一种河豚毒素偶联物及含有该偶联物的药物组合物的制作方法

专利名称：一种河豚毒素偶联物及含有该偶联物的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种河豚毒素(以下简称TTX)的偶联物，其包含河豚毒素、连接剂以及通过所述连接剂与河豚毒素共价偶联的载体，所述载体选自中国鲎血蓝蛋白(以下简称TTH)、或破伤风类毒素(以下简称TT)、或与其具有相当生物学功能的片段。本发明还涉及制备本发明河豚毒素偶联物的方法。本发明还涉及含有该河豚毒素偶联物的药物组合物，以及所述河豚毒素偶联物用于制备预防河豚毒素中毒的药物组合物的用途。
背景技术：
TTX是产自河豚鱼等海洋生物的小分子、高毒性的神经性毒素，它阻滞钠离子通道，阻滞神经传导，引起神经、横纹肌、呼吸肌麻痹，因呼吸衰竭而致死亡。
一方面，在我国沿海、韩国、日本、东南亚等地区因食河豚鱼等中毒事件屡有发生，其死亡率可高达30-60％。对于河豚毒素中毒，至今无特效抗毒药，临床救治中毒病人基本采用对症治疗，常常无法挽救重症中毒者的生命。另一方面，TTX已被列入禁止化学武器公约中有毒化学品清单，具有潜在的军事价值。实际上，作为潜在的生化战剂，TTX一直也是外军防护研究的重点目标。因此，迫切需要研究TTX中毒的防治措施，特别是研制一种能预防和/或对抗TTX中毒的药剂，不但能够在平时用于研制河豚毒素的抗毒素，进而用于救治中毒病人，研制可供侦检用的灵敏的免疫检毒方法，而且在战时还可用于防护涉毒者免于死亡。
曾经报道过关于TTX中毒的免疫预防研究，Fukiya S和MatsumuraK以匙孔血蓝蛋白(KLH)为载体制得的人工抗原TTX-HCHO-KLH，用其免疫小鼠，静脉内注射(ip)TTX 1.5、3.0、4.5、6.0MU攻毒(MU小鼠单位，1MU＝0.22μg/20g体重＝11μg/kg)，实现的存活率分别为8/8、7/8、4/8、和3/8(Fukiya S & Matsumura KToxicon 301631-4，1992)。目前，尚未见有其他有关TTX疫苗的详实、系统的研究。
发明概述本发明的一个方面，涉及一种河豚毒素的偶联物，其包含河豚毒素、连接剂以及通过所述连接剂与其共价偶联的载体，所述载体选自中国鲎血蓝蛋白、或破伤风类毒素、或其具有相当生物学功能的片段。
本发明的另一方面，涉及一种制备上述河豚毒素偶联物的方法。
本发明的又一方面，涉及所述河豚毒素偶联物用于制备预防河豚毒素中毒的药物组合物的用途。
本发明的再一方面涉及含有上述河豚毒素偶联物的药物组合物。


图1。利用不同载体蛋白制备的河豚毒素偶联物疫苗的抗毒效价结果，其中纵坐标为存活百分比，横坐标为给药剂量。试验中1个致死剂量(LD)＝13.5μg.kg-1(腹腔给药，ip)，计算24小时内存活率，每组采用12只小鼠。
图2。河豚毒素偶联物疫苗的累积抗毒效价。
图3。TTX疫苗抗TTX攻毒的时效(ip)。其中L组16鼠(总活存151/152＝99.3％)；M组14鼠(总活存117/126＝92.9％)；中毒对照45鼠全部死亡。
发明详述长期以来，无论从民用还是从军用角度出发，一直期望开发一种能够有效预防和/或对抗河豚毒素中毒的药剂。
为此目的，本发明人采用化学免疫的途径，通过化学偶联制备了一种河豚毒素偶联物，其包含河豚毒素、连接剂以及通过所述连接剂与其共价偶联的载体，所述载体选自中国鲎血蓝蛋白、或破伤风类毒素、或其具有相当生物学功能的片段。
