652.HCl或DHEA+EM-652.HCl达26周，预防在OVX对照组中观察到的17％的增加。另一方面，用EM-652.HCl+E2+DHEA联合治疗，完全逆转了OVX的效应，并且导致脂肪百分率数值与动物卵巢切除之前观测的数值相似，因而表明该疗法有治疗效应。实施例6
本发明化合物对人子宫内膜腺癌Ishikawa细胞中碱性磷酸酶活
性的影响材料细胞储备培养物的保持
来源于很好分化的子宫内膜腺癌的人Ishikawa细胞系由ErlioGurpide博士(The Mount Sinai Medical Center，New York，NY)好意提供。Ishikawa细胞常规在含有5％(v/v)FBS(胎牛血清)并补充100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.1mM非必需氨基酸溶液的Eagle极限必需培养基(MEM)中保持。将细胞以1.5×106细胞的密度，于37℃接种到Falcon T75摇瓶中。细胞培养实验
在实验开始之前24小时，将接近铺满的Ishikawa细胞的培养基更换为新鲜的无雌激素的基本培养基(EFBM)，该培养基由无酚红Ham’s F-12和Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)的1∶1(v∶v)混合物组成，并补充100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM谷氨酰胺和5％FBS，所述FBS用包有葡聚糖的活性炭处理两次，以除去内源类固醇。然后，用0.1％胰酶制剂(Sigma)和0.25mM HEPES收获细胞，将其重悬于EFBM中，并在100μl体积中以2.2×104细胞/孔的密度，接种到Falcon 96孔平底微量滴定板中，让其附着于平板表面达24小时。此后，将培养基更换为含有指定浓度化合物的新鲜EFBM，终体积为200μl。将细胞孵育5天，48小时后更换培养基。碱性磷酸酶测定
在孵育期结束时，将微量滴定板倒置，倾出生长培养基。用200μl/孔PBS(0.15M NaCl、10mM磷酸钠，pH7.4)冲洗平板。然后从平板除去PBS，同时小心地留下一些残留的PBS，将洗涤步骤重复一次。然后倾出缓冲盐水，将倒置的平板在纸巾上逐渐吸干。在将盖子复原后，将板置于-80℃达15分钟，然后于室温解冻10分钟。然后将板置于冰上，加入50μl含有5mM磷酸对硝基苯酯、0.24mM MgCl2和1M二乙醇胺的冰冷溶液(pH9.8)。然后将板温至室温，让由于产生对硝基苯酯而产生的黄色显色(8分钟)。在酶联免疫吸附测定平板读出仪(BIO-RAD，2550型EIA读出仪)中，于405nm监测平板。计算
运用加权迭代非线性平方回归，计算剂量反应曲线以及IC50值。表8
*1nM E2刺激的百分率＝OD 405nm化合物-OD 405nm基线/OD 405nm 1nM E2-OD 405nm基线请也参见Labrie等，EM-652(SCH 57068)，在乳腺和子宫内膜中作为纯抗雌激素起作用的第三代SERM，J.Steroid Biochem.and Mol.Bio.69，51-84，1999。
实施例7EM-652.HCl、TSE 424和lasofoxifene对人乳癌MCF-7细胞增殖的影响方法细胞储备培养物的保持
MCF-7人乳癌细胞得自美国典型培养物保藏中心第147代#HTB，常规在无酚红Dulbecco改进的Eagle’s-Ham’s F12培养基、上述补充物和5％FBS中生长。MCF-7人乳腺癌细胞系来源于一位69岁白种女患者的胸膜积液。使用第148代和165代之间的MCF-7细胞，并且每周传代。细胞增殖研究
用0.1％胰酶制剂(Sigma)收获晚期对数生长期的细胞，将其重悬于合适的培养基中，所述培养基含有50ng牛胰岛素/ml和5％(v/v)FBS，所述FBS用包有葡聚糖的活性炭处理两次，以除去内源类固醇。将细胞以指定的密度接种到24孔Falcon塑料培养板(2cm2/孔)中，让其附着于平板表面达72小时。此后，将培养基更换为含有指定浓度化合物的新鲜培养基，所述化合物是由在99％重蒸乙醇中在存在或不存在E2的情况下的1000×储备液稀释的。对照细胞仅接受所述乙醇溶媒(0.1％EtOH，v/v)。将细胞孵育指定的时间间隔，以2天或3天的间隔更换培养基。通过测量DNA含量，测定细胞数目。计算和统计学分析
运用加权迭代非线性最小平方回归，计算剂量反应曲线以及IC50数值。所有结果均以均数±SEM表示。
表9
实验1
实验2
实施例8EM-652.HCl、他莫昔芬、托瑞米芬、屈洛昔芬、艾多昔芬、GW-5638和雷洛昔芬对裸鼠体内人ZR-75-1乳房肿瘤生长影响的比较
