专利名称：乙酰乳香酸在制备抗肿瘤剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药乳香中提取的五环三萜类成分，乙酰乳香酸(BC-4)在制备抗肿瘤剂应用中的新用途，即药物的第二次使用。
中药乳香(Boswellia carterii Birdw.)具活血止痛、解毒消肿等功效。乙酰乳香酸(BC-4)是从中药乳香中提取的五环三萜类成分，分子量为498.3，无色针状结晶，由化合物α-BC-4及β-BC-4按1∶1组成，其化学结构如下所示 在以往的研究中注重于抗炎作用的探讨，并认为其非甾体抗炎活性与其抑制5-脂氧酶(5-LO)活性从而抑制白三烯的合成有关(Safayhi H，Mack T，Sabieraj J，et al.J Pharmacol Exp Ther，1992，2611143-1146.)。在对BC-4活性筛选中，发现其对HL-60白血病细胞具有较强的分化诱导作用(Jing YK，Xia LJ and Rui H.Chinese Medical Sciences J，1992，712.)，且当大豆甙元与BC-4联合应用时，对细胞增殖的抑制作用和分化诱导作用明显增强(景永奎，韩锐.药学学报，1993，2811.)。早期的研究发现其亦是一个拓扑异构酶抑制剂，这方面的作用已公开在美国专利5064823中，
公开日期为1991年11月12日；及中国专利CN1041204C中，公告日期为1998年12月16日。近年来，乳香酸抗肿瘤活性引起了广泛注意。研究结果显示，BC-4低浓度时对多种髓细胞性白血病细胞有广泛的诱导分化作用，高浓度时则能诱导白血病细胞凋亡(Jing Y，Nakajo S，Xia L，et al.Leuk Res，1999，2343-50.)。
本发明的另一个目的是提供乙酰乳香酸(以下简称BC-4)在肿瘤转移抑制剂中的应用。
1.制备方法及化合物的结构将生药乳香珠用95％的乙醇渗漉，得浸渗漉；减压回收溶剂，得乙醇浸膏。将得到的乙醇浸膏溶解于石油醚-乙酸乙酯混合溶剂中，加碳酸钠溶液调至pH10，石油醚-乙酸乙酯混合溶剂萃取三次，水相再用4N盐酸调至pH3，石油醚-乙酸乙酯混合溶剂萃取三次，有机相用水洗涤两次，无水硫酸钠脱水，过滤，浓缩至干，加甲醇浓缩发泡得到乳香总酸发泡物。然后将乳香总酸进行硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得到乙酰乳香酸α、β异构体混合物粗品，再进行重结晶，得到乙酰乳香酸α、β异构体混合物(1∶1)结晶。其分子量为498.3，无色细针状结晶，其化学结构如下所示 HPLC检测含BC-4-α及BC-4-β的保留时间分别为11.70分钟及12.79分钟(
图1)。2.药理作用1)现有技术中BC-4的作用现有技术中，BC-4是一拓扑异构酶抑制剂及细胞分化诱导剂，能抑制拓扑异构酶I(图2)及拓扑异构酶II(图3)活性，人早幼粒白血病HL-60细胞经BC-4诱导后，向成熟细胞分化(Lu.Y andHan R.Acta Academia Medica Sinica，1986，8(37)211-214)。以BC-4作用于HL-60细胞5天后细胞的NBT还原能力见表1。
