佐剂组合制剂的制作方法

专利名称：佐剂组合制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及氨烷基葡糖胺磷酸盐化合物、其衍生物或类似物的使用；与细胞因子或淋巴因子，特别是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子或白细胞介素-12组合，作为抗原性或免疫原性组合物中的佐剂本文，以提高脊椎动物宿主对所选抗原的免疫应答反应。
背景技术：
免疫系统使用多种机制攻击病原体。然而，在免疫接种后并不是所有这些机制都必须激活。免疫接种诱导的保护性免疫力依赖于免疫原性组合物引起适当免疫应答反应的能力，以抵抗或消除病原体。取决于病原体，这也许需要细胞介导的和/或体液免疫应答反应。
目前辅助T细胞在免疫应答反应中的作用的范例是，T细胞可根据它们产生的细胞因子分成亚群，在这些细胞中观察到的不同细胞因子分布决定了它们的功能。这种T细胞模式包括两个主要的亚群产生白细胞介素-2(IL-2)和干扰素γ的TH-1细胞，它们增强细胞和体液(抗体)免疫应答反应；以及产生白细胞介素-4，白细胞介素-5和白细胞介素-10(分别是IL-4，IL-5，IL-10)的TH-2细胞，它们增强体液免疫应答反应(参考文献条目1)。
常常需要提高抗原的免疫源性能力以在被免疫生物中获得更强的免疫应答并增强宿主对抗原携带因子的抵抗力。在一些情况下，需要使免疫应答反应从体液(TH-2)应答占主导转变为更平衡的细胞(TH-1)和体液(TH-2)应答反应。
细胞应答反应包括产生CD8+CTL(细胞毒T淋巴细胞)反应。这种应答对于免疫原性组合物抗细胞内病原体发展是需要的。抗各种病原体的保护力要求强粘膜应答反应，高血清滴定度，CTL诱导和强细胞应答反应。这些应答反应不能由大部分抗原制品所提供，包括传统的亚基免疫原性组合物。这些病原体之一是人类免疫缺陷性病毒(HIV)。
因此，需要开发能在脊椎动物宿主中产生体液和细胞免疫应答反应的抗原组合物制剂。
发明概述因此，本发明的目的之一是在含氨烷基葡糖胺磷酸盐化合物(AGP)的抗原组合物或其衍生物或类似物中使用佐剂组合制剂，与细胞因子或淋巴因子组合，特别是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或白细胞介素-12(IL-12)、或上述细胞因子或淋巴因子激动剂或拮抗剂。尤其，AGP是2-[(R)-3-十四酰氧十四酰氨基]乙基2-脱氧-4-氧-磷酰基-3-氧-[(R)-3-十四酰氧十四酰]-2-[(R)-3-十四酰氧十四酰氨基]-β-D-吡喃(型)葡萄糖苷，也称为529(以前称为RC529)。
佐剂是与免疫原或抗原一起给予时能增强免疫应答反应的物质。本发明的佐剂制剂与选定的抗原一起在抗原性或免疫原性组合物中给予。本发明的抗原组合物能增强脊椎动物宿主对所选抗原的免疫应答反应。所选的抗原也许是多肽，肽或(1)衍生自致病性病毒、细菌、真菌或寄生虫的片断，或(2)衍生自癌细胞或肿瘤细胞的片断，或(3)衍生自过敏原的片断以干扰IgE的生成从而调节对过敏原的过敏反应，或(4)衍生自淀粉样前体蛋白的片断以预防或治疗脊椎动物宿主中特征为淀粉样沉积性疾病。在本发明的一个实施方案中，选定的抗原来自HIV。该选定的HIV抗原也许是HIV蛋白、多肽、肽或上述蛋白的片断。在本发明的一个特别实施方案中，HIV抗原是特异性肽。在本发明的另一实施方案中，该选定抗原是β-淀粉样肽(也称为Aβ肽)，这是淀粉样前体蛋白(APP)的内部39-43氨基酸片断，经β和γ分泌酶对APP加工而产生。
AGP可作为水溶液或稳定化的水包油乳剂(稳定的乳剂或SE)存在。在本发明一较佳实施方案中，该水包油乳剂含鲨烯、甘油和磷脂酰胆碱。在SE配制中，在给予前将ACG与细胞因子或淋巴因子混合以形成抗原组合物。在本发明一较佳实施方案中，AGP是SE形式。该抗原组合物还包括稀释剂或载体。
本发明还涉及提高含有所选抗原的抗原组合物能力的方法，所选定抗原(1)来自致病病毒、细菌、真菌或寄生虫以诱导脊椎动物宿主的免疫应答，或(2)来自癌抗原或来自癌细胞或肿瘤细胞的肿瘤相关抗原以诱导脊椎动物宿主的治疗或预防性抗癌作用，或(3)来自过敏原以干扰IgE的生成从而调节对过敏原的过敏反应，或(4)来自宿主以不良方式、数量或位置产生(自体分子)的分子或蛋白质，通过包含有效辅佐剂量的细胞因子或淋巴因子的组合种减良作用，具体是AGP与GM-CSF或IL-12、或上述细胞因子或淋巴因子的激动剂或拮抗剂组合。
本发明还涉及提高含有选定抗原的抗原组合物能力的方法，所选定抗原来自致病病毒、细菌、真菌或寄生虫，通过包含有效辅佐剂量的细胞因子或淋巴因子的组合在脊椎动物宿主中诱导细胞毒性T淋巴细胞，具体是APG与GM-CSF或IL-12、或上述细胞因子或淋巴因子的激动剂或拮抗剂组合。
附图简述

图1描述了以如物质免疫接种转基因小鼠的抗Aβ1-42肽抗体的几何平均滴度组1-Aβ1-42肽加PBS(没有显示)；组2-Aβ1-42肽加MPLTMSE(正方形)；组3-Aβ1-42肽加MPLTMSE和GM-CSF(三角形)；组4-Aβ1-42肽加529 SE和GM-CSF(倒三角形)。
图2描述了用图1所述四组物质免疫接种转基因小鼠的总Aβ皮质水平。
图3描述了用图1所述四组物质免疫接种转基因小鼠的Aβ1-42肽皮质水平。
图4描述了用图1所述四组物质免疫接种转基因小鼠的前皮层淀粉样负担。
图5描述了用图1所述四组物质免疫接种转基因小鼠的前皮层神经炎负担。
图6描述了在如图1所述四组物质免疫接种转基因小鼠中的后夹肌皮层星形胶质细胞增生水平。
图7描述了两组猕猴短尾猿(每组四只动物)血清HIV C4(E9V)-V389.6P肽-特异性IgG抗体滴定度的几何平均值。组1动物只用C4(E9V)-V389.6P肽鼻内免疫。组2动物用C4(E9V)-V389.6P肽与529 SE和GM-CSF作肌肉内免疫。箭头表示在0、4、8、18和23周时免疫接种。
图8描述了图7所述相同动物子宫颈阴道灌洗液样品的抗体滴度几何平均值。
图9描述了图7所述相同动物洗鼻液样品的抗体滴度几何平均值。
发明详述佐剂、细胞因子和淋巴因子是免疫调节化合物，能够提高和操纵对本身免疫原性弱的各种抗原的免疫应答反应的发展和分布。适当选择佐剂、细胞因子和淋巴因子可诱导在缺乏佐剂、细胞因子和淋巴因子时不发展的良好体液和细胞免疫应答反应。特别是，佐剂、细胞因子和淋巴因子在增强对免疫原性组合物中的亚基和肽抗原免疫应答反应上有显著效果。它们的刺激活性也有利于对蛋白抗原的抗原-特异免疫应答的发展。对于各种需要强粘膜应签、高血清滴度、CTL诱导和强细胞应答反应的抗原、佐剂及细胞因子/淋巴因子组合提供了大多数抗原制品不能提供的刺激。
许多研究在动物模型中评估了不同的佐剂制剂，但铝(氢氧化铝或磷酸铝)是目前唯一得到许可广泛应用于人类的佐剂。另一个佐剂是StimulonTMQS-21(QS-21)(Antigenics Inc.，Framingham，MA(2))。一组佐剂、稳定的乳剂、含多种油包水或水包油组合，由于它们的免疫增强能力已受到了相当注意。这些制剂通常由可代谢的或惰性油的各种组合构成，这些油的作用是在注射处稳定和贮存抗原。一种这样的佐剂是包含矿物油、水和乳化剂的不完全弗氏佐剂(IFA)。完全弗氏佐剂(CFA)是IFA加上热-杀死分枝杆菌。特别注意的是使用这类佐剂可引起注射部位相关刺激，常常引起单个核细胞浸润导致肉芽肿损害。因此，正在研究可作为潜在佐剂的其他化合物和制剂。
一组此类化合物是氨烷基葡糖胺磷酸盐化合物(AGPs)，在美国专利号6,113,918中有所描述，例如第2列，14行至第3列，38行，将其纳入本文参考文献中(3)。AGPs具有氨烷基(苷元)团通过糖苷键连接于2-脱氧-2-氨基-α-D-吡喃(型)葡萄糖(葡糖胺)形成基本结构。进一步取代包括葡糖胺环4或6位碳的磷酸化和3个3-烷酰氧酰基残基。
一种AGP是命名为529(化学全称是2-[(R)-3-十四酰氧十四酰氨基]乙基2-脱氧-4-氧-磷酰基-3-氧-[(R)-3-十四酰氧十四酰]-2-[(R)-3-十四酰氧十四酰氨基]-β-D-吡喃(型)葡萄糖苷)的化合物，由Corixa生产(Hamilton，MT)。
Corixa也可配制一种可代谢的水包油制剂，当与529混合时，形成命名为529SE的稳定化乳剂。此稳定化乳剂通过用鲨烯油、甘油和磷脂酰胆碱显微流化529而产生。目前的制剂是GMP-合格的微流化乳剂。含1％油(尽管其它浓度也使用)的乳剂将在以下实验中描述。
当529 SE皮下给予Balb/c或Swiss-Webster小鼠时，不产生可辨别的总体组织病理。还制备了含相同成分但没有529的稳定化乳剂作比较。具体说，皮下免疫接种40个氨基酸的HIV肽T1SP10MN(A)的半胱氨酸缺失的39个氨基酸(40个氨基酸的肽(+Cys)其17位处半胱氨酸缺失)，或Aβ1-42(APP的内部42氨基酸片断)，各自与佐剂529 SE和GM-CSF组合配制，不产生可辨别的炎症、红肿、肿胀或硬结。
在本发明范围内还包括529和其它AGPs的衍生物及类似物。这些化合物包括，但不限于在美国专利号6,113,918中描述的化合物(3)。
将细胞因子和淋巴因子掺入到免疫原性组合物中显示出能扩增和提高该免疫原性组合物能力的良好前景(4)。细胞因子白细胞介素-12(IL-12)证明可激发和增强细胞介导免疫力，是通过将辅助T细胞亚群的扩增转变为Th1细胞因子分布类型(也就是在小鼠模式中向IgG2a亚类转变)(5-7)。在小鼠中，重组鼠IL-12显示能提高Th1占优势的免疫应答类型(4)。
IL-12由多种抗原呈递细胞主要是巨噬细胞和单核细胞产生。它是诱导原初T细胞成为TH1细胞的关键要素。产生IL-12或对它应答的能力，显示在保护性TH1类型应答的发展中起关键作用(例如，在寄生虫感染中，最著名的是利什曼病(8))，也增强对病原性细菌或病毒(9)、或癌细胞抗原(10)的细胞介导免疫应答。IL-12的作用很大程度上由NK细胞和辅助T细胞产生的干扰素-γ所介导。干扰素-γ对于诱导抗T-依赖性蛋白抗原的IgG2a抗体和抗T-不依赖性抗原的IgG3应答是关键的(12)。IL-12原来称为自然杀伤细胞刺激因子，是一种异二聚体细胞因子(13)。在重组宿主细胞中表达和分离IL-12蛋白在出版的国际专利申请WO90/05147中有所描述(14)。
另一有潜在希望作为佐剂的细胞因子是GM-CSF。GM-CSF是一类特殊的集落刺激因子(CSF)。CSFs是一个在骨髓中发现的能诱导祖代细胞分化成特殊种类的成熟血细胞的淋巴因子家族。如美国专利号5,078,996中描述(15)，将其纳入本文参考文献中，GM-CSF活化巨噬细胞或前体单核细胞而介导了非特异性肿瘤杀伤活性。编码人GM-CSF基因的核苷酸序列已有描述(15)。已将含GM-CSF cDNA的质粒转化入大肠杆菌并保存在美国模式培养物保藏所(ATCC)，10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，编号39900。如美国专利号5,229,496描述(16)，将其纳入本文参考文献中，也已将GM-CSF基因插入酵母表达质粒并保存于ATCC编号53157。另外，如美国专利号5,073,627描述(17)，将其纳入本文参考文献中，已取得编码含有糖基化位点的GM-CSF的DNA序列，保存在ATCC编号67231。