该实施例的目的是比较EM-652.HCl和6种其它口服抗雌激素(SERM)对很好表征的雌激素敏感性ZR-75-1乳癌异种移植物在卵巢切除裸鼠体内生长的激动剂效应和拮抗剂效应。材料和方法人ZR-75-1乳癌细胞
ZR-75-1人乳癌细胞得自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)，在无酚红RPMI-1640培养基中培养。为细胞补充2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100IU青霉素/ml、100μg链霉素/ml和10％(v/v)胎牛血清，在95％空气/5％CO2的潮湿环境中、于37℃孵育。将细胞每周传代，并用0.083％胰酶制剂/0.3mM EDTA于85-90％铺满时收获细胞。动物和肿瘤接种
雌性纯合nu/nu Br无胸腺小鼠(28-42日龄)得自Charles River，Inc.(Saint-Constant，Québec，Canada)。小鼠(每个笼子5只)关养在保持在空气层流罩超净台中的具有空气过滤罩的乙烯笼子中，并且在限制病原体的条件下维持。光周期为12小时光照和12小时黑暗(于0715开灯)。笼子、褥草和食物(Agway Pro-Lab R-M-H Diet#4018)在使用之前进行高压灭菌。将水高压灭菌，并且任意供应。在异氟烷诱导的麻醉下切除两侧卵巢。在卵巢切除时，皮下插入雌二醇(E2)植入物，以刺激原始肿瘤生长。在1cm长的硅橡胶管(内径0.062英寸；外径0.095英寸)中制备E2植入物，该植入物含有0.5cm的1∶10(w/w)的雌二醇和胆固醇的混合物。卵巢切除后一周，将0.1ml RPMI-1640培养基+30％Matrigel中的2×106ZR-75-1(第93代)细胞通过2.5cm长的22号针头皮下接种到每只卵巢切除(OVX)小鼠的两侧胁腹。4周后，所有动物体内的E2植入物用相同大小的含雌酮植入物(E1∶胆固醇，1∶25，w∶w)取代。1周后开始随机化和治疗。治疗
在治疗开始前一天，将带有平均面积为24.4±0.4mm2(范围为5.7-50.7mm2)的ZR-75-1肿瘤的255只小鼠随机指定到17个组(根据肿瘤大小)中，每组有15只小鼠(总共29或30个肿瘤)。这17个组包括2个对照组(OVX和OVX+雌酮)、7个补充雌酮植入物并用抗雌激素治疗的组、以及8个仅接受一种抗雌激素的其它组。然后从卵巢切除的对照组(OVX)和将仅接受所述抗雌激素的组的动物体内取出雌酮植入物。此后，在9个其它组中的含雌酮植入物每6周进行更换。在Oncologyand Molecular Endocrinology Research Center的医药化学部，合成EM-652.HCl、雷洛昔芬、屈洛昔芬、艾多昔芬和GW 5638。他莫昔芬购自Plantex(Netanya，Israёl)，而柠檬酸托瑞米芬购自Orion(Espoo，Finland)。在雌酮刺激下，以悬浮于0.2ml 0.4％(w/v)甲基纤维素中的50μg(平均2mg/kg)的口服日剂量给予所述抗雌激素。在无雌酮刺激的情况下，动物通过口服途径，每日一次用200μg(平均8mg/kg)每种抗雌激素治疗。两个对照组中的动物仅接受0.2ml的所述溶媒。每个月制备合适浓度的所述抗雌激素悬浮液，于4℃贮存，并在恒定搅拌下使用。粉剂储备物密封贮存于4℃(艾多昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、GW 5638、屈洛昔芬)或室温(他莫昔芬、EM-652.HCl)。肿瘤测量和尸体剖检
记录两个垂直的直径，用以下公式计算肿瘤面积(mm2)L/2×W/2×π。将治疗的第一天测量的面积作为100％。
治疗161天后，用异氟烷麻醉留下的动物，并通过断头术将其杀死。为了进一步鉴定所述雌激素和抗雌激素的效应，立即取出雌激素效应组织，例如子宫和阴道，去除结缔组织和脂肪组织，并称重。准备子宫，以通过用Image Pro-Plus(Media Cybemetics，Maryland，USA)进行的图象分析来评价子宫内膜厚度。简而言之，将子宫在10％福尔马林中固定，并包埋在石蜡中。分析小鼠子宫的苏木精染色和曙红染色的切片。每个子宫分析4个图象(每个子宫角2个图象)。在每组所有动物中测量平均上皮细胞高度。反应标准
在研究结束时或在每只动物死亡时(如果这在实验过程中发生)评价肿瘤反应。在这种情况下，在所述肿瘤反应分析中，仅使用存活时间达该项研究的至少一半时间(84天)的小鼠的数据。简而言之，完全消退鉴别在实验结束时检测不到的肿瘤；部分消退对应于消退≥其原始大小的50％的肿瘤；稳定反应是指消退＜50％或发展≤50％的肿瘤；而发展是指与其原始大小相比发展≥50％的肿瘤。统计学分析