表1BC-4对HL-60人白血病细胞的分化诱导作用浓度(μg/ml) NBT还原能力(％)1 2.5827.010 51.02)本发明的药理新用途a.BC-4抗肿瘤细胞增殖作用将对数生长期细胞按1200个/孔接种于96孔板。次日弃培养基，换含不同浓度药物及相应溶剂对照的新鲜培养基，每组平行6孔，于37℃继续培养4天后，弃上清，每孔加100μl新鲜配制的含0.4mg/mlMTT的无血清培养基，继续培养4hrs，弃培养上清，加100μl DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型振荡器振荡混匀，在Bio-Rad 550型酶标仪上测定550nm处光密度值，按下式计算肿瘤细胞存活率，并计算IC50。 研究表明，BC-4能抑制不同组织来源的恶性肿瘤细胞的生长(包括KB人上皮癌细胞、A2780人卵巢癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞、SHG-44人神经胶质瘤细胞、HCT-8人结肠癌细胞及A549人非小细胞肺癌细胞)，结果见表2，其IC50从5.73μM到16.44μM。
表2BC-4对恶性肿瘤细胞的生长抑制作用细胞系 IC50μg/ml(μM)KB (人上皮细胞癌) 5.356(10.71)A2780(人卵巢癌) 6.159(12.32)MCF-7(人乳腺癌) 2.866(5.73)SHG-44(人神经胶质瘤) 8.219(16.44)HCT-8(人结肠癌) 6.695(13.39)A549(人非小细胞肺癌) 6.159(12.32)CHL(中国仓鼠肺细胞) ＞10(＞20)b.BC-4诱导恶性细胞凋亡通过如下多种技术检测BC-4对恶性肿瘤细胞的诱导凋亡作用在盖玻片上均匀涂上多聚赖氨酸，置于六孔培养板中，干3-5min后，加入70％乙醇灭菌30min，吸去乙醇，用PBS洗2次。将5×104细胞接种于培养孔中，培养过夜后，加入一定浓度的药物及溶媒对照，作用一定时间后，PBS洗一次，取出盖玻片，固定于细胞运动观察室(制备同上)，在小室中填充凋亡检测液(1ml结合缓冲液中含1μlAnnexin V-EGFP及1μl碘化吡啶)，室温下避光作用5min后，反置于激光共聚焦显微镜(Leica TCS 4D型)下观察细胞凋亡。
细胞经消化后用PBS洗一次，取细胞沉淀涂片，迅速风干，用染液Wright染色1min，再用染液Giemsa染10min，蒸馏水冲洗，风干，置油镜下观察细胞凋亡。
细胞制备成1×107/ml细胞悬液，取95μl细胞悬液加入5μl吖啶橙溶液(0.1mg/ml PBS，pH 6.8)，混匀后点样于载玻片上，覆盖盖玻片后置荧光显微镜下观察细胞凋亡。
细胞以PBS洗涤后，用2.5％戊二醛固定1h以上，经PBS洗2次后用1％锇酸(四氧化锇)再固定1h，离心弃固定液，用蒸馏水洗2次。用2％醋酸铀预染1h，离心弃染液，用蒸馏水洗2次。依次用35％-50％-75％-90％酒精脱水，每次5min，用环氧树脂812浸泡，包埋，聚合后，组织块超薄切片，柠檬酸铅染色，在Hitachi800型电镜下观察细胞凋亡。
用细胞刮子刮下细胞，PBS洗一次，加入50μl细胞裂解液(50mMTris-HCl，pH8.0，10mM EDTA，0.5％SDS，0.5mg/ml蛋白酶K)，置冰中40min，取出，加入RNA酶0.15mg/ml，37℃温育至少1h，再加入蛋白酶K 1mg/ml，37℃温育至少1h，加入上样缓冲液后，将样品于24V，1.7％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外灯下拍照观察细胞凋亡引起的DNA损伤。
收集细胞，用新鲜培养基洗一次，将细胞沉淀在暗处加入含0.5μlAnnexin V-EGFP的结合缓冲液500μl(10mM HEPES，pH7.4，140mMNaCl，2.5mM CaCl2)，室温作用10min后，样品管中加入等体积4％甲醛溶液，室温固定15min后，12.0×103rpm离心1min，PBS洗一次，细胞沉淀中加入100μg/ml RNA酶A 100μl，37℃作用30min，加入含0.5μl碘化吡啶的结合缓冲液400μl，室温作用10min后流式细胞仪检测细胞凋亡。同时设立空白对照，样品中仅加500μl结合缓冲液；Annexin V-EGFP对照，样品中仅加含0.5μl Annexin V-EGFP的结合缓冲液500μl。流式细胞仪(Becton Dickinson FACSCalibur型)检测细胞凋亡信号，Annexin V-EGFP染色(Ex＝488nm，Em＝530nm)使用FITC信号检测器(FL1)，碘化吡啶染色使用FL2信号检测器。