GM-CSF显示能上调抗原呈递细胞上的已知能增强免疫应答的蛋白分子(18)，并影响经分拣纯化的小鼠B细胞的Ig分泌(19)。也报道GM-CSF可用作免疫原组合物的佐剂。
其它细胞因子或淋巴因子显示有免疫调节活性，包括但不限于白细胞介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、13、14、15、16、17和18，干扰素-α、β和γ，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子及肿瘤坏死因子α和β。
与细胞因子或淋巴因子全身给药相关的问题是与细胞因子或淋巴因子活性相关的生物学结果。此外，如果能保持细胞因子或淋巴因子的局部浓度，应能增强细胞因子或淋巴因子辅助产生抗原特异性免疫应答的效果。
已评价了组合3-氧-脱酰单磷酰脂质A或单磷酰脂质a与GM-CSF或IL-12的效果；观察到多种免疫应答参数的提高(21)。
本发明以上所述显示通过抗原、选定的细胞因子或淋巴因子佐剂和第二佐剂AGP(优选稳定的可代谢性乳剂)的组合，抗原特异性免疫应答反应得到提高。
本发明的抗原组合物包括的选定抗原，包含蛋白质衍生肽或多肽、蛋白质以及以下任一物质的片段糖、蛋白、多或寡核苷酸或其它大分子成分。如本文所用的，“肽”包含一系列至少3个氨基酸并包含至少一个抗原决定簇或表位，“多肽”是比肽更长的分子，但不构成全长蛋白。可将这样的肽、多肽或蛋白质可偶联于一不相关的蛋白质，如破伤风类毒素或白喉毒素。如本文所用，“片断”包括糖、蛋白、多或寡核苷酸或其它大分子成分的一部分但不到全部。在HIV的情况下，本发明的抗原组合物还包含全长HIV蛋白。
本发明首先在采用HIV衍生的肽抗原模型体系中举例说明。这些肽的描述或衍生见美国专利5,013,548(22)和5,019,387(23)，将其纳入本文参考文献中并予以小结。已产生的这些肽含有对应于能诱导中和抗体和T细胞应答的HIV包膜蛋白其区域的氨基酸序列。
HIV是导致获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的一种人逆转录病毒。HIV通过其外包膜糖蛋白与T淋巴细胞表面CD4(T4)分子结合面感染免疫系统的T淋巴细胞，因此使用CD4(T4)分子作为受体进入和感染T细胞。通过免疫接种诱导对HIV-感染的特异性保护性免疫应答的尝试获得的成功非常有限。在尝试中目前使用了一些方法来确定该免疫原性组合物发展的有效和保护性策略。这些方法包括采用表达HIV表位减毒和重组细菌载体(24)、重组腺病毒(25)或牛痘病毒载体(26)、DNA免疫接种(27)和包含多种HIV的T和B细胞表位的合成肽(28)。
HIV外包膜糖蛋白gp120显示能够在人体中诱导中和抗体。编码整个gp120分子大约三分之一的重组蛋白PB1，显示包含了能诱导中和抗体形成的包膜蛋白部分。然而，黑猩猩的研究证明无论是完整的gp120还是PB1都不能诱导产生高滴度的中和抗体。
以常规方法合成了对应于gp120抗原决定簇并产生可中和病毒的抗体应答诱导抗病毒辅助T细胞和CTL应答的短肽。
这样一个肽是命名为T1SP10MN(A)(+Cys)的C4/V3含多表位的HIV-1MN肽和半胱氨酸缺失变种T1SP10MN(A)(-Cys)。这些肽包含有Th、TCTL和B抗原表位，但不诱导干扰CD4结合的抗体。以前已证明这些C4/V3 HIV肽当与CFA或CFA类似佐剂一起使用时，是诱导免疫应答的有希望候选物(29-34)。这些肽包含先前显示在小鼠和人中都能激发CD4+Th细胞应答的抗原表位，它含有一个主要的中和决定簇和Balb/c小鼠与人CD8+CTL识别的位点，在人中是HLA B7+。该39个氨基酸的肽近来证明在HIV感染病人中既有免疫原性又安全。
T1SP10MN(A)(+Cys)有如下序列的40氨基酸Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg IleHis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(31)(SEQ ID NO1)。
合成了在17位没有半胱氨酸的T1SP10MN(A)(-Cys)其有如下序列的39个氨基酸Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO2)。
此半胱氨酸残基位于Th细胞、CTL或B细胞识别的功能性表位的外侧。其它来自HIV病毒基因组不同区域的HIV肽在美国专利号5,861,243(35)、美国专利号5,932,218(36)、美国专利号5,939,074(37)、美国专利号5,993,819(38)、美国专利号6,037,135(39)、出版的欧洲专利申请号671,947(40)和美国专利号6,024,965(41)中有所描述，也纳入本文参考文献中。
也采用了命名为ST1/p11C的28氨基酸肽偶联物。此偶联物由名为ST-1的16个氨基酸的SIV env-衍生的辅助T肽组成，偶联于名为p11C的12个氨基酸的SIVmac 251 Gag肽(Gag的179-190氨基酸)上(42)。p11c肽的四聚体形式在SIV mac感染的Mamu-A*01恒河猴中显示出CTL活性(43)。ST1-p11C的肽偶联物有如下氨基酸序列Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val GlyLys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro TyrAsp Ile Asn Gln Met Leu(SEQ ID NO3)；也采用命名为C4-V389.6P的39个氨基酸的肽偶联物(44)。这个肽偶联物的C4区(16氨基酸)来自HIV-1包膜蛋白的第四恒定区且代表一通用的辅助T抗原表位。此肽的V3区(23氨基酸)来自HIV-1包膜蛋白的第三超变区且代表一关键中和决定簇。C4-V389.6P肽偶联物有如下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val GlyLys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn AsnThr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly ArgAla Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO4)。
HIV抗原可以是蛋白质、多肽、肽或上述蛋白质的片断。蛋白质可以是如gp41、gp120或gp160的糖蛋白。另外，该蛋白质可以是由如gag、pol、bif、rev、vpr、tat、nef或env基因编码的蛋白质。这些蛋白质衍生的肽将含至少一个长度至少为6个氨基酸的抗原决定簇(表位)。
对HIV肽的免疫应答反应可通过共价连接(偶联)该肽于药学上可接受的载体分子而提高。合适载体分子的例子包括破伤风类毒素、白喉毒素、钥孔血蓝蛋白和其它对应于HIV gp120糖蛋白T细胞表位的肽。
现在认为一个成功的抗HIV免疫接种策略需要激发对HIV的粘膜免疫力以及良好的CTL应答。近来一次小鼠研究采用T1SP10MN(A)多表位肽和粘膜佐剂(霍乱毒素)，显示鼻内免疫接种诱导了中和性血清IgG1抗体(45)。后来的研究也采用HIV-V3环肽，显示诱导了粘膜合成IgA抗体和强细胞介导应答反应，包括肽特异CTL(46)。高滴度的全身抗体和中和抗体在预防或稳定HIV感染个体中的功能作用还不知道，尽管高滴度病毒特异性抗体的据认为在防止病毒传播上有重要作用。
在本发明一较佳实施方式中，配制了含529的稳定水包油乳剂，然后与细胞因子IL-12或GM-CSF混合。下面给出的数据表明529加GM-CSF的组合产生了高滴度HIV-中和血清抗体。529和GM-CSF组合在免疫接种雌鼠的阴道拱顶中诱导了高滴度的抗原特异性IgG抗体，包括IgG1和IgG2a亚类。用与529SE和GM-CSF配制的T1SP10MN(A)(-Cys)肽免疫接种小鼠，诱导了强细胞免疫应答，提高了抗原特异性细胞增殖和细胞因子分泌入培养液中以及诱导了肽特异性CTL应答。类似的结果在小鼠用含529 SE和GM-CSF的APP的Aβ1-42肽免疫接种时也观察到。
通常，由529或529 SE混合GM-CSF或IL-12以及选择的蛋白或肽配制的抗原/佐剂制剂，可诱导高滴度抗原特异性抗体和病毒中和抗体，IgG亚类的比例明显转变为补体结合性IgG抗体(在小鼠中倾向IgG2a)占更大比例，在对体外抗原刺激的应答中，单个核细胞产生的细胞因子和细胞增殖升高。
529 SE的优点是此制剂在注射位置不诱导肉芽肿积聚和炎症；而通常油包水或水包油佐剂制剂诱导注射部位的反应。
做了一个实验以比较只给予HIV肽T1SP10MN(A)(-Cys)和529 SE，或529 SE加IL-12，或529 SE加GM-CSF的效果。
在这个实验中(下表1)，Balb/c小鼠用与529 SE配制的HIV肽T1SP10MN(A)(-Cys)皮下免疫，只注射了两次后诱导了肽特异性血清IgG滴度。也诱导了IgG1和IgG2a亚类滴度。包括第二个佐剂，GM-CSF或IL-12时，提高了IgG总滴度和IgG1亚类滴度。加入IL-12提高了IgG2a亚类滴度；而加入GM-CSF不提高IgG2a亚类滴度。
在另一实验中，作为功能性细胞倡导免疫力的衡量参数，评估了用529 SE，或529SE加IL-12，或529 SE加GM-CSF，与多表位肽T1SP10MN(A)(-Cys)一起配制免疫接种小鼠的脾细胞产生HIVMN特异CTL应答的能力。
如表2所示，用任何佐剂免疫接种的小鼠脾细胞，显示出对未标记或用不相关IIIB CTL表位脉冲标记的靶细胞的低活性。而当给予529 SE加IL-12时与只用529 SE比较，HIVMN特异性CTL介导的靶细胞裂解显著增加，且当给予529 SE加GM-CSF时仍会进一步增加(表2)。
在另一实验中，恒河猴用ST1-p11C或C4-V389.6P肽和IFA或529 SE加GM-CSF免疫(表15所示各组)。分析的结果列在表16-22中并予以小结。
ST1-p11C肽制剂本身似乎在所有试验动物中耐受性良好。然而，与佐剂IFA一起使用时注意到有显著的注射部位反应。此外，佐剂制剂529 SE/GM-CSF可能的微弱副作用在末次免疫接种后可立即观察到。含IFA的ST1-p11C肽制剂能在两只Mamu-A*01阳性实验恒河猴之一中诱导出强p11C特异性细胞免疫应答。含529SE/GM-CSF的ST1-p11C肽制剂也能在两只Mamu-A*01阳性实验恒河猴之一中诱导出p11C特异性细胞免疫应答。
含IFA的C4-V389.6P肽制剂能产生滴度范围1∶25,600-1∶102,400的血浆ELISA抗体峰和抗SHIV89.6及SHIV89.6P中和抗体滴度。含529 SE/GM-CSF的C4-V389.6P肽制剂能产生滴度范围1∶6,400-1∶12,800的血浆ELISA抗体峰和对SHIV89.6但不cfSHIV89.6P的低水平中和抗体应答。