按照用于重复度量的ANOVA，分析第1天和第161天之间总肿瘤表面积的变化。该模型包括治疗、时间、和时间-治疗相互作用效应加上用于说明随机化所述层的项。因而，根据时间-治疗相互作用，检验161天时不同治疗效应的显著性。残差分析指出，对原始尺度的度量不适合于用ANOVA分析，也不适合于尝试的任何变换。因此根据所述分析，选择所述秩。治疗对上皮厚度的影响通过也包括随机化时的层的单因素ANOVA来评价。用最小平方均数统计，进行后验配对比较(posteriori pairwise comparison)。总体1型误差率(α)控制在5％，以宣布所述差异的显著性。所有计算均采用SAS软件(SAS Institute，Carry，NC)上的Proc MIXED进行。结果对ZR-75-1肿瘤生长的拮抗剂效应
单独的雌酮(OVX+E1)在23周治疗期内引起ZR-75-1肿瘤大小增加707％(图19A)。将50μg口服日剂量的纯抗雌激素EM-652.HCl给予雌酮刺激的小鼠，完全防止肿瘤生长。事实上，不仅防止肿瘤生长，而且在治疗23周后，肿瘤大小比治疗开始时的原始数值低26％(p＜0.04)。在用EM-652.HCl治疗后获得的这一数值与在仅卵巢切除(OVX)后观察到的数值没有统计学差异，在仅卵巢切除后，肿瘤大小比原始肿瘤大小降低61％。在相同剂量(50μg)和治疗期下，所述6种其它抗雌激素没有降低原始平均肿瘤大小。在这些组中的肿瘤都显著高于OVX对照组和EM-652.HCl治疗组(p＜0.01)。事实上，与治疗前数值相比，用屈洛昔芬、托瑞米芬、GW 5638、雷洛昔芬、他莫昔芬和艾多昔芬治疗23周，分别导致平均肿瘤大小高于治疗前数值478％、230％、227％、191％、87％和86％(图19A)。对ZR-75-1肿瘤生长的激动剂效应
在不补充雌酮的情况下，用200μg日剂量的他莫昔芬治疗161天后，平均肿瘤大小增加至高于基线196％(p＜0.01，相对于OVX)(图19B)。另一方面，用艾多昔芬治疗的小鼠的平均肿瘤大小增加(125％)(p＜0.01)，而在用托瑞米芬治疗的小鼠体内肿瘤大小增加86％(p＜0.01)(图19B)。将200μg EM-652.HCl加入200μg他莫昔芬，完全抑制仅用他莫昔芬观察到的增殖(图19C)。另一方面，在实验结束时，与OVX对照组相比，用单独的EM-652.HCl(p＝0.44)、雷洛昔芬(p＝0.11)、屈洛昔芬(p＝0.36)或GW 5638(p＝0.17)治疗，不显著改变ZR-75-1的肿瘤大小(图19B)。对反应类别的影响在雌酮刺激时50μg抗雌激素的影响
除了对肿瘤大小的影响外，在实验结束时各个肿瘤达到的反应类别是疗效的一个重要参数。在卵巢切除小鼠中，分别在21％、43％和38％的肿瘤中达到完全反应、部分反应和稳定反应，而所述肿瘤没有一个发展。另一方面，在补充雌酮的OVX动物中，100％的肿瘤已经发展(图20A)。在EM-652.HCl治疗的补充雌酮的OVX动物组中，分别在17％、17％和60％的肿瘤中观察到完全反应、部分反应和稳定反应，而仅7％的肿瘤(30个肿瘤中的2个肿瘤)发展。在相同的雌酮刺激条件下，用50μg日剂量的任一所述其它抗雌激素治疗不能将发展中肿瘤的百分率降至低于60％。事实上，在他莫昔芬治疗组中65％的肿瘤(26个中的17个)发展，而用托瑞米芬治疗有89％的肿瘤(28个中的25个)发展，用雷洛昔芬治疗有81％的肿瘤发展(26个中的21个)，用屈洛昔芬治疗100％的肿瘤(23个中的23个)发展，而用艾多昔芬治疗有71％的肿瘤(28个中的20个)发展，用GW 5638治疗有77％的肿瘤(26个中的20个)发展(图20A)。在无雌酮刺激下200μg抗雌激素对反应类别的影响
如图20B所示，他莫昔芬、艾多昔芬和托瑞米芬在无雌酮刺激的情况下导致发展中肿瘤的比率高于使用所述其它抗雌激素的所述比率。事实上，在他莫昔芬、艾多昔芬和托瑞米芬以200μg的日剂量治疗后，分别有62％(26个中的16个)、33％(24个中的8个)和21％(28个中的6个)的肿瘤属于发展类别。如图20C中可以见到的，将200μgEM-652.HCl加入他莫昔芬中，将仅用他莫昔芬的发展中肿瘤的百分率从62％(26个中的16个)降至将EM-652.HCl加入他莫昔芬中时的7％(28个中的2个)。抗雌激素对子宫上皮细胞厚度的影响
测量子宫内膜上皮细胞高度，作为子宫内膜中每种化合物的激动剂效应和拮抗剂效应的最直接的参数。在存在雌酮刺激时每日50μg抗雌激素对子宫上皮细胞厚度的影响
在50μg口服日剂量下，EM-652.HCl将雌酮对上皮高度的刺激效应抑制70％。所测试的6种其它抗雌激素的功效显著较低(p＜0.01)。事实上，屈洛昔芬、GW 5638、雷洛昔芬、他莫昔芬、托瑞米芬和艾多昔芬对雌酮刺激分别抑制17％、24％、26％、32％、41％和50％(表10)。在无雌酮刺激时每日200μg抗雌激素对子宫上皮细胞厚度的影响