以上检测结果如下i.人膀胱癌细胞以BC-4 75μM作用于T24人膀胱癌细胞8小时，即可见细胞凋亡的发生，表现为磷脂酰丝氨酸由磷脂双层膜的内层翻转到磷脂双层膜的外层(图4)，并出现DNA梯带。流式细胞仪检测表明，以BC-4 75μM作用于T24细胞24小时后，细胞凋亡百分率可达77.2％(图5)。
ii.人乳腺癌细胞研究结果显示，MDA-MB-468、转染pCMV-HER2质粒的MDA/HER-2及其导入空白质粒的阴性对照细胞MDA/NEO对BC-4引起的凋亡均较敏感(图6)。
iii.IFNγ对MV3人黑色素瘤细胞的凋亡增敏作用IFNγ500U/ml作用于MV3细胞72小时后，可下调HMW-MAA、αv、TAA等表面抗原的表达，经IFNγ500U/ml作用72小时的MV3细胞对BC-4引起的凋亡信号却较为敏感。以BC-4作用于IFNγ处理的MV3细胞，8小时后即可引起49.2％细胞凋亡(图7)。
iv.人纤维肉瘤细胞BC-4在低浓度下，可剂量依赖性地抑制人纤维肉瘤细胞HT-1080细胞分泌金属蛋白酶MMP-2及MMP-9(图8)。用50μM以上浓度BC-4作用于HT-1080细胞24小时，能明显诱导细胞凋亡，表现为细胞形态完整，但细胞染色质固缩、细胞核裂解分成碎块。Wright-Giemsa染色、吖啶橙荧光染色及电镜观察均在HT-1080细胞核内出现凋亡小体(图9)，DNA分析检测出DNA梯带(图10)。BC-4引起的HT-1080细胞凋亡具有剂量和时间依赖性，当以BC-4 50μM作用36小时后，凋亡细胞百分率由对照组的0.42％增加至59.3％；当以BC-4 75μM作用24小时后，凋亡细胞百分率则增加至76.5％(图11)。
c.BC-4对人脐静脉血管内皮细胞的作用利用[3H]-TdR掺入DNA、[3H]-UdR掺入RNA及[3H]-Leu掺入蛋白质观察BC-4对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响。取对数生长期细胞，消化计数制成1×105/ml细胞悬液，按每孔200μl接种于96孔细胞培养板，37℃ 5％CO2培养箱中培养12hrs，弃去培养基，换含不同浓度药液及溶剂对照的培养基，每组平行4孔，于37℃ 5％CO2培养箱中继续培养24hrs。在终止作用前4hrs，每孔加放射性同位素标记的前体物1μCi。弃去含同位素的培养基，每孔加200μl胰酶于37℃消化20min，用自动细胞收集器将每孔细胞分别收集于玻璃纤维膜上，蒸馏水反复冲洗20次，取出膜置于红外烤箱中80℃干烤15min，对号剪下各膜片，置于装有4ml闪烁剂(0.4％PPO，0.01％POPOP的二甲苯溶液)的液闪杯中，暗处放置15min后用Beckman LS-9800型液闪计数仪测定dpm值。