鉴于每组动物数量少(2只)，得出具体的结论很困难。然而，含529 SE/GM-CSF的二种肽制剂产生的免疫应答(包括体液和细胞)水平，在定性上比采用IFA佐剂的动物观察到的免疫应答低。经常需要注意的是IFA在用于人的商品化组合物中是还未获批准的成分。此外，一些有限的证据表明应答细胞的功能特性和表型(也就是细胞因子分布)可能取决于使用的佐剂制剂而不同。
在另一次实验中，第二种灵长类的动物短尾猿，用9号氨基酸残基谷氨酸变为缬氨酸修饰的C4-V389 6P肽免疫接种。所得的肽偶联物，命名为C4(E9V)-V389.6P，有如下序列Lys G1n Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val GlyLys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn AsnThr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly ArgAla Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO5)。
动物用C4(E9V)-V389.6P肽免疫接种，没有佐剂或与529 SE加GM-CSF组合。
结果表明C4(E9V)-V389.6P肽当与529 SE/GM-CSF组合作肌肉注射时激发的血清肽特异性IgG滴度远高于同样剂量的C4(E9V)-V389.6P肽在没有佐剂时注射肌肉(图7-9)所获得的。这个实验的结果清楚证明当与适当佐剂组合联用时，HIV肽免疫原能诱导全身体液免疫。
预防或治疗脊椎动物宿主以淀粉样沉积(自体分子)为特征的疾病的理想免疫原性组合物，包含本发明的佐剂组合，包括含有β淀粉样前体蛋白(APP)部分的那些组合物。此疾病名称多样，如阿尔茨海默氏病，淀粉样变性病或淀粉样遗传病。β-淀粉样肽(也称为Aβ肽)是APP的内部的39-43个氨基酸的片断，由β和γ分泌酶加工APP而产生。Aβ1-42肽有如下序列Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His HisGln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn LysGly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala(SEQ ID NO6)。
在一些病人中，淀粉样沉积采取聚集的Aβ肽形式。令人惊讶的事，现在发现给予分离的Aβ肽在脊椎动物宿主中诱导了对淀粉样沉积物的Aβ肽成分的免疫应答(47)。因此，本发明的免疫原性组合物包括本发明的佐剂组合加Aβ肽以及Aβ肽的片断、衍生物或修饰以及抗Aβ肽或其片断、衍生物或修饰的抗体。一种这样的Aβ肽片断是有如下序列的28个氨基酸肽(48)Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His HisGln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys(SEQ ID NO7)。
其它感兴趣的Aβ肽片断包括但不限于氨基酸1-10、1-7、1-6、1-5、3-7、1-3和1-4，它们可以非偶联形式或与不相关蛋白偶联后给予。
用Aβ1-42肽和多种佐剂进行了一系列研究。现在介绍其结果总结。
在第一个实验中，Swiss-Webster小鼠在臀部用Aβ1-42肽皮下免疫接种产生肽特异性抗体IgG、IgG1和IgG2a滴度，证明Aβ1-42肽是可行的候选抗原。加入GM-CSF到529 SE和Aβ1-42肽中导致血清抗体IgG、IgG1和IgG2a滴度比接受529 SE和Aβ1-42肽的小鼠增加(见表3-8)。接受529 SE加GM-CSF组合各小鼠的血清抗体比只接受529 SE各小鼠增加更多且上升更快(数据未列出)。当第一个实验用年纪较大的Swiss-Webster小鼠(6-8个月而不是小于3个月)重复时，观察到了与表3-8类似的结果(数据未列出)。
在第二个实验中，Swiss-Webster小鼠在臀部用Aβ1-42肽和529 SE与不同剂量GM-CSF皮下免疫接种。IgG终点滴度随着GM-CSF量增加(从0.1到1到10μg)以剂量依赖方式提高(表9)。所有529 SE加GM-CSF组合的IgG滴度比只接受另一种佐剂QS-21或和GM-CSF一起要高。不同的529 SE加GM-CSF组小鼠的IgG1亚类滴度与第一次剂量接受529 SE加GM-CSF和第二剂量只接受529 SE的组(表10)相比也增加。不同的529 SE加GM-CSF组小鼠的IgG2a亚类滴度以剂量依赖方式与只接受529 SE的组相比也上升(表11)。
在第三个实验中，Swiss-Webster小鼠在臀部用Aβ1-42肽和529 SE在有或没有不同剂量GM-CSF的情况下皮下免疫接种。不同529 SE加GM-CSF组小鼠的IgG(0.5到2到5到10μg)终点滴度增加，尽管不以剂量依赖方式(表12)。不同529 SE加GM-CSF组小鼠的IgG1和IgG2a亚类滴度与只接受529 SE的组相比也提高，尽管不以剂量依赖方式(表13[IgG1]和14[IgG2a])。
在第四个实验中，使用了表达变体形式的在717残基有一突变(缬氨酸被苯丙氨酸替代)的β-淀粉样前体蛋白(APP)转基因小鼠。此突变与人类家族性阿尔茨海默氏病相关。这些转基因小鼠(命名为PDAPP小鼠)逐渐地产生出许多阿尔茨海默氏病的病理特征，包括Aβ沉积、神经炎斑块和星形胶质细胞增生，因此可作为人类阿尔茨海默氏病的动物模式。
在此第四个实验中，PDAPP小鼠用Aβ1-42肽与或不与佐剂以表A中列出的剂量皮下免疫接种。具体说，组1小鼠接受Aβ1-42肽和MPLTM(Corixa，Hamilton，MT)以稳定的乳剂形式(SE)作为阳性对照；组2小鼠接受Aβ1-42肽和MPLTMSE加小鼠GM-CSF；组3小鼠接受Aβ1-42肽和529 SE加小鼠GM-CSF；组4小鼠接受PBS作为阳性对照。组2和3表现出更迅速的抗Aβ1-42抗体滴度值增加和比组1或4更高的峰值。然而，组2和3的滴度在2-3个月内跌回组1阳性对照相等的滴度(图A)。当与组4阴性对照相比时，组1、2、3显示ELISA测定的脑Aβ水平大幅下降(表B-C和图B-C)，淀粉样负担减少(表D和图D)和神经炎性营养失调减低(表E和图E)。组2和3与组1阳性对照相比星形胶质细胞增生显著减少(图F)。
因此，529 SE和GM-CSF或IL-12的佐剂性能当一起配制时看来是互相促进的。
本发明的抗原组合物在给予该组合物后通过提高脊椎动物宿主抗体应答和细胞介导免疫力而调节了免疫应答。该抗原组合物包含选自病原性病毒、细菌、真菌或寄生虫的抗原，和有效剂量的AGP佐剂，如529(以水合或稳定乳剂形式)与细胞因子或淋巴因子，特别是GM-CSF或IL-12的组合。显示有免疫调节活性的其它细胞因子或淋巴因子，包括但不限于，白细胞介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、13、14、15、16、17和18，干扰素-α、β和γ，粒细胞集落刺激因子，肿瘤坏死因子α和β。
某些细胞因子或淋巴因子的激动剂或拮抗剂也在本发明的范围内。如本文所用，术语“激动剂”意味以上述细胞因子或淋巴因子的同样方式提高活性或功能的分子。这种激动剂的一个例子是上述细胞因子或淋巴因子的模拟物。如本文所用，术语“拮抗剂”意味能抑制或防止上述细胞因子或淋巴因子活性的分子。这种拮抗剂的例子是可溶性IL-4受体和可溶性TNF受体。
如本文所用，术语“有效的辅佐剂量”意味上述的佐剂组合的剂量，适于在脊椎动物宿主中诱导对所选抗原的免疫应答比，接受无佐剂的所选抗原的宿主要强。具体的剂量部分取决于宿主的年龄、体重和医学状况及使用方法和抗原。在一较佳的实施方式中，佐剂组合采用0.1-500μg/每剂范围的529。在更优选的实施方式中，该范围是1-100μg/每剂。合适的剂量本领域技术人员不难确定。本发明的抗原组合物可与免疫学上可接受的稀释剂或载体以传统方式混合，以制备可注射的液体溶液或悬浮液。
本发明的抗原或免疫原性组合物可通过多种途径注入人体或非人脊椎动物，包括但不限于，鼻内、口、阴道、直肠、肠胃外、皮内、诱皮(见纳入本文参考文献的国际申请WO98/20734(50))、肌肉、腹膜内、皮下、静脉内和动脉内。该抗原组合物的抗原成分量部分根据抗原性质而不同，也取决于宿主的年龄，体重和医学状况及给予方法。另外，本领域技术人员不难确定合适的剂量。优选同时给予抗原和佐剂的组合尽管并不要求。本领域技术人员也不难确定该抗原组合物的剂量数和剂量方案。在一些情况下，佐剂组合的佐剂特性也许会减少需要的剂量数或剂量方案的时间要求。
本发明的佐剂组合适合用于抗原性或免疫原性组合物，包括各种病源性微生物的各种抗原，包括但不限于感染人和非人脊椎动物的病毒、细菌、真菌或寄生性微生物，或癌细胞或肿瘤细胞的抗原。抗原可包括蛋白质衍生的肽或多肽，和以下任何物质的片段糖、蛋白、多或寡核苷酸、癌或肿瘤细胞、过敏原、自体分子(例如淀粉样前体蛋白)或其它大分子成分。在一些情况下，该抗原组合物中可包含一种以上的抗原。
包含本发明佐剂组合的理想的病毒免疫原性组合物，包括但不限于预防和/或治疗由下列病毒引起的疾病人类免疫缺陷病毒、猿免疫缺陷病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒1-3型、流感病毒、单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、杯状病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、腺病毒、狂犬病毒、犬瘟热病毒、牛瘟病毒、人肺炎后病毒、禽肺炎病毒(以前的火鸡鼻气管炎病毒)、Hendra病毒、Nipah病毒、冠状病毒、细小病毒、有传染性鼻气管炎病毒、猫白血病病毒、猫传染性腹膜炎病毒、禽传染性囊病病毒、新城设病毒、Marek’s病病毒、猪呼吸和生殖综合症病毒、马动脉炎病毒和各种脑炎病毒。
包含本发明佐剂组合的理想的细菌免疫原性组合物，包括但不限于预防和/或治疗由以下细菌引起的疾病流感嗜血杆菌(典型和非典型)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、生脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳泌缺乏链球菌(Streptococcus agalactiae)、粪肠球菌(Streptococcus faecalis)、幽门螺酐菌(Helicobacter pylori)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisserisameningitidis)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci)、百日咳博徳特菌(Bordetella pertussis)、Alloiococcus otiditis、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、霍乱沙门菌(Salmonella choleraesuis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、志贺菌(Shigella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、白喉棒状杆菌(Corrynebacteriumdiphtheriae)、结核病分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、贪食分枝杆菌-胞内分枝杆菌复合体(Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellularecomplex)、奇异变形菌(Proteus mirabilis)、普通变形菌(Proteus vulgaris)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、破伤风杆菌(Clostridum tetani)、问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)、布氏疏螺旋体(Borrelia bugdoferi)、溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuopneumoniae)和支原体(Mycoplasmagallisepticum)。