无雌酮刺激时，EM-652.HCl和屈洛昔芬是所测试的仅有的不显著增加上皮细胞高度的化合物(分别为OVX对照组数值的114％和101％)。他莫昔芬(155％)、托瑞米芬(135％)和艾多昔芬(176％)对子宫上皮高度有显著刺激作用(p＜0.01，相对于OVX对照组)。雷洛昔芬(122％)和GW 5638(121％)对子宫上皮高度有统计学显著性的刺激作用(p＜0.05，相对于OVX对照组)(表10)。所测量的每种抗雌激素对子宫重量和阴道重量的激动剂效应和拮抗剂效应同对子宫上皮厚度所观察的模式一致(数据未显示)。
表10
a，b实验小鼠相对于OVX对照小鼠aP＜0.05；bP＜0.01。
c，d实验小鼠相对于EM-652.HCl治疗小鼠cP＜0.05；dP＜0.01。
实施例9在口服一剂14C-EM-800(20mg/kg)后雌性大鼠脑中的放射性
实施例9显示了在口服一剂14C-EM-800(20mg/kg)后大鼠脑中的放射性。为了比较，包括了得自这些动物中的每只的血液、血浆、肝和子宫的数值。这些结果来自LREM研究第1129号-在给雄性和雌性Long-Evans大鼠口服一剂14C-EM-800(20mg/2ml/kg)后放射性的组织分布和排泄。这些数字表明，雌性Long-Evans大鼠脑中来源于药物的总放射性量非常低(ng相当物/g组织)，在给药后12小时后检测不到。2小时时，脑中的放射性比肝中的放射性低412倍，比子宫中的放射性低21倍，比血液中的放射性低8.4倍，比血浆中的放射性低13倍。由于脑中总放射性的未知部分是由于血液放射性的污染所致，因此，表1中所示的脑放射性的数值过高地估计了脑组织自身中14C(EM-800)相关的放射性水平。这样的数据提示，抗雌激素在脑组织中的水平(如果存在抗雌激素的话)太低，以致不能抵消外源雌激素的效应。重要的是注意到，在脑组织中检测到的一些放射性可能是由于组织中的残留血液所致。另外，用于该项研究的14C-EM-800的放射化学纯度最低为96.25％。
表11
表12实施例10抗雌激素EM-652.HCl与雌二醇的组合保护抵抗子宫刺激
材料和方法
动物和治疗
使用在卵巢切除时重215-265g的10-12周龄雌性Sprague-Dawley大鼠(CrlCD(SD)Br)(Charles River Laboratory，St-Constant，Canada)。将动物单独关养在环境受控的房间(温度22±3℃；湿度50±20％；12h光照-12h黑暗周期，于0715开灯)中。让动物自由获取自来水和合格的啮齿动物饲料(Lab Diet 5002(粒料)，Ralston Purina，St-Louis，MO)。在Canadian Council on Animal Care(CCAC)和the Association forAssessment and Accreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC)批准的动物设备中，按照实验动物护理和使用的CCAC指南，进行实验。将137只大鼠随机分配在每组13或14只动物的如下10个组中1)无伤对照；2)卵巢切除(OVX)对照；3)OVX+17β-雌二醇(E2；2mg/kg)；组4-10)OVX+E2+EM-652.HCl(0.01、0.03、0.1、0.3、1、3或10mg/kg)。该研究的第1天，在异氟烷麻醉下，将合适组别的动物的两侧卵巢切除(OVX)。所述试验化合物作为在0.4％甲基纤维素中的悬浮液(0.5ml/大鼠)从该研究的第1天至第14天经管饲法每日口服一次。组1和组2的动物在所述同一时期内仅接受所述溶媒。在该研究的第15天，给每组4只动物灌注10％缓冲的福尔马林，并加工组织以供组织学检查。在异氟烷麻醉下通过在腹主动脉进行驱血法杀死其它动物。取出子宫和阴道，剥除剩余的脂肪并称重。将得自每个子宫的标本在10％缓冲的福尔马林中固定，以供采用计算机辅助程序(SoftwareImage-Pro Plus)测定子宫内膜上皮细胞高度。血清胆固醇水平
从禁食过夜的动物收集血清样品，用Boehringer MannheimDiagnostic Hitachi 911分析仪(Boehringer Mannheim DiagnosticLaboratory Systems)，测定血清样品的总胆固醇。统计学分析
数据以均数±SEM表示。按照Duncan-Kramer的多重极差检验(Kramer，Biometrics 12307-310，1956；)，测定统计学显著性。结果