以BC-4 75μM作用于原代培养人脐静脉血管内皮细胞24小时，未引起细胞凋亡，表明BC-4对正常人体细胞的毒性较小(图12)。不同浓度的BC-4作用于EC-304人脐静脉内皮细胞可不同程度地抑制[3H]-TdR、[3H]-UdR、[3H]-Leu掺入细胞，显示对细胞内DNA、RNA及蛋白质合成有抑制作用(表3)。表3BC-4对EC-304人脐静脉血管内皮细胞DNA、RNA及蛋白质合成的影响[3H]-TdR掺入 [3H]-UdR掺入 [3H]-Leu掺入蛋白质组别 DNA RNAdpmdpm dpm对照 19734.50±2431.745743.67±782.79 3586.33±684.36BC-4 15446.03±5290.444729.00±688.91 2949.67±360.155M9480.58±3220.91**4845.00±517.95 2436.67±991.0410M3513.33±887.52**2437.33±185.04**2340.67±497.4620M2466.33±1486.20**553.67±150.60**1827.67±78.64**40M与对照组比较**，p＜0.01d.BC-4对动物移植性肿瘤的抑制作用选择肿瘤生长良好，全身状态较好的荷瘤BDF1小鼠，颈椎脱臼处死。固定后碘酒酒精消毒，无菌条件下取出瘤块，称重、研磨、匀浆、过滤，匀浆后以生理盐水1∶3稀释，计数每毫升浆液中的瘤细胞数，给每只小鼠腋下接种0.2ml瘤液(2×106细胞)。次日将动物随机分组并给药。于接种24hrs后腹腔注射给药，设25、50、100mg/kg三剂量组，同时设环磷酰胺阳性对照组及空白对照组，连续给药10天后，颈椎脱臼处死，分别称取体重、瘤重。计算肿瘤生长抑制率(％)，并将结果进行统计学处理。 动物移植性肿瘤模型研究表明BC-4以25、100mg/kg剂量腹腔注射给药对S180小鼠肉瘤生长有一定抑制作用，其抑制率分别为40.9％和37.6％。研究结果还显示，BC-4对小鼠毒性较低，未引起小鼠体重的明显减轻(表4)。
表4BC-4对S180小鼠肉瘤生长的影响动物数体重 抑制率组别瘤重开始结束 开始 结束 (％)对照 10 10 18.2±1.23 27.5±1.5 3.40±1.361环磷酰胺100mg/kg×1 10 10 18.4±1.07 21.6±3.5 0.3±0.23**90.7天7BC-425mg/kg×10 10 10 18.9±0.74 24.6±3.1 2.00±0.70**40.9天050mg/kg×10 10 10 18.8±0.63 26.0±1.9 2.50±1.03 25.1天4100mg/kg×10 11 11 18.9±0.70 26.5±2.3 2.10±1.2*37.6天0与对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01e.BC-4对B16BL6小鼠黑色素瘤自发性肺转移的实验性治疗收集对数生长期的B16BL6小鼠黑色素瘤细胞，重悬于灭菌生理盐水中，将细胞浓度调整为1×107/ml。于C57BL/6小鼠后肢爪垫皮下注射50μl瘤细胞液，次日将动物随机分组并连续给药3周。设BC-4 50、100mg/kg组、紫杉醇2.5、5mg/kg组、BC-4(50mg/kg)联合紫杉醇(2.5mg/kg)组，同时设阴性对照组，每组15只小鼠。接种瘤液3周后，称体重，用乙醚麻醉小鼠，结扎股动脉，截去荷瘤下肢，分离瘤块，称重，计算肿瘤生长抑制率(％)。停药一天，连续给药3周，手术后一周称体重，于末次给药24小时后，颈椎脱臼处死，称体重，解剖取肺，用Bouin’s液固定肺组织并称重，在Olympus解剖显微镜下(10倍)计数肺表面肿瘤结节数并测量直径，按转移灶的大小分级I级，直径＜0.5mm，II级，0.5mm≤直径＜1mm，III级，1mm≤直径≤2mm，IV级直径＞2mm。总转移数＝I级(结节数)×1+II级×2+III级×3+IV级×4。将结果进行Mann-Whitney U检验，并对转移发生例数与未转移例数利用简化直接概率法进行统计学检验，对BC-4与紫杉醇联合应用后的疗效采用Chou氏合并指数(CI)法计算CI值，当CI＝1时为相加作用，当CI＜1时为协同作用，当CI＞1时为拮抗作用。