包含本发明佐剂组合的理想的抗真菌免疫原性组合物包括但不限于预防和/或治疗由以下真菌引起的疾病，曲霉菌(Aspergillis)、芽生菌(Blastomyces)、假丝酵母菌(Candida)、球孢子菌(Coccidiodes)、隐球菌(Cryptococcus)和组织胞浆菌(Histoplasma)。
包含本发明佐剂组合的理想的抗寄生虫免疫原性组合物包括但不限于预防和/或治疗由以下寄生虫引起的疾病，利什曼原虫major(Leishmania major)、蛔虫(Ascaris)、鞭虫(Trichuris)、贾第鞭毛虫(Giardia)、血吸虫(Schistosoma)、似隐孢菌(Cryptosporidium)、滴虫(Trichomonas)、鼠弓浆虫(Toxoplasmagondii)、肺囊虫(Pneumocystis carinii)。
诱导脊椎动物宿主治疗性或预防性抗癌作用的理想免疫原性组合物包含本发明佐剂组合，包括那些使用癌抗原或肿瘤相关抗原的组合物包括但不限于前列腺特异抗原、癌胚抗原、MUC-1、Her2、CA-125和MAGE-3。
用于在脊椎动物宿主中调节对过敏原应答的理想免疫原性组合物包含本发明佐剂组合，包含过敏原及其片断的组合物。这些过敏原的例子在美国专利号5,830,877(51)和出版的国际专利申请号WO99/51259(52)中有所描述，本文纳入作为参考文献，包括花粉、昆虫毒液、动物头皮屑、真菌孢子和药物(例如青霉素)。此种免疫原性组合物可干扰已知是过敏反应原因的IgE抗体产生，。
用于在脊椎动物宿主中调节对自体分子应答反应的理想的免疫原性组合物包含本发明的佐剂组合，包括那些含自体分子或其片断的组合物。这类自体分子的例子除了上面描述过的Aβ1-42肽外，包括参与糖尿病的β链胰岛素、参与胃食管逆流病的G17分子和下调诸如多发性硬化、狼疮和风湿性关节炎等疾病自身免疫反应的抗原。
在HIV和SIV的情况中，此抗原组合物包括至少一种蛋白质、多肽、肽或上述蛋白质的片断。在一些情况下，该抗原组合物包含多个HIV或SIV蛋白、多肽、肽和/或片断。
本发明的佐剂组合制剂也适于作为多核苷酸免疫原性组合物(也称为DNA免疫原性组合物)的佐剂。这种免疫原性组合物还可包括促进剂如bupivicaine(见美国专利号5,593,972(53))，纳入本文的参考文献中。
为更好了解本发明，设置了下列实施例。这些实施例只是描述而不构成对本发明范围的限制。
实施例实施例1材料和方法在下面的实施例2-7中报道的实验中使用了下列材料和方法。
动物雌性Balb/c小鼠，7-9周龄，从Taconic Farm有限公司购买(德国城，纽约)。雌性Swiss-Webster小鼠，7-9周龄，也从Taconic Farm有限公司购买。所有的小鼠饲养在由美国实验动物保护协会批准的设施中。小鼠在研究开始一周前适应居宿设施。
抗原在下面实施例2-3的HIV实验中，使用了两种不同合成肽。多表位HIV-1-MN肽T1SP10MN(A)(-Cys)(在此称也为MN10)的序列如下Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO2)。此肽前面已描述过(33，34)，包含能激发小鼠和人CD4+Th细胞应答的HIV-1 gp120MN的序列、主要中和决定簇和Balb/c小鼠中CD8+CTL识别位点。此肽由R.Scearce博士提供(杜克大学，Durham，NC)。在CTL分析中，一命名为IIIB的不相关肽用于比较，此肽对应于HIV-1-IIIBV3环内的CTL表位(Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe ValThr Ile((SEQ ID NO8))，从Genosys生物技术有限公司购买(Woodlomds，德克萨斯)。使用前，将肽溶于无菌水中，以适当缓冲液或细胞培养基稀释。
在下面实施例4-6的淀粉样实验中，使用了命名为Aβ1-42的肽。Aβ1-42的序列如下Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His HisGln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn LysGly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala(SEQ ID NO6)。
此肽前面已描述过(47)，对应于淀粉样前体蛋白一内部的42个氨基酸片断。Aβ1-42由Elan制药所提供(南旧金山，加州)。使用前，将此肽溶于无菌水中，适当缓冲液或细胞培养基稀释。
佐剂所有含529的佐剂制品购自Corixa(Hamilton，MT)。以基于水包油(0.8-2.5％)乳剂预先配制的鲨烯制备529 SE，529浓度范围从0至-50μg。磷酸铝由本室准备。完全弗氏佐剂(CFA)和不完全佐剂(IFA)从Difco实验室，底特律，密歇根购买。T1SP10MN(A)肽和弗氏佐剂用两个相连注射器以1∶1比例乳化。重组表达的小鼠IL-12由Genetics硬度所提供(剑桥，MA)。重组小鼠GM-CSF购自BiosourceIntornation)(Camarillo，加州)作为无载体冻干粉。StimulonTMQS-21购自Antigenics有限公司(Framingham，MA)。
免疫接种臀部皮下免疫小鼠，0.2ml总体积平分用于臀部每侧。免疫接种如下面所示在不同的时间间隔进行。免疫接种前不到16小时在无菌条件下，将抗原和细胞因子以磷酸盐缓冲液稀释到适当浓度并加佐剂制备。将免疫原性组合物温和搅动混合，储存在4℃。在免疫前立即振荡混合制备。
用酶联免疫吸附试验分析血清动物在初次免疫前和标明的时间点采血。以各小鼠抗体滴度的几何平均值分析血清。为分析HIV肽特异性抗体和亚类分布，钭肽悬浮于碳酸盐缓冲液(15mMNa2CO3，35mM NaHCO3，pH9.6)或PBS中，浓度为1μg/ml，并以100∶1加入96孔微量滴定板(Nunc)中。37℃培育过夜后，洗板并室温封闭(0.1％明胶/PBS)2-4小时。用洗涤缓冲液(PBS，0.1％TweenTM20)洗涤ELISA板，然后加入系列稀释的血清(PBS，0.1％明胶，0.05％TweenTM20，0.02％叠氮化钠)。培育四小时后，洗孔并加入适当稀释的生物素化抗同型/亚类抗体，4℃培养过夜。洗孔并用链霉亲和素偶联的辣根氧化物酶温育。温育后洗孔并用ABTS显色。读取诸孔405nm。滴定度用对照血清标准化。
同样的操作用于分析Aβ1-42肽特异性抗体和亚类分布，除了使用浓度为0.3μg/ml的每微量滴定板外。
细胞准备对于增残试验和体外细胞因子分析，在标明的时间点从小鼠获得脾细胞。单细胞悬浮液合并3-5个小鼠的细胞而制备。对于增殖和细胞因子分析，将细胞悬浮在用HIV抗原、对照蛋白或只有RPMI预包被过应的圆形底96孔培养板中。用含2X补充物的培养基以5×105细胞/孔加入脾细胞。培养开始后3或6天从三分之一孔收集细胞培养上清液用于细胞因子分析。收集上清液后，培养物立即用3H-胸苷脉冲18-24小时，收集之以定量细胞增殖。
实施例2相应的抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG终点总滴度和亚类滴度在初次免疫接种后5周、第二次免疫接种后2周从合并的血清(n＝5 Balb/c)测定于相应的终点IgG亚类滴度。小鼠在臀部用25μg T1SP10MN(A)(-Cys)皮下免疫接种，0.2ml总体积平均分成两个0.1ml在0和3周注射于各侧。稀释529 SE以产生含每剂量1.25％鲨烯油和25μg 529的乳剂。SE是含鲨烯、甘油和乳化剂的水包油乳剂载体。重组小鼠IL-12以40ng/小鼠给予。重组小鼠GM-CSF以25μg/小鼠给予。结果在表1中列出，和各组的几何平均滴度加标准误差。
表1相应的抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG终点总滴度和亚类滴定度终点滴度佐剂 μg HIV肽IgG IgG1 IgG2a529(25)SE25 206,301 37,567 180,671(1.25％油)+/- +/- +/-175,149 31,526 277,211
529(25)SE 25460,516 74,269 222,446(1.25％油)+ +/- +/- +/-rIL-12(.04) 690,712 169,868 400,716529(25)SE 251,085,658 238,379 117,657(1.25％油)+ +/- +/- +/-GM-CSF(25) 1,064,924 62,199 25,301实施例3Balb/c小鼠的CTL分析免疫接种小鼠按实施例2的操作方案。评估了第二次免疫接种后14天小鼠的分离脾细胞的CTL活性。529 SE用25μg含1.25％油的529 SE加或不加10μgGM-CSF或40ngIL-12，和25μgT1SP10MN(A)(-Cys)配制。
从第二次免疫接种后14天的免疫接种小鼠分离脾细胞用于CTL分析。基本按照前面描述的操作(39)进行。简单说，收集每组3只小鼠的剔除红细胞-的脾细胞。脾效应细胞(4×106/ml)在24孔培养板1.5-2ml体积以1μg/ml“MN-10”肽(“IIIB”10mer CTL抗原表位肽)或无HIV肽再刺激7天。CTL抗原表位限于H-2Dd。培养物于最后5天培养中添加了10U/ml的重组小鼠IL-12(Biosource)。为分析细胞毒活性，P815细胞用Cr51标记并用5μg/ml肽(IIIB或MN-10)脉冲4小时，加入到培养的脾效应细胞中。当不用HIV肽时，不脉冲那批靶细胞。使用3倍稀释的效应细胞对靶细胞比例(“E∶T”)，从30∶1到1.1∶1。以铬释放百分比计算CTL活性百分比采用((特异性铬释放-自发铬释放)/(最大铬释放-自发铬释放))×100。经6小时培育后评估铬释放。平均自发铬释放总是低于15％的最大铬释放。第28天的数据结果列于表2。