通过每日口服给予2mg/kg剂量的17β-雌二醇(E2)，完全逆转了在卵巢切除后2周所观察到的子宫重量的65％减少(490±26mg相对于480±17mg；N.S.)(图21)。如同一图中所示，用增加剂量EM-652.HCl，观察到E2对子宫重量刺激效应的进行性抑制作用，在3mg/kg和10mg/kg剂量的该抗雌激素下分别观察到对E2效应的84％和87％的逆转。对子宫内膜上皮高度获得了相当的结果(图22)。事实上，E2刺激的子宫内膜上皮高度被3mg/kg和10mg/kg剂量的所述抗雌激素分别阻止了83％和93％。与无伤对照动物(31.1±0.7μm)相比，在用E2化合物治疗的OVX动物组(41.9±1.2μm)中子宫内膜上皮高度较高(34.7％，p＜0.01)(图23)。
给OVX动物补充E2，导致阴道重量与无伤动物阴道重量相似(149.9±9.0mg相对于145±5.3mg，N.S.)。在图24中可以看到，在高于对子宫重量所观察的剂量的EM-652.HCl下，观察到对阴道重量的抑制作用。事实上，在至多1mg/kg的所述化合物下，没有观察到所述抗雌激素对阴道重量的显著性抑制效应。事实上，虽然3mg/kg剂量的EM-652.HCl引起对E2刺激效应的统计学非显著性的50％抑制，但在10mg/kg剂量的所述抗雌激素下，观察到完全逆转了E2对阴道重量的效应。
在OVX后2周，观察到血清胆固醇增加37％(p＜0.01)。另一方面，用E2治疗OVX动物，引起对血清胆固醇水平的53％抑制(p＜0.01)(图25)。加入日剂量为0.01mg/kg至0.3mg/kg的EM-652.HCl，对E2的抑制作用没有统计学显著性的影响。另一方面，1.0、3.0和10mg/kg剂量的EM-652.HCl将E2的效应分别降低36％、30％和50％。本发明的数据清楚地证明，抗雌激素EM-652.HCl中和了雌激素在外周组织中作用的两个充分确定的参数-E2对子宫重量和子宫内膜上皮高度的刺激效应。这些数据清楚地表明，在接受雌二醇以减轻血管舒缩症状的绝经后妇女中共同给予EM-652.HCl将预防雌激素对子宫内膜的刺激效应。
1.0mg/kg、3.0mg/kg和10mg/kg剂量的EM-652.HCl的抑制效应的36％、30％和50％逆转，可能可以用所述抗雌激素的所述效应占优势来解释，单独使用所述抗雌激素时也许引起同样程度的抑制。事实上，EM-652.HCl对大鼠子宫ER的亲和性比E2本身对ER的亲和性高约5倍(Martel等，J.Steroid Biochem.Molec.Biol.，64199-205，1998)。
药用组合物和试剂盒实施例
以下通过实施例来叙述，但不限于所述实施例，叙述几种利用优选的活性SERM EM-800或EM-652.HCl(EM-1538)和优选的活性雌激素17β-雌二醇、乙炔基雌二醇或结合雌激素的药用组合物和试剂盒。可以使用本发明的其它化合物或其组合，来取代EM-800或EM-652.HCl或17β-雌二醇或乙炔基雌二醇，或者除EM-800或EM-652.HCl或17β-雌二醇或乙炔基雌二醇外，使用本发明的其它化合物或其组合。有效成分的浓度可以在下文讨论的宽范围内变动。可以包括的其它成分用量和类型是本领域众所周知的。
实施例A
用于口服的药用组合物(胶囊)
或
实施例B
试剂盒
口服所述SERM和雌激素 用于口服的非类固醇抗雌激素组合物(胶囊)
用于口服的雌激素组合物
(明胶胶囊)
其它SERM可以替代上述配方中的EM-800或EM-01538，而且其它雌激素可以替代17β-雌二醇、乙炔基雌二醇或结合雌激素。可以包括不止一种SERM或不止一种雌激素，在这种情况下，结合重量百分率最好是在上述实施例中给出的单一雌激素或单一SERM的重量百分率的结合重量百分率。
已经借助优选实施方案和实施例描述了本发明，但本发明不限于所述实施方案和实施例。本领域技术人员会容易认识到本发明更宽的应用性和范围，本发明的应用性和范围仅受本文专利的权利要求书的限定。
权利要求
1.一种降低或消除绝经症状发生率的方法，所述方法包括给予需要所述消除或降低的患者治疗有效量的雌激素或其前药并结合给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂或其前药，所述调节剂是不同于所述雌激素的化合物并且不是苯并噻吩衍生物。
2.一种治疗下述病症或降低患下述病症危险的方法骨质疏松、血胆固醇过多、血脂过多、动脉粥样硬化、高血压、早老性痴呆、胰岛素抵抗、糖尿病、肌肉质量损失、肥胖、激素替代疗法诱发的阴道出血和激素替代疗法诱发的乳房触痛；所述方法包括给予需要所述消除或降低的患者治疗有效量的雌激素或其前药并结合给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂或其前药，所述调节剂是不同于所述雌激素的化合物并且不是苯并噻吩衍生物。