众所周知，因TTX分子量小(MW＝319)，本身无免疫原性。因此需要通过与适当的载体偶联，以引发机体对河豚毒素的免疫反应。在本发明中，可以用作河豚毒素的载体蛋白包括但不限于中国鲎血蓝蛋白、破伤风类毒素、独眼鲎血蓝蛋白(LPH)、白喉类毒素(DT)。在本发明的一个实施方案中，采用中国鲎血蓝蛋白作为载体蛋白。在本发明的又一实施方案中，采用破伤风类毒素作为载体蛋白。
为实现本发明的目的，本发明所述的河豚毒素偶联物中，所述河豚毒素与载体蛋白的摩尔比例依所选载体蛋白的不同而不同。在本发明中，当所选载体蛋白为中国鲎血蓝蛋白时，河豚毒素与中国鲎血蓝蛋白的摩尔比例为200-1500∶1，优选为250-450；1，特别优选为300∶1；当所选载体蛋白为破伤风类毒素时，所述河豚毒素与载体破伤风类毒素的比例为10-35∶1，优选为15-25∶1，特别优选为20∶1。
本发明中，采用适当的连接剂将河豚毒素与所选载体蛋白通过共价结合的方式偶联。适于本发明的连接剂选自甲醛和戊二醛，优选为甲醛。
本发明的另一方面，提供了一种制备本发明所述河豚毒素偶联物的方法，其中包括如下步骤1)依据期望的河豚毒素与载体蛋白的比例，将河豚毒素与载体蛋白以合适比例混合于pH6.8-7.0的适当的缓冲体系中；2)加入连接剂至终浓度1-2％，在30℃反应72小时；3)所得反应液进一步于4℃在搅拌下透析，去除未结合的游离毒素。
由前述可知，本发明制备所述河豚毒素偶联物的方法中，当所选载体蛋白为中国鲎血蓝蛋白时，在制备过程中所加入的河豚毒素与载体中国鲎血蓝蛋白的摩尔比例为400-3200∶1，优选为600-1500∶1，特别优选为900-1100∶1；当所选载体蛋白为破伤风类毒素时，加入的河豚毒素与载体破伤风类毒素的摩尔比例为10-70∶1，优选为12-50∶1，特别优选为20-40∶1。
在本发明所述的制备河豚毒素偶联物的方法中，所述连接剂选自甲醛和戊二醛，优选为甲醛。
在本发明所述的制备河豚毒素偶联物的方法中，其中步骤1)中所用的缓冲体系可以选自磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH2.2-8.0)，柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液(pH2.2-6.5)，柠檬酸缓冲液(pH3.0-6.6)，醋酸缓冲液(pH3.6-5.8)，磷酸缓冲液(pH5.8-8.0)，巴比妥-盐酸缓冲液(pH6.8-9.6)，Tris-HCl缓冲液(pH7.1-8.9)，硼酸-硼砂缓冲液(pH7.4-9.0)，碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH9.2-10.8)；其中优选的缓冲体系为柠檬酸缓冲液(pH3.0-6.6)，醋酸缓冲液(pH3.6-5.8)，磷酸缓冲液(pH5.8-8.0)，特别优选为磷酸缓冲盐水系统和Tris-HCl缓冲液。本领域技术人员知晓，可选用适当的缓冲体系，只要其能够提供pH为4.0-8.0的缓冲环境。
在本发明所述的制备河豚毒素偶联物的方法中，步骤2)中所用连接剂的浓度依据所选的连接剂的不同而不同。当所选连接剂为甲醛时，其终浓度为0.5-2％，优选为1-2％，最优选为1.5％。在本发明所述制备河豚毒素偶联物的方法中，其中步骤2)反应温度为25-37℃，优选为30-37℃，最优选为30℃，反应时间为24小时-72小时，优选为72小时。
通过本发明所述方法制备河豚毒素偶联物，减少了蛋白的变性凝聚，提高了抗原质量。改变了产物保藏条件，最大限度地降低了逆反应，减少了疫苗的毒副作用；改善了产物的稳定性，反应产物可批量制备，并能长期保存，因此当用作免疫原时，免疫原无须“即制即用”，避免了繁复冗长的免疫原制备程序。