表2效应细胞对靶细胞的比例

*不加佐剂实施例4相应的抗Aβ1-42IgG终点总滴度和亚类滴度将远交Swiss-Webster小鼠分成每组10只。每组接受30μg对应于APP的一内部42个氨基酸长区域的Aβ1-42肽。第一组不接受佐剂；第二组接收50μg含2.5％油的529 SE；第三组接受50μg含2.5％油的529 SE加10μgGM-CSF；第四组接受10μgGM-CSF；第五组接受含1.25％油的SE；第六组接受含1.25％油的SE加10μgGM-CSF第七组接收50μg QS-21。小鼠在臀部皮下免疫接种，0.2ml总体积平分接种到尾/臀底部的两个位点。免疫接种在第0和3周进行。
小鼠在第0、20、35和70天采血。分析各个小鼠的血清。第5和10周测定了各血清(n＝10 Swiss-Webster)相应的抗Aβ1-42肽IgG终点滴定和亚类滴度。IgG终点结果在表3(第5周)和表4(第10周)中给出。IgG1亚类结果在表5(第5周；未接受佐剂或QS-21的组没有测定)和表6(第10周)中给出。IgG2a亚类结果在表7(第5周；未接受佐剂或QS-21的组没有测定)和表8(第10周)给出。
表3抗Aβ1-42第5周IgG终点滴度佐剂 几何平均值 标准误差无12,976 +/-14,386529 SE(50)16,204 +/-225,221529 SE(50)+GM-CSF(10) 608,474 +/-623,575GM-CSF(10)214,497 +/-609,067SE(1％) 33,342 +/-15,493SE(1％)+GM-CSF(10)453,367 +/-162,750QS-21(50) 4,076 +/-9,036表4抗Aβ1-42第10周IgG终点滴度佐剂几何平均值 标准误差无 21,426 +/-24,959529 SE(50) 86,847 +/-187,792529 SE(50)+GM-CSF(10) 943,075 +/-989,177GM-CSF(10) 1,049,414 +/-390,525SE(1％) 255,631 +/-114,025SE(1％)+GM-CSF(10) 1,005,899 +/-407,108QS-21(50) 47,222 +/-159,775
表5抗Aβ1-42第5周IgG1终点滴度佐剂几何平均值 标准误差529 SE(50) 461 +/-627529 SE(50)+GM-CSF(10) 1,936 +/-12,680GM-CSF(10) 8,654 +/-10,100SE(1％) 4,515 +/-6,273SE(1％)+GM-CSF(10) 24,422 +/-19,764表6抗Aβ1-42第10周IgG1终点滴度佐剂几何平均值 标准误差无 2,086 +/-2,448529 SE(50) 969+/-521529 SE(50)+GM-CSF(10) 2,076 +/-4,901GM-CSF(10) 8,483 +/-10,998SE(1％) 3,623 +/-3,456SE(1％)+GM-CSF(10) 12,472 +/-11,502QS-21(50) 988+/-895表7抗Aβ1-42第5周IgG2a终点滴度佐剂几何平均值 标准误差529 SE(50) 2,224 +/-10,099529 SE(50)+GM-CSF(10) 94,764 +/-849,173GM-CSF(10) 25,554 +/-13,191SE(1％) 1,484 +/-2,271SE(1％)+GM-CSF(10) 8,405 +/-31,303表8抗Aβ1-42第10周IgG2a终点滴度佐剂几何平均值 标准误差无 5,910 +/-39,626529 SE(50) 5,944 +/-9,100529 SE(50)+GM-CSF(10) 47,694 +/-88,053GM-CSF(10) 64,910 +/-54,824SE(1％) 2,350 +/-2,326SE(1％)+GM-CSF(10) 7,421 +/-31,153QS-21(50) 3,544 +/-26,332
实施例5以不同剂量GM-CSF接种时相应的抗Aβ1-42终点总滴度和亚类滴度将远交Swiss-Webster小鼠分成每组10只。每组在第0和3周接受两次30μgAβ1-42肽免疫接种。第一组接受25μg529 SE加10μg GM-CSF；第二组接受25μg529加1μg GM-CSF；第三组接受25μg529 SE加0.1μg GM-CSF；第四组在首次剂量时接受25μg529 SE加10μg GM-CSF，随后在第二次剂量时只接受25μg529 SE；第五组接受25μg QS-21；第六组接受25μg QS-21加10μg GM-CSF。小鼠在臀部皮下免疫接种，0.2ml总体积平分接种到尾/臀底部两个位点。
小鼠在第0、21和42天采血。第6周测定各血清(n＝10)相应的终点抗Aβ1-42肽IgG类和亚类滴度。IgG终点结果在表9中给出。IgG1亚类结果在表10中给出。IgG2a亚类结果在表11中给出。
表9抗Aβ1-42第6周IgG终点滴度佐剂 几何平均值标准误差529 SE(25)+GM-CSF(10) 353,660 +/-148,940529 SE(25)+GM-CSF(1) 150,935 +/-218,332529 SE(25)+GM-CSF(0.1)86,145+/-91,724529 SE(25)* 25,365+/-54,083QS-21(25) 1,866 +/-18,430QS-21(25)+GM-CSF(10) 48,970+/-116,106*第一次剂量529 SE(25)+GM-CSF(10)；第二次剂量只有529 SE(25)表10抗Aβ1-42第6周IgG1终点滴度佐剂 几何平均值 标准误差529 SE(25)+GM-CSF(10) 10,867 +/-18,333529 SE(25)+GM-CSF(1) 24,909 +/-18,625529 SE(25)+GM-CSF(0.1) 6,608 +/-17,736529 SE(25)*4,511 +/-8,154QS-21(25) 581 +/-126QS-21(25)+GM-CSF(10) 7,618 +/-29,145*第一次剂量529 SE(25)+GM-CSF(10)；第二次剂量只有529 SE(25)
表11抗Aβ1-42第6周IgG2a终点滴度佐剂 几何平均值 标准误差529 SE(25)+GM-CSF(10) 243,758 +/-354,383529 SE(25)+GM-CSF(1) 116,222 +/-143,140529 SE(25)+GM-CSF(0.1)98,018 +/-391,797529 SE(25)* 16,018 +/-165,298QS-21(25) 没做+/-没做QS-21(25)+GM-CSF(10) 30,133 +/-134,774*第一次剂量529 SE(25)+GM-CSF(10)；第二次剂量只有529 SE(25)实施例6以不同剂量GM-CSF接种时相应的抗Aβ1-42终点总和亚类滴度将远交Swiss-Webster小鼠分成每组10只。每组在第0和3周接受免疫接种，每次用30μg Aβ1-42肽。在第0周免疫接种时，第一组接受50μg529 SE；第二组接受50μg529加10μg GM-CSF；第三组接受50μg529 SE加5μg GM-CSF；第四组接受50μg529 SE加2μg GM-CSF；第五组接受50μg 529SE加0.5μg GM-CSF；第六组接受1％SE。在第3周免疫接种时，第一到第五组接受与第0周免疫接种相同的剂量，除了将529 SE从50μg减少至25μg。第六组接受的SE量从第0周免疫接种的1％增加到第三周免疫接种的1.2％。小鼠在臀部皮下免疫接种，0.2ml总体积平分接种到尾/臀底部两个位点。
小鼠在第2、20和35天采血。在第5周测定各血清(n＝10)相应的终点抗Aβ1-42肽IgG类和亚类滴度。IgG终点结果在表12中给出。IgG1亚类结果在表13中给出。IgG2a亚类结果在表14中给出。
表12抗Aβ1-42第5周IgG终点滴度佐剂 几何平均值 标准误差529 SE(50)6,119 +/-3,103529 SE(50)+GM-CSF(10) 52,312 +/-78,421529 SE(50)+GM-CSF(5) 16,392 +/-17,706529 SE(50)+GM-CSF(2) 321,524+/-224,875529 SE(50)+GM-CSF(0.5)36,934 +/-29,449SE(1％) 7,784 +/-9,041
表13抗Aβ1-42第5周IgG1终点滴度佐剂 几何平均值 标准误差529 SE(50)499+/-676529 SE(50)+GM-CSF(10) 1,424 +/-2,468529 SE(50)+GM-CSF(5) 3,407 +/-5,653529 SE(50)+GM-CSF(2) 18,328 +/-8,067529 SE(50)+GM-CSF(0.5)3,526 +/-17,606SE(1％) 2,556 +/-5,615表14抗Aβ1-42第5周IgG2a终点滴度佐剂 几何平均值 标准误差529 SE(50)1,386 +/-5,173529 SE(50)+GM-CSF(10) 48,519 +/-148,981529 SE(50)+GM-CSF(5) 11,659 +/-23,132529 SE(50)+GM-CSF(2) 124,815+/-167,340529 SE(50)+GM-CSF(0.5)26,190 +/-40,254SE(1％) 694+/-1,325实施例7恒河猴的Th-CTL和C4-V3肽免疫接种设计了下面的实验用于直接比较一些肽和佐剂组合制剂在灵长类动物(恒河猴)中的效果以鉴定可能的肽/佐剂组合从而向人临床试验推进。具体是，将佐剂制剂529 SE和人GM-CSF与不完全弗氏佐剂(IFA)作比较进行评估，结合(1)具有如下序列的SIV env-衍生的辅助T/SIV gag CTL肽偶联物(ST1-p11C)Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val GlyLys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro TyrAsp Ile Asn Gln Met Leu(SEQ ID NO3)或(2)具有如下序列的HIV-1衍生的C4-V3肽偶联物(C4-V389.6P)Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val GlyLys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn AsnThr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly ArgAla Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO4)
研究设计总共8只动物用于研究，如表15描述的4只Mamu-A*01+和4只Mamu-A*01-。
