专利名称：一种金丝桃苷的制备方法及药物新用途的制作方法
技术领域：
本发明所涉及的黄蜀葵花为锦葵科秋葵属植物黄蜀葵的干燥花，金丝桃苷为槲皮素-3-O-β-半乳糖苷，文献报道，常用提取分离工艺为醇提一水溶一醋酸乙酯提取，得总黄酮，再用甲醇分步结晶，得金丝桃苷。因金丝桃苷在醋酸乙酯中溶解度不大，需要数拾次提取，该方法不仅成本高，而且得率低。
金丝桃苷的药理活性，文献报道，有保肝，降酶，降压，止痛和抗心、脑缺血等药理作用。
发明内容
本发明目的在于提供一种金丝桃苷的制备方法及药物新用途。
本发明目的是通过如下技术方案实现的将干燥的黄蜀葵花粉碎成粗粉，用10-30倍量的亲水性溶剂加热回流提取或冷浸渗滤提取，热提2-3次，每次1-3小时，然后将提取液于低于60℃条件下减压浓缩至比重1.15-1.30(70℃)的浸膏；加入原生药量4-6倍量热水，分次溶解，静置24小时，过滤，滤液上聚酰胺为载体的柱层析，用水冲洗及用水∶醇比例为50∶50-5∶95的水一醇混合溶剂洗脱，收集水一醇洗脱液，于低于60℃的条件下减压浓缩，真空干燥后得粗提取物；再用20-40倍量的醋酸乙酯一乙醇混合溶剂加热回流提取2-3次，每次1-3小时，然后将提取液于低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥后得精制黄蜀葵花提取物。
取精制黄蜀葵花提取物加10倍量醇溶剂加热回流提取2小时，趁热过滤，滤液减压浓缩至1/2-1/3体积，室温放置24小时后，滤取结晶；用3-5倍量醇加热回流2小时，溶解结晶，趁热过滤，滤液于室温放置24小时后，滤取结晶；再用3-5倍量醇复结晶一次，滤取结晶，干燥，得金丝桃苷。
上述方法中热提2-3次，每次1-3小时也可以是冷提1次，48-88小时；上述方法中所述的亲水性溶剂为脂肪族低级醇或低级酮；上述方法中所述用于柱层析洗脱的水一醇混合溶剂中的醇为脂肪族低级醇；上述方法中所述用，醋酸乙酯—乙醇混合溶剂为共沸点混合溶剂或醋酸乙酯∶乙醇比例为2∶1或1∶1或1∶2的醋酸乙酯—乙醇混合溶剂。
上述方法中所述醇溶剂为脂肪族低级醇。
本发明是提供下述实验例及实施例实现的。
实验例1金丝桃甙在2.2.15细胞培养内乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原的作用材料和方法一、药物金丝桃甙系安徽省天科药物研究所、北京军医学院提供。实验时用培养液配成8mg/ml溶液。
二、2.2.15细胞乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆转染人肝癌细胞(HepG2)的2，2，15细胞系，美国Mounf Sinai医学中心构建，自行传代培养。
三、试剂DMEM干粉，胎牛血清，G-418均为美国GIBCO公司产品；HBsAgHBeAg固相放射免疫测定盒，购自中国同位素公司北方免疫试剂研究所；青霉素、链霉素、卡那霉素华北制药厂四、实验用品及仪器培养瓶，丹麦Tuneion TM培养板，96孔板，24孔板，美国Coming公司产品二氧化碳孵箱，美国Shel-Lab产品；2，2，15细胞培养液及试剂配制DMEM培养液100ml含胎牛血清10％，G418380ug/ml细胞消化液0.25％胰酶，用Hanks液配制。
五、实验方法(一)2，2，15细胞培养在长满2.2.15细胞的培养瓶内加0.25％胰酶，37℃消化3分钟，加培养液吹打，1∶3传代，10天长满，加入细胞计数板计数，配制成每毫升10万个细胞接种细胞培养板，96孔板每孔0.2ml，24孔板每孔1ml，37℃5％CO2培养24小时，细胞长成单层后进行实验。