本发明的又一方面，涉及了本发明所述的河豚毒素偶联物的用途，特别是用于制备预防河豚毒素中毒的药物组合物的用途，和用于研制人用TTX的抗毒疫苗。本发明所述的河豚毒素偶联物可用于免疫动物制备单克隆抗体、抗血清、或抗毒素。所得抗体进而可用于食用河豚毒鱼类中毒者、或当TTX作为药用(戒毒或镇痛)时可能发生的意外中毒者、或可能的恐怖活动的受害者的急救治疗。本发明所述的河豚毒素偶联物还能作为研究用重要试剂，被用于免疫亲和层析以纯化TTX抗体，以及用作免疫分析试剂用于检测TTX，或用于TTX的毒理学研究。本发明所述河豚毒素偶联物所制备的抗体还可用作电生理研究的工具，用于免疫传感器和免疫检测方法的研究。这些手段可用于河豚毒素的毒代动力学研究、药用时血药浓度的监测、海洋养殖业、海洋食品加工业和出口贸易的安全检查，以及战时战剂的侦检消防。
本发明的再一方面，公开了一种预防河豚毒素中毒的药物组合物，其中包含本发明所述的河豚毒素偶联物，以及适当的赋型剂或佐剂。根据免疫学和制剂学公知的常识，本领域技术人员知晓，如何选择适宜于本发明的用途的药物组合物中的赋型剂或佐剂等辅料。
下面，结合附图以及用于阐明本发明的实施例，对本发明进行进一步描述。
实施例1。中国鲎血蓝蛋白的制备采集血淋巴液中国南海及北部湾捕捞得中国鲎，选刚出海、活动良好之雌性健康鲎，将其身体向腹部弯曲成近90°角。无菌条件下从淡蓝色血窦内抽取血淋巴液，用0.125％马来西胺与鲎血以1∶2(v/v)混匀抗凝。
超离心分离蛋白将如上获得的血样品离心(10000g，30分钟，10℃)，弃白色细胞沉淀物；所得上清液进一步离心(80000g，2小时，10℃)，弃上清；以3％NaCl洗涤收集沉淀物，再次离心(10000g，30分钟，10℃)，弃少许沉淀；取蓝色上清液100ml对3000ml生理盐水透析18小时，再次离心(10000g，1小时，10℃)， 弃少许沉淀；将所得蓝色上清液再离心(80000g，2小时，10℃)，弃上清；沉淀以磷酸缓冲液(PB)(NaH2PO4-Na2HPO4，20mM，pH7.4)稀释成蓝色溶液，冷冻干燥后保存备用。
按照文献所述超离心法(Hitachi 282超速离心机，实用生物化学原理及技术，p50，科学出版社，1979，B.L.威廉斯，K.威尔逊编，王海云，冯北元译。)测定蛋白分子量，计算得如上制备的TTH之MW约为3000kd。
实施例2河豚毒素偶联物的制备1.TTX-TTH的制备室温下，称取载体蛋白TTH溶于20mM PBS(pH6.8)，紫外分光光度法测定并校正浓度至5mg/ml。取含10mg蛋白的溶液2ml，加入TTX 1mg(溶于1ml水)，PBS 1ml洗TTX安瓿液，合并后混匀。其中，当TTX与TTH的重量比为1∶10时，其摩尔比约为940∶1。
向所得合并液中分次逐滴加入37％甲醛共170μl，达终浓度1.5％；混匀后，置水浴振荡器内固定，于30℃缓慢振荡反应72小时。所得反应液于4℃在搅拌下对1000ml的20mM PBS(pH7.2)透析2天，其间换液6次，去除未发生偶联的毒素。
分装反应偶联物，-20℃保存备用。按文献方法测定所得偶联物中毒素与载体的分子结合比(Habeeb，AFSA，Anal.Biochem.，vol 14328-336)。
2.TTX-TT的制备室温下，称取载体蛋白TT溶于20mM PBS(pH6.8)，紫外分光光度法测定并校正浓度至4mg/ml。取含8mg蛋白的溶液2ml，加入TTX1mg(溶于1ml水)，PBS 1ml洗TTX安瓿液，合并后混匀。其中，当TTX与TT的重量比为1∶8时，其摩尔比约为26∶1。