表15529 SE & GM-CSF与IFA相比分组# #动物 动物 免疫原性组合物佐剂1 2Mamu-A01+95X009ST1-p11C IFA93X0212 2Mamu-A01+98N002ST1-p11C 529 SE/GM-CSF98N0083 2Mamu-A01-98N007C4-V389.6PIFA98N0134 2Mamu-A01-95X011C4-V389.6P529 SE/GM-CSF96X004组1动物接受0.5ml Th-CTL肽ST1-p11C(1.0mg/ml)与0.5ml IFA制成油包水乳剂，总体积1.0ml。组2动物接受0.5ml ST1-p11C(1.0mg/ml)，加250μg人GM-CSF和50μg529 SE总体积1.0ml，最终油浓度为1％。组3动物接受0.5ml C4-V389.6P肽(2.0mg/ml)与0.5ml IFA制成油包水油乳剂，总体积1.0ml。最后组4动物接受0.5ml C4-V389.6P肽(2.0mg/ml)加250μg人GM-CSF和50μg529 SE总体积1.0ml，终油浓度为1％。
所有动物按第0、4和8周的时间表进行肌肉注射免疫接种。在每次免疫接种前马上和之后1或2周采取外周血样品，通过四聚物染色、p11C(Cys Thr Pro TyrAsp Ile Asn Gln Met；SEQ ID NO3，氨基酸19-27)-特异性ELISPOT反应和大批量培养CTL反应(组1和2)以及用于肽特异抗体应答(组1-4)监测CTL诱导。
安全和耐受性ST1-p11C+IFAST1-p11C+IFA制剂在组1动物一部位3次肌肉注射伴有，显著的注射部位反应。一动物(93x021)第二次免疫接种后两周在注射部位发生了1.5cm大小脓肿。另一动物(95x009)也在第三次穿透皮肤和需要敷料的免疫接种后两周在注射部位发生了2cm大小脓肿。
ST1-p11C+529 SE/GM-CSFST1-p11C+529 SE/GM-CSF制剂在组2动物一位置3次肌肉注射伴有微弱的副作用。组2二只动物在第8周接受第三次免疫接种后不久都呕吐。没有发现其它的副作用。
C4-V389.6P+IFAC4-V389.6P+IFA制剂在组3动物一位置3次肌肉注射，伴有显著的注射部位反应。一动物(980n013)第二次免疫接种后一周在注射部位发生了1.0cm大小脓肿。另一动物(98n007)在第二次免疫后一周注射部位也出现31.5cm大小脓肿，此动物的脓肿四周后需要引流和敷料包扎。
C4-V389.6P+529 SE/MC-CSFC4-V389.6P+529 SE/GM-CSF制剂在组4动物一位置3次肌肉注射伴有一微弱的副作用。组4动物之一(95x011)在第8周接受第三次免疫接种后不久呕吐。没有发现其它的副作用。
在所有接受IFA作为佐剂的组1和组3的动物中，观察到显著的注射部位反应。这些结果表明0.5ml IFA在一位置肌肉注射给予时耐受性差。同样值得注意的是接受529 SE/GM-CSF作为佐剂的4只动物中3只在第8周免疫接种后不久呕吐。尽管所用麻醉剂(克他命)已知伴有呕吐，但研究过程中没记录到其它的动物呕吐情况。此时，存在的证据不足以将动物呕吐归因于529 SE/GM-CSF相关的副作用。
结果细胞免疫应答反应(组1和2)的诱导新鲜血液p11C-四聚物染色免疫前、免疫后1和2周，用可溶MHC I型四聚物染色，筛选所有Mamu-A*01阳性动物(组1和2)的新鲜分离外周血液是否存在p11C特异CD3+CD8+T淋巴细胞。如表16所示，只有一只接受ST1-p11C肽加IFA的动物(93x021)显示了在未刺激的外周血液中有免疫接种-诱导的细胞免疫应答证据。
表16新鲜分离的外周血液中p11C-四聚物染色和p11C特异性ELISPOT反应的百分比第0周 第5周第6周免疫前 第二次免疫接种后1周 第二次免疫接种后2周ELISPOT ELISPOT ELISPOT新鲜血液新鲜血液新鲜血液#SPC#SPC#SPC动物/制剂四聚物 每106四聚物 每106四聚物 每106(组) 染色a细胞 染色 细胞 染色 细胞95x009(1)ST1-p11C0.02 0.0 0.00 0.0 0.00 3.8+IFA93x021(1)ST1-p11C0.02 Ndb 0.15 56.3 0.12 21.9+IFA98n002(2)ST1-p11C0.00 0.6 0.05 0.0 0.01 6.3+529SE/GM-CSF98n008(2)ST1-p11C0.05 0.0 0.04 15.0 0.01 9.4+529SE/GM-CSF
第8周 第9周 第10周第二次免疫接种后4周第三次免疫接种后1周第三次免疫接种后2周动物 制剂 新鲜血液ELISPOT新鲜血液ELISPOT新鲜血液ELISPOT95x009(1)ST1-p11C 0.00Nd 0.012.50.021.9+IFA93x021(1)ST1-p11C 0.02Nd 0.14Nd 0.02Nd+IFA98n002(2)ST1-p11C 0.06Nd 0.00Nd 0.003.8+529SE/GM-CSF98n008(2)ST1-p11C 0.02Nd 0.02Nd 0.000.0+529SE/GM-CSFa报告为新鲜血液CD3+CD8+淋巴细胞的p11C-四聚物染色阳性百分比；ND，没做。
bNd＝无数据(在此表和随后的表中)p11C特异性ELISPOT反应为进一步评估在组1和组2动物中诱导细胞免疫应答，用ELISPOT分析筛选新鲜分离外周血淋巴细胞是否存在p11C特异性CD3+CD8+T淋巴细胞。如表16所示，只有用新鲜血液四聚物分析显示出可检测水平的p11C特异性CD8+淋巴细胞的动物(93x021)，用ELISPOT分析具有可检测的p11C特异CD8+T淋巴细胞。在所有情况下，p11C四聚物分析阳性反应由阳性p11C特异ELISPOT反应所确证。
体外肽p11C刺激后p11C特异性细胞免疫应答在一次提高分析前p11C特异性细胞数的努力中，用肽p11C和rhIL-2体外刺激新鲜分离外周血淋巴细胞。14天后，筛选所得效应细胞是否存在p11C-四聚物结合以及在标准铬释放CTL试验中功能性p11C特异性裂解活性。p11C-四聚物分析和功能性CTL试验结果列在表17中。在新鲜分离淋巴细胞中一致性显示出p11C特异性免疫应答的动物93x021，第二次免疫接种后1周表现出非常高水平的四聚物结合及功能性CTL活性。这表明诱导了非常强的p11C特异性细胞免疫应答。与新鲜分离的淋巴细胞中观察到的结果相反，组2的一只动物(98n 008，STI-p11C+529SE/GM-CSF)在第二次免疫接种后二周开始显示出p11C特异性细胞免疫应答的证据。然而，组2动物观察到的p11C特异性细胞免疫应答比组1反应动物中观察到的程度明显为低。
表17体外肽p11C刺激后p11C-四聚物染色和功能性p11C特异性CTL应答的百分比第0周 第5周 第6周免疫前 第二次免疫接种后1周 第二次免疫接种后2周动物/(组) 制剂 四聚物CTL四聚物 CTL四聚物CTL染色a20∶1 E∶Tb染色 20∶1 E∶Tb染色 20∶1 E∶Tb95x009(1) ST1-p11C 0.03 0.60.23 Nd 0.27 0.0+IFA93x021(1) ST1-p11C 0.03 0.034.31 66.3 15.15 4.69+IFA98n002(2) ST1-p11C 0.21 0.0Nd Nd 0.73 Nd+529SE/GM-CSF98n008(2) ST1-p11C 0.16 0.0Nd Nd 5.84 Nd+529SE/GM-CSF第8周第9周 第6周第二次免疫接种后4周 第三次免疫接种后1周 第三次免疫接种后2周动物/ 制剂四聚物 CTL 四聚物CTL 四聚物CTL(组) 染色 20∶1E∶T 染色 20∶1 E∶T染色 20∶1 E∶T95x009(1) ST1-p11cNd Nd0.76 3.0 0.72 0.0+IFA93x021(1) ST1-p11cNd Nd4.90 7.3 NdNd+IFA98n002(2) ST1-p11cNd Nd0.07 5.7 0.39 0.0+529SE/GM-CSF98n008(2) ST1-p11cNd Nd2.24 11.4 5.00 0.0+529SE/GM-CSFa报告为CD3+CD8+培养细胞p11C-四聚物染色阳性的百分比。
b报告为在效靶比例(E∶T)为20∶1时p11C特异性裂解(负背景)的百分比。
细胞内细胞因子分析为进一步特征鉴定免疫原诱导的肽p11C特异性淋巴细胞的功能和表型特性，监测了Th1型细胞因子INF-γ、TNF-α、IL-2和Th2型细胞因子IL-4的细胞内表达。监测了外周血淋巴细胞在最初体外刺激后在10μM肽p11C和rhIL-2存在情况下细胞内细胞因子表达。培养物随后维持在40U/ml IL-2中14天。2周后，只用培养基或以10μM肽p11C+抗人CD28和抗人CD49d刺激培养细胞1小时。1小时后，细胞用Brefeldin A再处理5小时以使细胞内细胞因子集中在内质网中。随后用流式细胞仪测定细胞内细胞因子的表达(表18&19)。
如表18所示，体外肽p11C刺激后2周，组1动物93x021(ST1-p11C+IFA)的CD3+外周血淋巴细胞，显示出低水平Th1型细胞因子表达，低于所有活跃地分泌IN F-γ、TNF-α或IL-2细胞的1.5％。所有CD3+淋巴细胞的大约8％在体外肽p11C刺激后活跃地分泌Th2型细胞因子IL-4，发现IL-4分泌细胞限于CD3+CD4+淋巴细胞亚群。在短暂重接触肽p11C后，p11C四聚物+和CD3+CD8+淋巴细胞亚群活跃也分泌Th1型细胞因子IN F-γ和TNF-α，但不能被诱导分泌显著升高水平的IL-2。肽p11C重接触后，Th2型细胞因子IL-4的分泌不受影响。
表18细胞内细胞因子分析，组1动物93x021，第二次免疫接种后2周淋巴细胞 培养基INF-γ 培养基TNFα亚群 P11CaS.I. p11C S.I.
bp11C-四聚物+977 27,61228.39020,342226.0bBulkCD3+7,628 65,5678.6 12,25651,3614.2bCD3+CD4+2,488 5,545 2.2 6,252 2,827 0.4bCD3+CD8+5,273 60,57311.56,865 48,4397.1IL-2 IL-4培养基p11C S.I. 培养基p11C S.I.
bp11C-四聚物+751 2,0042.7NdNdNdbBulk CD3+2,879 6,4632.278,06990,5631.2bCD3+CD4+1,377 1,6831.271,27581,4371.1bCD3+CD8+1,502 4,7833.26,794 9,126 1.3
表19细胞内细胞因子分析，组2动物98n008，第三次免疫接种后1周INF-γ TNFα淋巴细胞亚群 培养基 培养基p11CaS.I. p11C S.I.
bp11C-四聚物+545 560 1.0 748 454 0.0bBulk CD3+6,829 10,4891.5 3,402 13,4434.0bCD3+CD4+3,310 3,789 1.1 1,428 2,567 1.8bCD3+CD8+3,189 6,825 2.1 2,587 11,3244.4IL-2 IL-4培养基p11C S.I.培养基 p11C S.I.