(二)药物对细胞毒性试验药物金丝桃甙用培养液配制成16mg/ml溶液，以2倍稀释至0.25medml加入96孔细胞培养板，每浓度3孔，每4天换同浓度药液，设无药物细胞对照组。以观察细胞病变为指标，8天显微镜下观察细胞病变，完全破坏为4；75％为3；50％为2；25％为1；无病变为0。计算每浓度药液平均细胞病变程度和抑制％。按Reedmeuench法计算TC50，TC0。
(三)药物对HBsAg、HBeAg抑制试验每毫升10万个2.2.15细胞接种24孔细胞培养板，每孔1ml，37℃5％CO2培养24小时，加无毒浓度以下2倍稀释试验药液，3个稀释度分别为2mg/ml；1mg/ml；0.5mg/ml，每浓度3孔，37℃5％CO2培养，每4天换原浓度药液培养，第8天时收获培养液，-20℃冰冻保存。测定HBsAg和HBeAg。实验设HBsAgHBeAg阳性和阴性对照和细胞对照。
1.HBsAg和HBeAg测定用中国同位素公司北方免疫试剂研究所产品，固相放射免疫测定盒测定。
2.药物效果计算计算细胞对照及每浓度cpm均值及标准差，抑制百分率(％)、半数有效浓度(IC50)。
结果一、金丝桃苷在2，2，15细胞培养中的细胞毒性为观察金丝桃苷对乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌2.2.15细胞的毒性，在接种2，2，15细胞后24小时，加2倍稀释药液。实验自8mg/ml开始8；4；2；1；0.5mg/ml。4天换一次药液，维持8天，用显微镜观察细胞病变，按公式计算半数有毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)，实验结果为TC50mg/ml，无毒浓度TC08mg/ml。见表1。
表1金丝桃苷、罗总黄酮对2.2.15细胞毒性观察结果细8421 0 TC50mg/ml TC0mg/ml胞4400 0 3.312.0病4300 0变4200 0程4200 0度100 68.7500 0破坏％二、金丝桃苷在细胞培养中对HBsAg、HBeAg表达的作用二批实验结果表明，金丝桃苷各浓度组在第4天、8天对2.2.15细胞HBsAg、HBeAg的表达具有较好的抑制作用。见表2，表3。
表2金丝桃苷在2.2.15细胞中对HBeAg的影响
与细胞对照相比，p＜0.01*p＜0.05表3.金丝桃苷在2.2.15细胞对HBsAg的影响
与细胞对照相比，**p＜0.01*p＜0.05本实验在乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌细胞系2.2.15细胞中，研究金丝桃甙对细胞的毒性和对HBsAg和HBeAg分泌的抑制效果。实验结果表明金丝桃苷最大无毒浓度(TC0)为2mg/ml。金丝桃苷在2，2，15细胞培养中4天、8天无毒浓度对HBsAg、HBeAg的分泌具有明显抑制作用。
实验例2金丝桃甙在鸭体内对鸭乙型肝炎病毒感染的治疗效果材料和方法(一)药物金丝桃甙系安徽省天科药物研究所、北京军区医学院提供。用生理盐水配制。批号20020516阳性药物拉米夫定由葛兰素威康集团制药公司产品，用生理盐水配制。
(二)病毒鸭乙型肝炎病毒，鸭乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)强阳性血清，采自上海麻鸭，-70℃保存。
(三)动物1日龄北京鸭购自北京前进种鸭动物饲养场。
(四)试剂a-32P-dCTP购自北京福瑞生物技术工程公司。缺口翻译药盒购白普洛麦格公司(Promemla CO.)；Sephadex ML-50，FiColl PVP购白瑞典Pharmacia公司；SDS西德Merck公司产品；鱼精DNA、牛血清白蛋白为中国科学院生物物理所产品；硝酸纤维素膜0.45um AmerSham公司产品。
(五)实验方法1.鸭乙型肝炎病毒感染1日龄北京鸭，经腿胫静脉注射上海麻鸭DHBV-DNA阳性鸭血清，每只0.2ml，在感后7天取血，分离血清，-70℃保存待检。