3.一种治疗骨质疏松或降低患骨质疏松危险的方法，所述方法包括给予需要所述消除或降低的患者治疗有效量的雌激素或其前药并结合给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂或其前药，所述调节剂是不同于所述雌激素的化合物并且是不同于以下物质的化合物苯并噻吩衍生物、萘衍生物、异喹啉衍生物或具有超过10％的2R构型对映体的3-苯基喹啉衍生物、3-苯硫基苯并二氢吡喃衍生物、3-苯基苯并二氢吡喃衍生物的对映体混合物。
4.一种药用组合物，所述药用组合物包含
a)一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体；
b)治疗有效量的至少一种雌激素或其前药；和
c)治疗有效量的至少一种选择性雌激素受体调节剂或其前药，其中所述调节剂是不同于所述雌激素的化合物，并且所述调节剂不是苯并噻吩衍生物、萘衍生物、异喹啉衍生物或具有超过10％的2R构型对映体的3-苯基喹啉衍生物、3-苯硫基苯并二氢吡喃衍生物、3-苯基苯并二氢吡喃衍生物的对映体混合物。
5.一种试剂盒，所述试剂盒包括一个第一容器，所述第一容器含有一种包含治疗有效量的至少一种雌激素或其前药的药用制剂；并且所述试剂盒还包括一个第二容器，所述第二容器含有一种包含治疗有效量的至少一种选择性雌激素受体调节剂或其前药的药用制剂，所述调节剂不是苯并噻吩衍生物。
6.一种药用组合物，所述药用组合物包含
a)一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体；
b)治疗有效量的至少一种雌激素或其前药；
c)治疗有效量的至少一种选择性雌激素受体调节剂或其前药，其中所述调节剂是不同于所述雌激素的化合物；和
d)治疗有效量的至少一种另外的选自下列的药物二膦酸盐、雄激素类药、睾酮、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄-5-烯-3β，17β-二醇、4-雄烯-3，17-二酮和任一上述另外的药物的前药。
7.权利要求2的方法，其中所述方法还包括给予治疗有效量的二膦酸盐作为联合疗法的一部分的步骤。
8.一种降低或消除绝经症状发生率的方法，所述方法包括给予需要所述危险消除或降低的患者治疗有效量的雌激素或其前药并结合给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂或其前药，所述调节剂是不同于所述雌激素的化合物，还包括作为联合疗法的一部分给予治疗有效量的至少一种选自下列的另外药物的步骤脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄激素类药、睾酮、雄-5-烯-3β，17β-二醇、4-雄烯-3，17-二酮和任一上述另外药物的前药。
9.一种治疗下述病症或降低患下述病症危险的方法骨质疏松、血胆固醇过多、血脂过多、动脉粥样硬化、高血压、早老性痴呆、胰岛素抵抗、糖尿病、肌肉质量损失、肥胖、激素替代疗法诱发的阴道出血和激素替代疗法诱发的乳房触痛；所述方法包括给予需要所述消除或降低的患者治疗有效量的雌激素或其前药并结合给予所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂或其前药，所述调节剂是不同于所述雌激素的化合物，还包括作为联合疗法的一部分给予治疗有效量的至少一种选自下列的另外药物的步骤脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄-5-烯-3β，17β-二醇、雄激素类药、睾酮、4-雄烯-3，17-二酮和任一上述另外药物的前药。
10.一种试剂盒，所述试剂盒包括一个第一容器，所述第一容器含有一种包含治疗有效量的至少一种雌激素或其前药的药用制剂；并且所述试剂盒还包括一个第二容器，所述第二容器含有一种包含治疗有效量的至少一种选择性雌激素受体调节剂或其前药的药用制剂，所述试剂盒包括至少一个另外的容器，所述另外的容器含有治疗有效量的至少一种选自下列的另外的药物脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄-5-烯-3β，17β-二醇、雄激素类药、睾酮、4-雄烯-3，17-二酮和任一上述另外药物的前药。
11.可用于治疗骨质疏松或降低患骨质疏松危险的权利要求5或权利要求10的试剂盒，所述试剂盒包括至少一个另外的容器，所述容器含有一种包含治疗有效量的至少一种二膦酸盐的药用制剂。
12.权利要求1的方法，所述方法还包括作为联合疗法的一部分给予治疗有效量的一种雄激素类药。
13.权利要求1-12中任一项的方法、药用组合物或试剂盒，其中所述选择性雌激素受体调节剂的分子式具有以下特征
a)由1-2个间插碳原子间隔的两个芳环，两个芳环或者是未取代的，或者被一个羟基或一个在体内转变为羟基的基团取代；
b)具有一个芳环和一个叔胺官能或其盐的侧链；并且其中所述调节剂不是苯并噻吩衍生物、萘衍生物、异喹啉衍生物或具有超过10％的2R构型对映体的3-苯基喹啉衍生物、3-苯硫基苯并二氢吡喃衍生物、3-苯基苯并二氢吡喃衍生物的对映体混合物。