bp11C-四聚物+77456 5.9 nd nd ndbBulk CD3+385 2,868 7.4 219,789202,1220.9bCD3+CD4+1,379 1,761 1.3 170,804158,1750.9bCD3+CD8+362,095 58.249,053 44,083 0.9aS.I.，刺激指数b报告为每106CD3+细胞的所示细胞因子阳性染色数，负背景(同型对照)染色数。
如表19所示，体外肽p11C刺激后2周，组2动物98n008(ST1-p11C+529SE/GM-CSF)的CD3+外周血液淋巴细胞，显示出低水平的Th1型细胞因子表达，低于所有活跃分泌IN F-γ、TNF-α或IL-2细胞的1.0％。令人感兴趣的是，所有CD3+淋巴细胞的大约20％活跃地分泌Th2型细胞因子IL-4，IL-4产生细胞数量与组1动物相比增加2.5倍。与组1动物情况一样，发现IL-4分泌细胞限于CD3+CD4+淋巴细胞亚群。在短暂重接触肽p11C后，组2动物的p11C四聚物+和CD3+CD8+淋巴细胞亚群可被刺激分泌TNFα，但不分泌INF-γ。与组1动物相反，肽p11C重接触后，显示出CD3+CD8+细胞IL-2表达显著升高。与组1动物情况一样，重接触肽p11C后，Th2型细胞因子IL-4的分泌没有改变。
结果免疫原诱导的体液免疫应答(组1和2)为评估免疫原-特异性体液抗体应答，测定了组1和2动物免疫接种前立即及第二次和第三次免疫接种后1和2周血清抗ST1-p11C ELISA抗体滴度。结果总结于表20中。
表20用ST1-p11C免疫接种的恒河猴(组1和2)血清的ELISA终点滴度动物 组别 制剂 周 ST1-p11C抗体滴度a95x0091 ST1-p11C+IFA 512,800612,80096,40010 12,80093x0211 ST1-p11C+IFA 551,2006102,400951,20010 51,20098x0022 ST1-p11C+529SE/GM-CSF5＜506＜5091,60010 ＜5098n0082 ST1-p11C+529SE/GM-CSF52006200912,80010 6,400a测定的抗体终点结合滴度作为实验/对照(E/C)OD读数＞3.0的血浆最高稀释度的倒数。
免疫原诱导的体液免疫应答(组3和4)为评估免疫原-特异性和佐剂-特异性体液抗体应答的诱导，测定了组3和组4动物免疫接种前立即及第二次和第三次免疫接种后1和2周血浆抗C4-V389.6P和抗GM-CSF ELISA抗体滴度。结果总结于表21。结果表明在所有试验动物中峰值血浆C4-V389.6P抗体滴度在第二次免疫接种后1周产生。组3动物(C4-V389.6P+IFA)峰值血浆抗体滴度比组4(C4-V389.6P+529 SE/GM-CSF)观察到的峰值血浆抗体滴度高几个数量级。组4动物显示出低的但可检测水平的抗GM-CSF抗体滴度，第三次免疫接种后1周达到峰值。
表21用C4-V389.6P免疫接种的恒河猴(组3和4)血浆的ELISA终点抗体滴度动物/组 制剂周 C4-V3抗体抗人GM-CSF滴定度a抗体滴定度98n007(3)C4-V389.6P+IFA 5 102,400 ＜106 25,600 ＜109 25,600 ＜1010 25,600 ＜1098n013(3)C4-V389.6P+IFA 5 12,800 ＜106 6,400＜109 12,800 1010 12,800 ＜1096x004(4)C4-V389.6P+529 SE/GM-CSF5 6,4003206 1,6001609 3,2002,56010 1,6001,28095x011(4)C4-V389.6P+529 SE/GM-CSF5 1,6001606 800 809 1,6001,28010 1,6001,280a测定的抗体终点结合滴度作为实验/对照(E/C)OD读数＞3.0的血浆最高稀释度的倒数。
还监测了组3和4动物中中和抗体的诱导；结果总结在表22中。结果表明组3和组4动物都产生能体外中和SHIV89.6病毒的中和抗体。组3动物中观察到的SHIV89.6中和抗体滴度普遍比组4动物中观察到的高。此外，最后一次免疫接种后，组3动物的血清显示出低水平的对抗难以中和的SHIV89.6p病毒株的中和活性。
表22用C4-V389.6P免疫接种的恒河猴(组3和4)血清终点中和抗体滴度动物/组中和抗体a制剂周SHIV89.6SHIV89.6P98n007(3)C4-V389.6P+IFA 0 ＜10＜105 22 ＜106 46 ＜109 113 461074 7198n013(3)C4-V389.6P+IFA 0 ＜10＜105 12 ＜106 19 ＜109 36 181022 ＜1096x004(4)C4-V389.6P+529 SE/GM-CSF0 ＜10＜105 ＜10＜106 ＜10＜109 26 ＜1010＜10＜1095x011(4)C4-V389.6P+529 SE/GM-CSF0 ＜10＜105 11 ＜106 ＜10＜109 19 ＜1010＜10＜10a中和抗体滴度是根据中性红摄取测定保护50％细胞避免病毒诱导的杀伤时相应的血清稀释度。
实施例8用Aβ1-42和佐剂处理的PDAPP转基因小鼠的治疗效果研究设计了下列实验以比较一些佐剂组合制剂在PDAPP转基因小鼠中测试Aβ1-42肽的治疗效果。
研究设计将十个半到十二个半月龄PDAPP转基因小鼠(雄性和雌性)40只小鼠分成四组，每组按年龄、性别和转基因亲代尽可能接近互相匹配挑选。分组如表23所描述表23转基因小鼠处理分组组别 佐剂 剂量 Aβ1-42肽剂量 起始数 结束数1 MPL SE 25μg 75/60μg 40 352 MPL SE+GM-CSF25μg/10μg 64/60μg 41 343 529+GM-CSF 25μg/10μg 64/60μg 40 314 PBS nana 40 37Aβ1-42肽购自Elan制药公司，529 SE和MPLTMSE购自Corixa，小鼠GM-CSF购自Biosource。所有小鼠在第0、2、4、8、12、16、20和24周接受注射。小鼠在注射后5-7天，第二次注射后采血。组1、2和3用200μl体积皮下注射，而组4接受250μl皮下剂量。动物在研究的第25周处死。使用最高光密度读数值50％时的稀释度获得滴度。
结果免疫原性和抗体应答所有组在第二次(RC529+GM-CSF)或第三次采血(MPLTMSE，MPLTMSE+GM-CSF)达到它们抗Aβ1-42肽抗体的峰值几何平均值滴度(GMT)(见图1)。在峰值GMT时，MPLTMSE+GM-CSF为16,400，而529+GM-CSF为13,400或MPLTMSE对照9,700的约1.5倍。然而，两种含GM-CSF的制剂(组2和3)滴度跌回到MPLTMSE对照的接近水平，MPLTMSE的最终GMTs为4600，MPLTMSE+GM-CSF的为5350，529 SE+GM-CSF的为4650。
为确定两种含GM-CSF制剂的滴度最终下降是否由于抗GM-CSF抗体应答所致，采用ELISA以确定是否在免疫接种过程中形成了抗GM-CSF抗体。在此实验中滴定了所有接受GM-CSF动物的血清抗所用的小鼠GM-CSF的抗体。在任何处理动物中未发现抗GMCSF抗体的证据(数据未列出)。
脑Aβ水平所有三个处理组在PDAPP小鼠脑的皮质区域显著减少了总Aβ肽(图2-个体结果；表24-汇合结果)和Aβ1-42(图3-个体结果；表25-汇合结果)的积聚。如前所述(54)使用胍溶解的脑匀浆进行了AβELISAs(总的和1-42形式)。统计学比较使用显著性Mann-Whitney测试。
表24皮层总Aβ水平PBS MPL SE MPL SE+ 529 SE+GM-CSF GM-CSF中值(ng/g)6,4781,707 925 1,313范围 64-17,20833-8,50167-5,29379-5,271下降％--- 74 86 80P值 --- ＜0.0001＜0.0001＜0.0001(M-W)N 37 35 34 31表25皮层Aβ水平PBS MPL SE MPL SE+ 529 SE+GM-CSF GM-CSF中值(ng/g) 5,6091,799 779 1,127范围 284-14,004 10-6,71543-4,82429-4,442下降％ --- 68 86 80P值 --- ＜0.0001＜0.0001＜0.0001(M-W)N36 35 34 31淀粉样负担淀粉样变性病程度可用前面描述的免疫组织化学方法(55)在前皮层定量测定。所有三个处理组显示出淀粉样负担显著下降(图4-个体结果；表26-汇合结果)。
表26前皮层淀粉样负担PBS MPL SE MPL SE+ 529 SE+GM-CSF GM-CSF中值(％AB)7.98 0.49 0.000.04范围 0.00-27.37 0.00-9.630.00-.830.00-5.53下降％------ 94 100 99.5P值 ------ ＜0.0001 ＜0.0001＜0.0001(M-W)N 29 33 29 30神经炎负担用前面描述的免疫组织化学方法(55)评估了对前皮层神经炎营养失调发展的处理效果。所有三个处理组显示神经炎负担程度相对PBS对照显著减少(图5-个体结果；表27-汇合结果)。
表27前皮层神经炎负担PBS MPL SE MPL SE+ 529 SE+GM-CSFGM-CSF中值(％NB) 0.35 0.14 0.04 0.02范围 0.00-1.210.00-0.820.00-0.60 0.00-0.91下降％ --- 60 8895P值--- ＜0.0153 ＜0.0001 ＜0.0001(M-W)N 29 33 2930星形胶质细胞增生后夹肌皮层中星形胶质细胞增生程度如前所述(55)进行定量测定。含GM-CSF处理组显示显著下降的星形胶质细胞增生(图6)。
实施例9短尾猿的C4(E9V)-V389.6P肽免疫接种本实验目的是评估HIV-1 ENV-衍生肽偶联物、C4(E9V)-V389.6P，在有或没有本发明佐剂组合制剂用于另一灵长类动物短尾猴时的免疫源性。实施例7描述的C4-V389.6P肽通过改变第9氨基酸残基谷氨酸为缬氨酸进行了修饰。使用命名为C4(E9V)-V389.6P的所得肽的偶联物，有如下序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val GlyLys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn AsnThr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly ArgAla Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO5)。此肽C4区谷氨酸变为缬氨酸在小鼠模型中提高了该肽的免疫原性，超过未修饰序列。
此HIV-1 ENV-衍生肽能在小鼠中诱导体液免疫应答。然而，由于难于将小鼠结果外推到人，必须在继续进入人工期临床试验之前在非人灵长类动物上测试此可能的HIV-1免疫原性组合物。在此实验中，评估了肌肉(IM)和鼻内(IN)给予途径。动物在第0、4、8、18和23周免疫接种5次。每周收集血液样品和子宫颈阴道及粘膜洗液和分析是否存在针对此免疫原性组合物的抗体直至25周。
实验设计总共8只短尾猴，每组4只(表28)，用于该实验。组1未接受佐剂；组2接受佐剂制剂529 SE加GM-CSF。动物在动物饲养在保护设施中和评估。
表28529 SE加GM-CSF与无佐剂相比分组#免疫原 佐剂 途径1C4(E9V)-V389.6P肽 无 鼻内2C4(E9V)-V389.6P肽 529 SE/GM-CSF肌肉内免疫接种所有鼻内免疫接种用100μl剂量鼻喷雾装置进行。所有肌肉注射用针和注射器注入四头肌肌肉。所有动物按第0、4、8、18和23周时间表免疫接种。
制剂组11000μg C4(E9V)-V389.6P肽溶于无菌生理盐水中，终体积200μl(100μl每鼻孔)。
组21000μg C4(E9V)-V389.6P肽，50μg 529 SE和250μg人GM-CSF，最终油浓度1％，终体积1.0ml(肌肉注射500μl/每四头肌)。
用于监测免疫原诱导的免疫应答试验所有动物免疫接种前刻和之后用以下试验密切监测免疫原诱导的体液免疫应答(1)用ELISA测血清抗C4(E9V)-V389.6P肽IgG血清抗体滴定度。
(2)用ELISA测粘膜(子宫颈阴道，鼻)抗C4(E9V)-V389.6P肽IgG抗体滴度。
结果免疫原安全性和耐受性当单独或加入佐剂529 SE/GM-CSF给予时，C4(E9V)-V389.6P肽极其良好地耐受。通过肌肉途径用针和注射器免疫接种的动物，没有发现注射部位副作用反应。每次注射免疫原后紧接在24小时内密切监测所有动物体温变化。在研究中没有任何动物任何时间表现异常升高的体温读数(数据未列出)。
免疫原-特异性血清抗体应答所有动物血清样品在每次免疫接种前立即及之后1和2周获得(总共25周)。最后一次免疫接种后2周，分析所有血清样品是否存在抗C4(E9V)-V3肽IgG抗体。鼻内免疫接种的组1动物(只有C4(E9V)-V389.6P肽)没能显示高于免疫前水平的血清抗C4(E9V)-V389.6PIgG抗体滴度(图7)。相反，组2动物(肌肉注射C4(E9V)-V389.6P+529 SE/GM-CSF)产生了显著水平的血清C4(E9V)-V3-特异性IgG抗体(图7)。报告的终点滴度几何平均值用各动物最低滴度计算，是同样稀释度的混合原初血清读数的3倍。
组1动物(无佐剂)子宫颈阴道灌洗液样品抗C4(E9V)-V389.6PIgG抗体滴度只在第四次免疫接种后高于免疫前水平，但然后下降(图8)。相反，组2动物(有佐剂)子宫颈阴道灌洗液样品抗C4(E9V)-V389.6PIgG抗体滴度在第一次免疫接种后高于免疫前水平且随后每次免疫接种后上升(尽管每次稍后有一些下跌)(图8)。
组1动物(无佐剂)鼻冲洗液抗C4(E9V)-V389.6PIgG抗体滴度未能显示高于免疫前水平(图9)。相反，组2动物(有佐剂)鼻冲洗液样品产生了显著水平的抗C4(E9V)-V389.6PIgG抗体滴度(图9)。
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序列表<110>美国氰胺公司(American Cyanamid Company)<120>佐剂组合制剂<130>AM100449PCT<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>40<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒的人工序列<400>1Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala1 5 10 15Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro20 25 30Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys35 40<210>2<211>39<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒的人工序列<400>2Lys G1n Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala1 5 10 15Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly20 25 30Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys35
<210>3<211>28<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒的人工序列<400>3Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu1 5 10 15Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu20 25<210>4<211>39<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒的人工序列<400>4Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala1 5 10 15Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly20 25 30Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg35<210>5<211>39<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒的人工序列<400>5Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala1 5 10 15Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly20 25 30Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg35