2.药物治疗试验DHBV感染雏鸭7天后随机分组进行药物治疗试验，每组6只，第一批试验给药组分3个剂量组，分别为100，50，20mg/kg，口服，1天2次，10天。设病毒对照组(DHBV)，以生理盐水代替药物。阳性药用拉米夫定，口服给药50mg/kg，1天2次，10天。在感染后第7天即用药前(T0)，用药第5天(T5)，用药第10天(T10)和停药后第3天(P3)，自鸭腿胫静脉取血，分离血清，-70℃保存待检。
3.检测方法取上述待检鸭血清，每批同时点膜，测定鸭血清中DHBV-DNA水平的动态。按缺口翻译试剂盒说明书方法，用32p标记DHBV-DNA探针，并作鸭血清斑点杂交，放射自显影膜片斑点，在酶标检测仪测定OD值(滤光片为490nm)，计算血清DHBV-DNA密度，杂交斑点OD值作为标本DHBV-DNA水平值。
(六)药效计算1.计算每组鸭不同时间血清DNA OD值的平均值(X±SD)，并将每组鸭用药后不同时间(T5、T10)和停药后第3天(P3)血清DHBV-DNA水平与同组给药前(T0)OD值比较，采用配对t检验，计算t1、P1值。分析差异的显著性，判断药物对病毒感染的抑制效果。
2.计算每组鸭用药后小同时间(T5、T10)和停药第3天(P3)血清DHBV-DNA的抑制％，并作图，比较各组鸭血清DHBV-DNA抑制率的动态。
3.将给药治疗不同时间DHBV-DNA抑制率分别与病毒对照组相同时DNA的抑制率比较，采用成组t检验，作统计学处理，计算t2、P2值，分析差异的显著性，判断药效。
结果(一)日龄北京鸭感染DHBV后，血清DHBV-DNA动态DHBV-DNA感染鸭U服生理盐水后DHBV-DNA斑点杂交结果见表3，4。实验感染鸭30只，血清DHBV-DNA全部阳性。病毒对照组6只雏鸭感染后第了天血清DHBV-DNA全部阳性，实验全程21天内血清DHBV-DNA水平感染后基本十稳。
(二)阳性药拉米夫定对DHBV感染鸭血清DHBV-DNA的影响DHBV感染鸭口服阳性药拉米夫定50mg/kg，1天2次，10天。结果见表1、表2。配对分析，给药第5天(T5)，第10天(T10)与给药前(T0)的OD值比较，配对分析，有常显著性(P＜0.01)，给药后对血清DHBV-DNA抑制率率与病毒对照组，成组分析给药第5天(T5)和第10天(T10)有非常显著性差异，(P＜0.01)。停药后3天(P3)无统计意义学。
(三)金丝桃甙在DHBV感染鸭体内对鸭血清DHBV-DNA的影响实验结果表明1.第一批实验选用3个剂量组，见表3。分别为100，50，20mg/kg组，在给药前(T0)与给药后第5天(T5)、10天(T10)及停药后3天(P3)，取鸭血，分离血清，检测DHBV-DNA OD值，作自身比较。结果表明100mg/kg组在给药第5天，第10天(T10)和停药后3天(P3)鸭血清DHBV-DNAOD值与给药前(T0)比较，配对分析，有显著和非常显著的抑制作用。(P＜0.05，0.01)。成组分析，给药后第5天(T5)，鸭血清DHBV-DNAOD值与对照组比较，有非常显著的抑制作用。P＜0.01。未发现毒性反应。50mg/kg组在给药第5天，第10天(T10)和停药后3天(P3)鸭血清DHBV-DNAOD值与给药前门(T0)比较，配对分析，有非常显著的抑制作用。(P＜0.01)。成组分析，给药后第5天(T5)，10天(T10)及停药后3天(P3)，鸭血清DHBv-DNAOD值与对照组比较，有非常显著的抑制作用。(P＜0.01)。20mg/mg组在给药第10天(T10)，鸭血清DHBV-DNAOD值与给药前(T0)比较，配对分析，有显著的抑制作用。(P＜0.05)。成组分析，给药后第5天(T5)，10天(T10)及停药后3天(P3)，鸭血清DHBV-DNAOD值与对照组比较，无统计学意义。