向所得合并液中分次逐滴加入37％甲醛共170μl，达终浓度1.5％；混匀后，置水浴振荡器内固定，于30℃缓慢振荡反应72小时。所得反应液于4℃在搅拌下对1000ml的20mM PBS(pH7.2)透析2天，其间换液6次，去除未发生偶联的毒素。
分装反应偶联物，-20℃保存备用。按文献方法测定所得偶联物中毒素与载体的分子结合比(Habeeb，AFSA，Anal.Biochem.，vol 14328-336)。
实施例3。五种不同载体蛋白制备的河豚毒素偶联物的比较根据实施例2中所述的制备方法，申请人分别以中国鲎血蓝蛋白、独眼鲎血蓝蛋白(LPH)、破伤风类毒素、白喉类毒素(DT)和牛血清白蛋白(BSA)等五种载体蛋白制备了不同的河豚毒素偶联物实验疫苗(以下分别简称为TTX-TTH、TTX-LPH、TTX-TT、TTX-DT和TTX-BSA)，分别研究了所述偶联物对免疫小鼠抗体生成速度、抗体质量和抗毒效价的影响。
结果表明，采用了TTH的一组兼具效价高，副反应小等优点，可作首选者；采用TT的组中，由于TT作为疫苗早已用于人类，从效价及安全性看，TT也不失为优选对象；LPH虽与TTH性质类同，但效果较差。DT组效价较差且副反应大，BSA组的免疫应答反应最差(具体结果参见表1和图1，其中图1中所述的具体数据见表2)。
表1.不同载体蛋白疫苗免疫组间抗体水平的统计学比较抗体滴度(n) 组间显著性差别组别 样本数(x±s) BSA DT LPH TTTTHTTH 12 5.4±0.3 *** *** * **---TT12 4.8±0.5 *** ** - ---LPH 12 4.8±0.7 *** * ---DT12 4.2±0.4 *---BSA 12 3.8±0.4 ---组间比较-p＞0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001n为有阳性反应的血清稀释倍数的对数值(ELISA法)表2.不同载体TTX抗毒疫苗的抗毒效价活存组别 1LD 2LD 3LD 4LD存活/总数 ％ 存活/总数 ％存活/总数 ％存活/总数 ％对照 0/12 0 0/12 0TTH12/12 100 12/12 100 11/12 91.6 6/12 50TT 12/12 100 9/12 91.7 9/12 755/12 41.7LPH11/12 91.7 7/12 58.3 5/12 41.7 2/12 16.7DT 11/12 91.7 5/12 41.7 1/12 8.3 0/12 0BSA9/12 755/12 41.7 0/12 0 0/12 0
实施例4。本发明TTX-TTH偶联物针对不同试验动物的抗毒效价1)用本发明TTX-TTH偶联物免疫的小鼠对经腹腔和肠胃道施用TTX的抗毒效价测定a)对于腹腔施用TTX的抗毒效价测定；BALB/c小鼠经人工抗原TTX-TTH免疫注射。血内抗体质量逐渐上升，至4月达稳定。5个月时接受抗原总量(以载体蛋白计)500μg/鼠，单次腹腔(ip)施用TTX并逐次提高剂量作实毒攻毒。结果表明，BALB/c对照鼠ip 1LD(13.5μg/kg)，累计25鼠全部死亡。实验鼠38只，2倍致死剂量(LD)攻毒全部存活；3LD存活97.4％；半数动物可耐受12LD存活；5％动物最高耐受24-26LD攻毒而健康存活(结果参见表3)。攻毒死亡动物的生存时间显著延长(参见表4)，因此可为综合治疗赢得时间。
表3.TTX疫苗在小鼠的抗毒效价TTX剂量 存活组别 动物数(×LD)动物数 ％中毒对照 25 1 0 02 38 1003 37 97.44 31 81.66 25 65.81121 55.31219 50.0免疫鼠38 1416 42.11613 34.21812 31.6207 18.4224 10.5242 5.3261 2.61LD＝13.5μg/kg；BALB/c，♀；ip中毒后24h计存活鼠数。