14.权利要求13的方法、药用组合物或试剂盒，其中所述侧链选自
和
15.权利要求13的方法、药用组合物或试剂盒，其中所述选择性雌激素受体调节剂选自三苯乙烯衍生物、吲哚衍生物、苯并吡喃衍生物、HMR 3339、HMR 3656、LY 335124、LY 326315、SH 646、ERA 923和苯并二氢吡喃(centchroman)衍生物。
16.权利要求6的药用组合物、权利要求8和9的方法或权利要求10的试剂盒，其中所述选择性雌激素受体调节剂是下式的苯并噻吩衍生化合物
其中R1和R2独立选自氢、羟基和在体内转变为羟基的部分；
其中R3和R4或者(a)独立地为C1-C4烷基，或者(b)是与它们连接的氮结合为选自下列的部分吡咯烷基、二甲基-1-吡咯烷基、甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亚甲基亚氨基和吗啉代；
其中A选自-CO-、-CHOH和-CH2-；
其中B选自亚苯基、亚吡啶基和-环C4H2N2-。
17.权利要求16的方法、药用组合物或试剂盒，其中所述选择性雌激素受体调节剂选自雷洛昔芬、LY 353381和LY 335563。
18.权利要求13的方法、药用组合物或试剂盒，其中所述选择性雌激素受体调节剂是下式的三苯乙烯或二苯基氢化萘衍生化合物
或
其中D是-OCH2CH2N(R3)R4、-OCH2CH2OH或-CH＝CH-COOH(R3和R4或者独立选自C1-C4烷基，或者R3、R4以及与它们连接的氮原子一起为选自下列的环结构吡咯烷基、二甲基-1-吡咯烷基、甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亚甲基亚氨基和吗啉代)；
其中E和K独立地为氢或羟基、磷酸酯或低级烷基，其中J为氢或卤素。
19.权利要求1-14中任一项的方法、药用组合物或试剂盒，其中选择性雌激素受体调节剂是OH-他莫昔芬、屈洛昔芬、托瑞米芬、艾多昔芬、Lasofoxifene、iproxifene、FC1271和GW5638。
20.权利要求13的方法、药用组合物或试剂盒，其中所述选择性雌激素受体调节剂是下式的吲哚衍生化合物
其中D选自-OCH2CH2N(R7)R8、-CH＝CH-CON(R7)R8、-CC-(CH2)n-N(R7)R8(R7和R8或者独立选自C1-C6烷基，或者R7、R8以及与它们连接的氮原子一起为选自下列的环结构吡咯烷基、二甲基-1-吡咯烷基、甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亚甲基亚氨基、吗啉代)；
其中X选自氢和C1-C6烷基；
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6独立选自氢、羟基、C1-C6烷基和在体内转变为羟基的部分。
21.权利要求20的方法、药用组合物或试剂盒，其中所述选择性雌激素受体调节剂是TSE 424(2-(4-羟基苯基)-3-甲基-1-[[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]甲基]-1H-吲哚-5-醇)。
22.权利要求13的方法、药用组合物或试剂盒，其中所述选择性雌激素受体调节剂是下式的苯并二氢吡喃衍生化合物
其中R1和R2独立选自氢、羟基和在体内转变为羟基的部分；
其中R5和R6独立地为氢或C1-C6烷基；
其中D是-OCH2CH2N(R3)R4(R3和R4或者独立选自C1-C4烷基，或者R3、R4以及与它们连接的氮原子一起为选自下列的环结构吡咯烷基、二甲基-1-吡咯烷基、甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亚甲基亚氨基、吗啉代)。
23.权利要求22的方法、药用组合物或试剂盒，其中所述苯并二氢吡喃衍生物为(3，4-反式-2，2-二甲基-3-苯基-4-[4-(2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基]-7-甲氧基苯并二氢吡喃)。
24.权利要求13的方法、药用组合物或试剂盒，其中所述选择性雌激素受体调节剂具有以下结构式
其中R1和R2独立选自氢、羟基和在体内转变为羟基的部分；其中Z或者不存在或者选自-CH2-、-O-、-S-和-NR3-(R3为氢或低级烷基)；
其中R100为使L离开所述B-环4-10个间插原子的二价部分；
其中L为选自-SO-、-CON-、-N＜和-SON＜的二价或三价部分；
其中G1选自氢、C1-C5烃、与G2和L结合在一起为一个5-7元杂环的二价部分和上述基团的卤代衍生物或不饱和衍生物；