BC-4与紫杉醇联合用药组对小鼠原发黑色素瘤的生长抑制率达43.9％，BC-4 50、100mg/kg组抑制率分别为26.3、33.3％，而紫杉醇对原发黑色素瘤无明显抑制作用(表5)。BC-4 100mg/kg组小鼠黑色素瘤转移肺重量显著下降，抑制率达45.9％(表6)。与模型组比较，BC-4给药组及紫杉醇给药组小鼠黑色素瘤肺转移灶数目均显著减少(表7)。
表5BC-4对B16BL6小鼠黑色素瘤原位生长的影响动物数 体重 抑制率组别 瘤重(g)开始 结束 开始 结束 (％)对照15 15 19.5±0.67 19.6±1.05 0.57±0.21BC-450mg/kg 15 15 19.7±0.82 19.8±1.05 0.42±0.10*26.3100mg/kg15 15 20.1±0.85 19.8±1.13 0.38±0.14*33.3Taxol2.5mg/kg15 15 19.2±1.01 19.0±1.05 0.51±0.13 10.55mg/kg 15 15 19.3±0.88 19.3±0.86 0.46±0.11 19.3BC-4 15 15 19.5±1.12 19.6±1.05 0.32±0.18**43.9(50mg/kg)+Taxol(2.5mg/kg)与对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01
表6BC-4对B16BL6小鼠黑色素瘤自发性肺转移重量的影响动物数目 体重 抑制率组别肺重量(g)开始结束 开始结束 (％)对照14 1217.6±1.22 19.2±1.08 0.37±0.28BC-450mg/kg 15 1518.5±0.89 19.2±0.95 0.23±0.0637.8100mg/kg 10 1017.0±1.47 18.9±1.73 0.20±0.02*45.9Taxol2.5mg/kg 15 1517.4±1.33 18.9±1.10 0.23±0.11 37.85mg/kg 13 1318.0±1.08 19.3±1.11 0.33±0.16 10.8BC-412 1219.3±0.81 19.3±1.38 0.23±0.12 37.8(50mg/kg)+Taxol(2.5mg/kg)与对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01表7BC-4对B16BL6小鼠黑色素瘤自发性肺转移结节数的影响动物数组别 每鼠肺表面转移灶结节数转移 未转移对照12/12 0/12157,66,114,112,60,76,30,11,12,8,27,29BC-450mg/kg 14/15 1/157,19,4,6,0,3,30,70,23,5,10,21,2,24,46(**)100mg/kg 8/102/10 0,8,3,5,34,0,44,3,29,3(**)Taxol2.5mg/kg 14/15 1/1531,1,6,26,0,1,9,69,16,17,4,13,15,4,34(**)5mg/kg 9/134/13 9,50,16,0,0,11,0,0,48,63,117,5,42(*)BC-4 7/12 5*/12 0,0,2,0,0,0,5,1,8,36,35,1(**)(50mg/kg)+Taxol(2.5mg/kg)与对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01本发明的优点及效果是发现了BC-4的抗肿瘤细胞增殖、诱导恶性细胞凋亡、抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖、抑制动物移植性肿瘤的生长、抑制恶性肿瘤的转移等新作用。