表4.免疫组和对照组TTX攻毒死亡鼠生存时间比较TTX剂量 存活时间(min)组别 动物数(×LD) x±s 范围对照 1 25 19±10 10～573～5 6 224±478*16～1200免疫鼠 14～18 8 182±299**14～90020～24 8 117±144**30～3721LD＝13.5μg/kg；BALB/c，♀；ip*p＜0.05，**P＜0.01；t检验。
b)对于胃肠道施用TTX的抗毒效价测定BALB/c小鼠分别经人工抗原TTX-TTH和TTX-TT免疫注射，抗原总量达450μg/鼠，单次胃肠道(ig)施用TTX并逐次提高剂量作实毒攻毒。以载体TTH和TT免疫的对照鼠各5只，ig TTX 600μg/kg全部死亡。两组实验鼠共21只，组间抗毒效价无明显差别，单次分别ig TTX630、800、1200、1500、2000μg/kg时，存活率分别为100、95、90、70、45％。估测半数死亡耐受剂量约为2000μg/kg。最高耐受达2000μg/kg以上(结果参见表5)。此剂量约为人中毒致死剂量(0.5mg/50kg计)的200倍。
表5.TTX抗毒疫苗免疫鼠抗TTX灌胃攻毒效价TTX剂量 存活组别免疫原 动物数(μg/kg) 动物数 ％TTH5 600 00对照组TT 5 600 00630 10 100800 990TTX-TTH101200 8801500 8802000 550实验组630 10 100800 10 100TTX-TT 101200 10 1001500 7702000 440
2)用本发明TTX-TTH偶联物免疫的家兔对肌内施用TTX的效价测定家兔经TTX-TTH免疫6个月，抗原量达3.6mg/兔，单次肌内(im)施用TTX并逐次提高剂量作实毒攻毒。正常家兔6只，im TTX 1LD(6μg/kg)全部死亡。实验兔9只，1LD全活，无明显症状(后一兔因感染耳、脚癣死亡)；半数动物4LD存活；1/4动物最高耐受16LD无明显症状或只有轻微症状。
实施例5。河豚毒素-TTH偶联物疫苗的累积抗毒效价a)对于腹腔施用TTX的累积抗毒效价测定；如上述实施例4中所述，采用本发明河豚毒素-TTH偶联物疫苗免疫小鼠38只，经2-5次ip TTX重复攻毒，全部动物可累积耐受2LD以上；70％的动物累积耐受20LD以上，56％的动物累积耐受40LD以上，15％的动物累积耐受60LD以上，其中动物的最高累积耐受高达104LD(结果参见图2，关于图2的作图数据见下表6)。
b)对于胃肠道施用TTX的累积抗毒效价测定；另外，免疫小鼠21只，经2-5次ig TTX重复攻毒。仅14％动物(3鼠)累积耐受剂量低于2mg/kg；86％动物(18鼠)累积耐受剂量高于3.5mg/kg；43％动物(9鼠)累积耐受剂量高于5.5mg/kg(人的口服中毒死亡剂量约为0.5mg/50-70kg体重)。
表6.免疫鼠耐受TTX攻毒累积剂量范围分布TTX攻毒累积剂量范围(LD)样本类别2-9 20-39 40-59 60-79 90-109总数存活鼠 ％存活鼠 ％存活鼠 ％存活鼠 ％存活鼠 ％分段计 27 8 29.6 4 14.8 11 40.7 2 7.4 2 7.4累积计 27 27 100 19 70.4 15 55.6 4 14.8 2 7.4
这些结果表明利用本发明所述河豚毒素偶联物免疫动物后，一旦抗体生成，动物可在长时期内反复耐受多次高倍致死量毒素的挑战，具有明显优于现有技术的效果。