<210>6<211>42<212>PRT<213>淀粉样前体蛋白的内部片段<400>6Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40<210>7<211>28<212>PRT<213>淀粉样前体蛋白的内部片段<400>7Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys20 25<210>8<211>10<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒的人工序列<400>8Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile1 5 10
权利要求
1.一种抗原组合物，其特征在于，它包含选自病原性病毒、细菌、真菌或寄生虫，或选自癌细胞或肿瘤细胞，或选自过敏原，或选自自体分子的抗原，和有效辅助剂量的以下物质的组合(1)氨烷基葡糖胺磷酸盐化合物(AGP)，或其衍生物或类似物，和(2)细胞因子或淋巴因子，或所述细胞因子或淋巴因子的激动剂，其中所述佐剂组合可增强脊椎动物宿主对所述抗原的免疫应答反应。
2.如权利要求1所述的抗原组合物，其中，所选抗原是衍生自蛋白质的多肽、肽或片断。
3.如权利要求1所述的抗原组合物，其中，所述AGP以稳定的水包油乳剂的形式施用。
4.如权利要求1所述的抗原组合物，其中，所述细胞因子或淋巴因子选自粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-12。
5.如权利要求4所述的抗原组合物，其中，所述细胞因子或淋巴因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
6.如权利要求5所述的抗原组合物，其中，所述AGP以稳定的水包油乳剂的形式施用。
7.如权利要求4所述的抗原组合物，其中，所述细胞因子或淋巴因子是白细胞介素-12。
8.如权利要求7所述的抗原组合物，其中，所述AGP以稳定的水包油乳剂的形式施用。
9.如权利要求1所述的抗原组合物，它还包括稀释剂或载体。
10.如权利要求9所述抗原组合物，其中，所述AGP以稳定的水包油乳剂的形式施用。
11.如权利要求1所述的抗原组合物，其中，所述AGP是2-[(R)-3十四酰氧十四酰氨基]乙基2-脱氧-4-氧-磷酰基-3-氧-[(R)-3-十四酰氧十四酰]-2-[(R)-3-十四酰氧十四酰氨基]-β-D-吡喃(型)葡萄糖苷(529)。
12.如权利要求1所述的抗原组合物，其中，所选抗原来自人类免疫缺陷性病毒(HIV)。
13.如权利要求12所述的抗原组合物，其中，所选HIV抗原是HIV蛋白质，衍生自所述蛋白质的多肽、肽或片断。
14.如权利要求13所述的抗原组合物，其中，所选抗原是选自含有以下氨基酸序列的肽的HIV肽Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg IleHis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO1)；Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO2)；Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn ValTyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu(SEQ ID NO3)；Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO4)；以及Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO5)。
15.如权利要求14所述的抗原组合物，其中，所述HIV肽含有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg IleHis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO1)。
16.如权利要求14所述的抗原组合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO2)
17.如权利要求14所述的抗原组合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn ValTyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu(SEQ ID NO3)。
18.如权利要求14所述的抗原组合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO4)
19.如权利要求14所述的抗原组合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO5)。
20.如权利要求12所述的抗原组合物，其中，所述AGP以稳定的水包油乳剂的形式施用。
21.如权利要求12所述的抗原组合物，其中，所述细胞因子或淋巴因子选自粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-12。
22.如权利要求21所述的抗原组合物，其中，所述细胞因子或淋巴因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
23.如权利要求22所述的抗原组合物，其中，所述AGP以稳定的水包油乳剂的形式施用。
24.如权利要求21所述的抗原组合物，其中，所述细胞因子或淋巴因子是白细胞介素-12。
25.如权利要求24所述的抗原组合物，其中，所述AGP以稳定的水包油乳剂的形式施用。
26.如权利要求12所述的抗原组合物，它还包括稀释剂或载体。
27.如权利要求26所述的抗原组合物，其中，所述AGP以稳定的水包油乳剂的形式施用。
28.如权利要求12所述的抗原组合物，其中，所述AGP是529。
29.一种提高含有选自病源性病毒、细菌、真菌或寄生虫的抗原的抗原组合物引发脊椎动物宿主免疫应答能力的方法，其特征在于，所述方法包括对所述宿主施用如权利要求1所述的抗原组合物。
30.一种提高含有选自病源性病毒、细菌、真菌或寄生虫的抗原的抗原组合物引发脊椎动物宿主免疫应答能力的方法，其特征在于，所述方法包括对所述宿主施用如权利要求9所述的抗原组合物。
31.一种提高含有HIV抗原的抗原组合物引发脊椎动物宿主免疫应答能力的方法，其特征在于，所述方法包括对所述宿主施用如权利要求12所述的抗原组合物。
32.一种提高含有HIV抗原的抗原组合物引发脊椎动物宿主免疫应答能力的方法，其特征在于，所述方法包括对所述宿主施用如权利要求26所述的抗原组合物。
33.如权利要求32所述的方法，其中，所选抗原是选自含有以下氨基酸序列的肽的HIV肽Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg IleHis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO1)；Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO2)；Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn ValTyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu(SEQ ID NO3)；Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO4)；以及Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO5)。
34.如权利要求33所述的抗原组合物，其中，所述HIV肽含有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg IleHis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO1)。
35.如权利要求33所述的抗原组合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO2)
36.如权利要求33所述的抗原组合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn ValTyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu(SEQ ID NO3)。
37.如权利要求33所述的抗原组合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO4)
38.如权利要求33所述的抗原组合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO5)。
39.一种提高含有选自病源性病毒、细菌、真菌或寄生虫的抗原的抗原组合物引发脊椎动物宿主细胞毒性T淋巴细胞能力的方法，其特征在于，所述方法包括对所述宿主施用如权利要求1所述的抗原组合物。
40.一种提高含有选自病原性病毒、细菌、真菌或寄生虫的抗原的抗原组合物引发脊椎动物宿主细胞毒性T淋巴细胞能力的方法，其特征在于，所述方法包括对所述宿主施用如权利要求9所述的抗原组合物。
41.一种提高含有HIV抗原的抗原组合物引发脊椎动物宿主细胞毒性T淋巴细胞能力的方法，其特征在于，所述方法包括对所述宿主施用如权利要求12所述的抗原组合物。
42.一种提高含有HIV抗原的抗原组合物诱导脊椎动物宿主细胞毒性T淋巴细胞能力的方法，其特征在于，所述方法包括对所述宿主施用如权利要求26所述的抗原组合物。
43.如权利要求42所述的方法，其中，所选抗原是选自含有以下氨基酸序列的肽的HIV肽Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg IleHis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO1)；Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO2)；Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn ValTyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu(SEQ ID NO3)；Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO4)；以及Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO5)。
44.如权利要求43所述的抗原组合物，其中，所述HIV肽含有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg IleHis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO1)。
45.如权利要求43所述的抗原组合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO2)
46.如权利要求43所述的抗原组合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn ValTyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu(SEQ ID NO3)。
47.如权利要求43所述的抗原组合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO4)
48.如权利要求43所述的抗原组合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO5)。
49.一种提高含有选自癌细胞、或肿瘤细胞的癌抗原或肿瘤相关抗原的抗原组合物在脊椎动物宿主中引发治疗或预防性抗癌效应能力的方法，其特征在于，所述方法包括对所述宿主施用一种抗原组合物，该此组合物包含选自癌细胞或肿瘤细胞的所述癌抗原或肿瘤相关抗原和有效辅助剂量的以下物质的组合(1)AGP，或其衍生物或类似物，和(2)细胞因子或淋巴因子，或所述细胞因子或淋巴因子的激动剂。
50.一种提高含有所选的过敏原的抗原组合物调节脊椎动物宿主过敏性反应能力的方法，其特征在于，所述方法包括对所述宿主施用一种抗原组合物，此组合物包含所述过敏原和有效辅助剂量的以下物质的组合(1)AGP，或其衍生物或类似物，和(2)细胞因子或淋巴因子，或所述细胞因子或淋巴因子的激动剂。
51.一种抗原组合物，它含有选自宿主在不良方式、数量或位置下产生的分子或其部分的抗原，并包含有效辅助剂量的以下物质的组合(1)AGP，或其衍生物或类似物，和(2)细胞因子或淋巴因子，或所述细胞因子或淋巴因子的激动剂，以降低这种不良作用。
52.如权利要求51所述的抗原组合物，其中，所选抗原是衍生自淀粉样前体蛋白的多肽、肽或片断，或它们的抗体。
53.如权利要求52所述的抗原组合物，其中，所选抗原是Aβ肽或Aβ肽的片断，所述Aβ肽是淀粉样前体蛋白质的内在39-43氨基酸片断。
54.如权利要求53所述的抗原组合物，其中，所选抗原是含有以下氨基酸序列的Aβ肽Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His HisGln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn LysGly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala(SEQ ID NO6)。
55.如权利要求54所述的抗原组合物，其中，所述AGP是529。
56.一种提高抗原组合物能力的方法，所述抗原组合物含有选自宿主在不良方式、数量或位置下产生的分子或其部分的抗原，并包含有效辅助剂量的以下物质的组合(1)AGP，或其衍生物或类似物，和(2)细胞因子或淋巴因子，或所述细胞因子或淋巴因子的激动剂，以降低这种不良作用。
57.一种增强抗原组合物在脊椎动物宿主中预防或治疗以淀粉样沉积为特征的疾病的能力的方法，其特征在于，所述方法包括对所述宿主施用衍生自淀粉样前体蛋白的多肽、肽或片断，或它们的抗体，和有效辅助剂量的以下物质的组合(1)AGP，或其衍生物或类似物，和(2)细胞因子或淋巴因子，或所述细胞因子或淋巴因子的激动剂。
58.如权利要求57所述的方法，其中，所选抗原是Aβ肽或Aβ肽的片断，所述Aβ肽是淀粉样前体蛋白质的内在39-43氨基酸片断。
59.如权利要求58所述的抗原组合物，其中，所选抗原是含有以下氨基酸序列的Aβ肽Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His HisGln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn LysGly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala(SEQ ID NO6)。
60.如权利要求59所述的抗原组合物，其中，所述AGP是529。
61.一种佐剂制剂，其特征在于，所述制剂含有以下物质的组合(1)氨烷基葡糖胺磷酸盐化合物(AGP)，或其衍生物或类似物，和(2)细胞因子或淋巴因子，或所述细胞因子或淋巴因子的激动剂。
62.如权利要求61所述的佐剂制剂，其中，所述AGP以稳定的水包油乳剂的形式施用。
63.如权利要求61所述的佐剂制剂，其中，所述细胞因子或淋巴因子选自粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-12。
64.如权利要求61所述的佐剂制剂，它还包括稀释剂或载体。
65.如权利要求61所述的佐剂制剂，其中，所述细胞因子或淋巴因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
66.如权利要求61所述的佐剂制剂，其中，所述细胞因子或淋巴因子是白细胞介素-12。
67.如权利要求61所述的佐剂制剂，其中，所述AGP是529。
全文摘要
氨烷基葡糖胺磷酸盐化合物，或其衍生物或类似物的应用，与细胞因子或淋巴因子如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子或白细胞介素－12组合，可用作抗原组合物中的佐剂组合以提高脊椎动物宿主对所选抗原的免疫应答反应。
文档编号A61K39/39GK1533285SQ01821386
公开日2004年9月29日 申请日期2001年11月8日 优先权日2000年11月10日
发明者M·哈根, M 哈根 申请人:惠氏控股有限公司