根据本发明，所述药物的给药方法有例如口服、舌下、静脉内、皮下、透皮、肌内、皮内、鞘内、硬膜外、眼内、颅内、吸入、直肠、阴道给药等。可以以霜剂、片剂、胶囊、丸剂、可分散粉剂、粒剂、栓剂、糖浆剂、酏剂、锭剂、注射溶液、非水溶液、悬浮液或乳液、等形式给药。可将活性组分与无毒可药用载体混合，这样的载体包括葡萄糖、乳糖、阿拉伯胶、明胶、甘露醇、淀粉粘、三硅酸镁、滑石粉、玉米淀粉、角蛋白、胶态二氧化硅、土豆淀粉、尿素、葡聚糖等。
为了口服给药，可使用含有各种赋形剂例如碳酸钙、乳糖、磷酸钙、磷酸钠等以及各种制粒剂和崩解剂例如玉米淀粉、土豆淀粉、藻酸等和粘合剂例如西黄耆胶、玉米淀粉、明胶、阿拉伯胶等的片剂、胶囊、糖锭剂、油悬浮液、可分散粉剂或粒剂、乳液、硬或软胶囊、或糖浆剂、酏剂和锭剂。还可以加入润滑剂例如三乙胺硬脂酸镁、三乙胺硬脂酸、滑石等。口服施用的制剂可依据本领域已知的制备药物制剂的任何方法制得，并且这样的制剂可含有一种或多种选自下述的辅助剂以提供适口的药物制剂甜味剂例如蔗糖、乳糖、糖精等，矫味剂例如薄荷、冬青油等，着色剂和防腐剂。口服施用的制剂还可以含有合适的载体，包括乳液、溶液、悬浮液、糖浆等，并任选含有添加剂例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料等。片剂可以是未包衣的，或者可通过已知技术将其包衣以延迟其在胃肠道中的崩解和吸收，并由此提供在较长时间内的持续作用。
对于口服液体制剂，合适的载体包括溶液、悬浮液、糖浆等，并任选含有添加剂例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料等。
对于非胃肠道给药液体制剂，合适的载体包括非水溶液、悬浮液、或乳液。对于非胃肠道给药，实施本发明所用化合物的溶液还可包含非水溶液、悬浮液、乳液等。非水溶剂或载体的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油和玉米油、明胶、和可注射有机酯例如油酸乙酯等。这样的剂型还可以含有辅料例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可将它们灭菌，例如通过经由细菌保留滤器过滤、通过向组合物中加入灭菌剂、通过将组合物放射处理、或通过将组合物加热来灭菌。还可以在临用前将它们制成无菌注射介质。
可以适于静脉内、肌内、鞘内、皮下和腹膜内注射。所用的无菌介质都易于通过本领域技术人员众所周知的标准技术制得。可将它们灭菌，例如通过经由细菌保留滤器过滤、通过向组合物中加入灭菌剂、通过将组合物放射处理、或通过将组合物加热来灭菌。还可以在临用前将它们制成无菌可注射介质。
优选的给药剂量随临床适应症的不同而不同。根据所治疗患者的病症，可能必须对剂量作出某些改变，并且在任何情况下，都由医师决定个体患者的合适剂量。每单位剂量中化合物的有效量取决于体重、生理状况和所选的给药方案等。单位剂量的化合物是指不包括载体重量在内(当使用载体时)的化合物的重量。
用于实施本发明的化合物的给药途径取决于疾病和需要治疗的部位。因为本发明化合物的药动学和药效学特征会有某种程度的不同，因此在组织中获得治疗浓度的最优选方法是逐渐增加剂量并监测临床效果。对于这样的逐渐增加治疗剂量，初始剂量将取决于给药途径。
对于任何特定患者，具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的疾病、疾病严重程度、所用具体化合物的活性、给药途径、该具体化合物的清除速度、治疗持续时间、与该具体化合物联合或同时使用的具体药物、患者的年龄、体重、性别、饮食和一般健康状况等医药科学领域众所周知的因素。剂量水平通常为约10-200mg/kg/天，优选为约50-200mg/kg/天。