实施例6.本发明河豚毒素偶联物疫苗的长效性测定小鼠按免疫方案不同分为两组，经TTX-TTH免疫达总剂量450μg/鼠。于末次免疫(4.5月)后d7-d11，每日1次共5次；其后每10d一次又4次；以后每月1次，每次ip 1LD(13.5mg/kg)TTX攻毒作长期抗毒效价测试。其间各次累积中毒对照鼠45只无一存活。首次免疫后一年(末次免疫后8个月)内，累积15LD攻毒后，L组16鼠，平均存活率99.3％；M组14鼠平均存活率92.9％；两组总存活率96.4％(结果参见图3)。其后继续每月攻毒，抗体质量略下降，攻毒动物渐出现死亡，但仍大部存活。至首次免疫后21个月，末次免疫后16.3个月，累积23LD，仍有约11％老龄鼠存活。其中存活最长的动物在首次免疫后24月内耐受了累积26(次)LD攻毒仍存活，后期动物大多因接近小鼠自然寿命(1.5-2年，见《药理学实验》(第二版)，p236，章元沛主编，人民卫生出版社)衰老而死亡。结果表明，实验疫苗自首次免疫后一年内抗1LD基本有效，一年后大部分有效，实验疫苗时效性好。上述附图3中的作图数据如下表7所示。
表7.免疫鼠于末次免疫后多次ip TTX攻毒后存活情况攻毒 首次免疫 末次免疫存活率(存活数/受试动物数)(％)次序 后(天)后(天)L组 M组 总计1 145 7 16/16(100)12/14(85.7) 28/30(93.3)2 146 8 13/14(92.9) 9/12(75) 22/26(84.6)3 147 9 13/13(100)9/9(100) 22/22(100)4 148 1013/13(100)8/9(88.9)21/22(95.5)5 149 1111/11(100)8/8(100) 21/21(100)6 158 2011/11(100)8/8(100) 19/19(100)7 168 3011/11(100)8/8(100) 19/19(100)8 179 4111/11(100)8/8(100) 19/19(100)9 200 6211/11(100)8/8(100) 19/19(100)10230 929/9(100) 7/8(87.5)16/17(94.1)11260 122 9/9(100) 7/7(100) 16/16(100)12291 153 9/9(100) 7/7(100) 16/16(100)13321 183 5/5(100) 7/7(100) 12/12(100)14351 213 4/4(100) 6/7(85.7)10/11(90.9)15378 240 3/3(100) 5/6(83.3)8/9(88.9)16412 274 2/3(66.7) 4/5(80) 6/8(75)17444 306 1/2(50) 3/4(75) 4/6(66.7)18473 335 1/1(100) 2/3(66.7)3/4(75)19511 373 1/1(100) 2/2(100) 3/3(100)20532 394 1/1(100) 2/2(100) 3/3(100)21564 426 1/1(100) 2/2(100) 3/3(100)22594 456 1/1(100) 2/2(100) 3/3(100)23630 488 1/1(100) 2/2(100) 3/3(100)24656 514 1/1(100) 1/1(100) 2/2(100)25692 550 1/1(100) 1/1(100) 2/2(100)26720 578 (衰老死亡)1/1(100) 1/1(100)每次ip TTX 13.5μg/kg，观察24h存活率。累积中毒对照组45鼠全部死亡。