其中G2或者不存在或者选自氢、C1-C5烃、与G1和L结合在一起为一个5-7元杂环的二价部分和上述基团的卤代衍生物或不饱和衍生物；
其中G3选自氢、甲基和乙基。
25.权利要求24的方法、药用组合物或试剂盒，其中所述化合物是具有以下通用结构的苯并吡喃衍生物或其药学上可接受的盐
其中D是-OCH2CH2N(R3)R4(R3和R4或者独立选自C1-C4烷基，或者R3、R4以及与它们连接的氮原子一起为选自下列的环结构吡咯烷基、二甲基-1-吡咯烷基、甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亚甲基亚氨基、吗啉代)；
其中R1和R2独立选自氢、羟基和在体内转变为羟基的部分。
26.权利要求25的方法、药用组合物或试剂盒，其中所述苯并吡喃衍生物由于大多数其立体异构体在碳2上具有绝对构型S而具有旋光性，所述化合物具有以下分子结构
其中R1和R2独立选自羟基和在体内转变为羟基的部分；
其中R3是选自以下的种类饱和、不饱和或取代的吡咯烷基，饱和、不饱和或取代的哌啶子基，饱和、不饱和或取代的哌啶基，饱和、不饱和或取代的吗啉代，含氮环部分，含氮多环部分，和NRaRb(Ra和Rb独立地为氢、直链或支链C1-C6烷基、直链或支链C2-C6链烯基和直链或支链C2-C6链炔基)。
27.权利要求26的方法、药用组合物或试剂盒，其中所述化合物或盐基本缺乏(2R)-对映体。
28.权利要求26的方法、药用组合物或试剂盒，其中所述选择性雌激素受体调节剂选自EM-800
EM-1520
EM-1872
EM-1900
EM-1901
EM-1903
EM-1533
EM-1518
和EM-652.HCl(EM-1538)
其中指出其立体化学的所有上述分子结构由于大多数其立体异构体具有2S构型而具有旋光性。
29.权利要求26的方法、药用组合物或试剂盒，其中所述苯并吡喃衍生物是选自以下的一种酸的盐乙酸、己二酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、富马酸、氢碘酸、氢溴酸、盐酸、氢氯噻嗪酸、羟基萘甲酸、乳酸、马来酸、甲磺酸、甲基硫酸、1，5-萘二磺酸、硝酸、棕榈酸、新戊酸、磷酸、丙酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对苯二甲酸、对甲苯磺酸和戊酸。
30.权利要求29的方法、药用组合物或试剂盒，其中所述酸是盐酸。
31.权利要求1-12中任一项的方法、药用组合物或试剂盒，其中所述选择性雌激素受体调节剂是EM-652.HCl(EM-1538)
并且由于大多数其立体异构体具有2S构型而具有旋光性；和
其中所述雌激素选自17β-雌二醇、17β-雌二醇酯、17α-雌二醇、17α-雌二醇酯、雌三醇、雌三醇酯、雌酮、雌酮酯、结合雌激素、马烯雌酮、马烯雌酮酯、17α-乙炔基雌二醇、17α-乙炔基雌二醇酯、美雌醇和美雌醇酯。
32.权利要求1-12中任一项的方法、药用组合物或试剂盒，其中所述雌激素选自17β-雌二醇、17β-雌二醇酯、雌三醇、雌三醇酯、雌酮、雌酮酯、结合雌激素、马烯雌酮、马烯雌酮酯、17α-乙炔基雌二醇、17α-乙炔基雌二醇酯、美雌醇、美雌醇酯、苯雌酚(chemestrogen)、DES、植物雌激素、替勃龙、2’-乙基雌激素噁唑(ethylestrogenoxazole)和炔诺醇。
33.权利要求1、2、3、8和9中任一项的方法，其中所述选择性雌激素受体调节剂在乳房组织或子宫内膜组织中没有雌激素活性。
34.权利要求1-12中任一项的方法、药用组合物或试剂盒，其中所述雌激素是一种混合雌激素/雄激素化合物。
35.权利要求34的方法，其中所述混合雌激素/雄激素化合物是替勃龙。
36.权利要求1和8的方法，其中绝经症状选自热潮红、血管舒缩症状、不规则月经、阴道干燥、头痛和睡眠障碍。
37.权利要求1的方法，其中所述治疗降低所述患者患乳癌或子宫内膜癌的危险。
全文摘要
公开了在易感的温血动物包括人类中降低或消除热潮红和绝经症状发生率、同时降低患乳癌或子宫内膜癌的危险、此外还治疗和/或抑制以下疾病发展的新方法骨质疏松、血胆固醇过多、血脂过多、动脉粥样硬化、高血压、胰岛素抵抗、糖尿病、肌肉质量损失、肥胖、不规则月经、早老性痴呆或阴道干燥；所述方法包括给予选择性雌激素受体调节剂(特别是具有通用结构(I)的化合物)和一定量的雌激素或混合雌激素/雄激素化合物。尤其公开了进一步给予二膦酸盐或性类固醇前体，用于药物治疗和/或抑制这些上述疾病中某些疾病的发展。也公开了可用于本发明的用于传递有效成分的药用组合物和试剂盒。
文档编号A61P21/00GK1400904SQ01804028
公开日2003年3月5日 申请日期2001年1月26日 优先权日2000年1月28日
发明者F·拉布里 申请人:恩多研究公司