DNA梯带分析图谱。
其中←为对照细胞；↑为溶媒对照细胞；→为BC-4 25μM作用24小时的细胞；↓为BC-4 50μM作用24小时的细胞；°为BC-475μM作用24小时的细胞；±为DNA梯带分析图谱，其中1为对照细胞，2-4分别为BC-4 25，50，75μM作用24小时的细胞。图6BC-4对MDA/HER-2人乳腺癌细胞诱导凋亡的形态学观察图7BC-4对IFNγ处理的MV3细胞凋亡诱导作用的流式细胞仪检测结果(A)及形态学观察(B)图8BC-4对HT-1080人纤维肉瘤细胞分泌金属蛋白酶的抑制作用，其中1为对照细胞；2为溶媒对照细胞；3-6为BC-4 3.125，6.25，12.5，25μM作用24小时的细胞。图9BC-4对HT-1080人纤维肉瘤细胞诱导凋亡作用的形态学观察，其中A为Wright-Giemsa染色光镜观察图(左侧为对照细胞，右侧为凋亡细胞)；B为吖啶橙染色荧光显微镜观察图(左侧为对照细胞，右侧为凋亡细胞)；C为电镜观察图(左侧为对照细胞，右侧为凋亡细胞)。图10BC-4对HT-1080人纤维肉瘤细胞诱导凋亡的DNA梯带分析图谱，其中1为对照细胞，2-4为BC-4 25，50，75μM作用24小时的细胞；5为100bp DNA分子量标记。图11BC-4对HT-1080人纤维肉瘤细胞诱导凋亡的流式细胞仪检测结果，其中A为对照细胞，凋亡细胞百分率为0.42％；B为BC-4 25μM作用24小时的细胞，凋亡细胞百分率为1.85％；C-D为BC-4 50μM作用24，36小时的细胞，凋亡细胞百分率分别为9.00％，59.3％；E-G为BC-4 75μM作用8，12，24小时的细胞，凋亡细胞百分率分别为13.5％，18.7％，76.5％。图12BC-4对原代培养人脐静脉血管内皮细胞诱导凋亡的流式细胞仪检测图谱，BC-4未引起细胞凋亡。
其中←为对照细胞；↑为溶媒对照细胞；→为BC-4 25μM作用24小时的细胞；↓为BC-4 50μM作用24小时的细胞；°为BC-4
75μM作用24小时的细胞。
权利要求
1.乙酰乳香酸在制备抗肿瘤药物中的应用，其中所述肿瘤不包括白血病。
2.乙酰乳香酸在制备肿瘤转移抑制剂中的应用，其中所述肿瘤不包括白血病。
3.权利要求1所述的应用，其特征在于所述肿瘤包括膀胱癌、乳腺癌、黑色素瘤和纤维肉瘤。
4.权利要求2所述的应用，其特征在于所述肿瘤包括膀胱癌、乳腺癌、黑色素瘤和纤维肉瘤。
5.权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物可以制备成霜剂、片剂、胶囊、丸剂、可分散粉剂、粒剂、栓剂、糖浆剂、酏剂、锭剂、注射溶液、非水溶液、悬浮液或乳液的形式。
6.权利要求2所述的应用，其特征在于所述药物可以制备成霜剂、片剂、胶囊、丸剂、可分散粉剂、粒剂、栓剂、糖浆剂、酏剂、锭剂、注射溶液、非水溶液、悬浮液或乳液的形式。
全文摘要
本发明涉及从中药乳香(Boswellia carterii Birdw.)中提取的乙酰乳香酸(BC－4)作为抗肿瘤药物的新用途，即药物的第二次使用。本发明发现BC－4具抗肿瘤细胞增殖、诱导恶性细胞凋亡、抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖、抑制动物移植性肿瘤的生长、抑制恶性肿瘤的转移等新作用，体内、外的研究表明BC－4毒性很低，是一个极好的抗肿瘤药物和肿瘤转移抑制剂。
文档编号A61K31/56GK1436533SQ02103178
公开日2003年8月20日 申请日期2002年2月4日 优先权日2002年2月4日
发明者韩锐, 赵万洲, 付招娣, 刘红岩, 方起程, 周金云, 崔锐 申请人:中国医学科学院药物研究所