综上，由本发明研制的TTX抗毒疫苗在小鼠ip攻毒效价远高于日本学者，Fukiya当施用3LD和6LD时，存活率分别为87.5％和37.5％；而本发明分别为97.4％和65.8％。实际情况下，口服是主要的TTX中毒途径，本发明从这一实际出发首家在小鼠验证了疫苗抗ig中毒的效价。此外，疫苗的长效性证据，疫苗的最佳载体蛋白选定，以及疫苗在家兔im攻毒的抗毒的高效价等也均属国内外首家报告。
权利要求
1.一种河豚毒素偶联物，其包含河豚毒素、连接剂以及通过所述连接剂与所述河豚毒素共价偶联的载体，所述载体选自中国鲎血蓝蛋白、或破伤风类毒素、或与其具有相当生物学功能的片段。
2.根据权利要求1所述的河豚毒素偶联物，其中所述河豚毒素与载体中国鲎血蓝蛋白的摩尔比例为200-1500∶1，优选为250-450∶1，特别优选为300∶1；所述河豚毒素与载体破伤风类毒素的摩尔比例为10-35∶1，优选为15-25∶1，特别优选为20∶1。
3.根据权利要求1所述的河豚毒素偶联物，其中所述连接剂选自甲醛和戊二醛。
4.一种制备权利要求1所述河豚毒素偶联物的方法，其中包括如下步骤1)依据期望的河豚毒素与载体蛋白之比，在室温下将河豚毒素与载体蛋白以合适的加入比混合于pH6.8-7.0的适当的缓冲体系中；2)加入连接剂至终浓度1-2％，在30℃反应72小时；3)所得反应液进一步于4℃在搅拌下对缓冲液透析，去除未结合的游离毒素。
5.根据权利要求4所述的方法，其中当所选载体蛋白为中国鲎血蓝蛋白时，所加入的所述河豚毒素与载体中国鲎血蓝蛋白的摩尔比例为400-3200∶1，优选为600-1500∶1，特别优选为900-1100∶1；加入的所述河豚毒素与载体破伤风类毒素的摩尔比例为10-70∶1，优选为20-50∶1，特别优选为20-40∶1。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述连接剂选自甲醛和戊二醛。
7.权利要求4所述的方法，其中步骤1)中所用的缓冲体系选自磷酸缓冲盐水系统；步骤2)中所用连接剂的终浓度为0.5-2％；反应温度为25-37℃，反应时间为24-72小时。
8.权利要求1所述的河豚毒素偶联物的用途，其用于制备预防河豚毒素中毒的药物组合物，制备相应的单克隆抗体、抗血清、或抗毒素；用作人用TTX抗毒疫苗组分，预防TTX中毒；作为研究试剂，用于免疫亲和层析纯化TTX抗体，以及用作免疫分析试剂检测TTX；以及利用所制备的抗体用于电生理研究、河豚毒素的毒代动力学研究、河豚毒素血药浓度的监测、海洋养殖业、海洋食品加工业和出口贸易的安全检查以及战时战剂的侦检消防。
9.一种预防河豚毒素中毒的药物组合物，其中包含权利要求1所述的河豚毒素偶联物，以及适当的赋型剂或佐剂。
全文摘要
本发明涉及一种河豚毒素(以下简称TTX)的偶联物，其包含河豚毒素、连接剂以及通过所述连接剂与河豚毒素共价偶联的载体，所述载体选自中国鲎血蓝蛋白、或破伤风类毒素、或与其具有相当生物学功能的片段。本发明还涉及制备本发明河豚毒素偶联物的方法。本发明还涉及含有该河豚毒素偶联物的药物组合物，以及所述河豚毒素偶联物用于制备预防河豚毒素中毒的药物组合物的用途。
文档编号A61P39/00GK1465403SQ0212314
公开日2004年1月7日 申请日期2002年6月19日 优先权日2002年6月19日
发明者徐勤惠, 荣康泰 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所, 中国人民解放军军事医学科学院毒物药