表4.金丝桃甙口服在鸭乙型肝炎病毒感染鸭体内治疗组与病毒感染对照组甲乌血清DHBV-ONA OD值比较鸭数鸭血清DHBV-DNA OD490值(X±SD)实验 剂量组别(只)批次 mg/只 T0 T5 T10 P3bid×10生理盐水6 0.601±0.12 0.583±0.110.527±0.060.547±0.06金丝桃甙 100 6 1.657±0.20 1.262±0.19*1.181±0.19**1.258±0.16**506 1.834±0.15 1.176±0.20**0.976±0.37**0.749±0.19**206 0.995±0.1 0.845±0.210.175±0.20*1.228±0.243TC 50mg 6 1.311±0.21 0.890±0.24**0.723±0.14**1.130±0.15
统计处理t1，p1绐药组不同时间(T5、T10，P3)鸭血清DHBV-DNAOD值与感染前(T0)OD值比较(配对t检验)。*p1＜0.05，**p1＜0.01，***p1＜0.001。
表5.在鸭乙型肝炎病毒感染鸭体内口服金丝桃甙治疗组与病毒感染对照组鸭血清DHBV-DNA水平抑制率的比较实验 药物 剂量 鸭数 抑制率(％)批次mg/kg bid×10 (只) T5 T10 P3病毒对照6 2.37 9.90 7.24金丝桃甙 100 6 12.18**28.4923.34506 35.43**46.56**55.94**206 13.0727.19-24.693TC 50mg/kg 6 32.70**43.55**11.79统计处理t2，p2绐药组不同时间(T5、T10，P3)鸭血清DHBV-DNA水平与感染前(T0)比较的抑制％与病毒对照组抑制％比较(成组t检验)。p2＜0.05，**p2＜0.01，***p2＜0.001。
金丝桃甙在鸭乙型肝炎病毒感染鸭体内治疗实验，实验结果表明鸭乙型肝炎病毒感染鸭在感染后第7天口服金丝桃甙治疗，100mg/kg一天2次10天对感染鸭血清DHBV-DNA水平的抑制效果显著(P＜0.05-0.01)，无毒性反应；50mg/kg组，有非常显著的抑制作用。(P＜0.01)。20mg/kg组在给药第10天(T10)，鸭血DHBV-DNAOD值与给药前(T0)比较，配对分析，有显著的抑制作用。(P＜0.05)。阳性药拉米夫定口服对DHBV-DNA的抑制作用显著，与以往多次实验结果一致。以上实验结果表明金丝桃甙治疗鸭乙型肝炎病毒感染鸭有效，有效剂量为100-50mg/kg，一天2次，10天。
实施例取黄蜀葵花生药，粉碎，加10倍量70％乙醇加热回流提取2小时，共3次，合并提取液，放冷，过滤，减压回收乙醇至无醇时，并浓缩至相对密度为1.3(70℃)的浸膏；加相当于生药6倍量的沸水搅拌使溶解，过滤，滤液加于相当于生药7倍量，已处理好的14-30目，14×80cm聚酰胺柱上，用水冲洗至流出液呈淡黄色后，用70％乙醇洗脱，收集洗脱液乙醇至洗脱液呈淡黄色为止，用量为柱体积的7倍，减压回收乙醇，80℃真空干燥至干浸膏，粉碎，得粗提取物；再用10倍量醋酸乙酯—乙醇共沸点溶剂加热回流提取2小时，共3次，合并提取液，减压回收溶剂，80℃真空干燥得精制黄蜀葵花提取物(总黄酮含量≥50％)。
取精制黄蜀葵花提取物加10倍量95％乙醇加热回流提取2小时，趁热过滤，滤液减压浓缩至1/3体积，室温放置24小时后，滤取结晶；用4倍量95％乙醇加热回流2小时，溶解结晶，趁热过滤，滤液于室温放置24小时后，滤取结晶；再用4倍量95％乙醇复结晶一次，滤取结晶，干燥得金丝桃苷，金丝桃苷含量为90-98％。
权利要求
1.一种金丝桃苷原料药，其特征在于该金丝桃苷原料药含金丝桃苷为90-98％。
2.一种如权利要求1所述的金丝桃苷原料药的制备方法，其特征在于该制备方法为将干燥的黄蜀葵花粉碎成粗粉，用10-30倍量的亲水性溶剂加热回流提取或冷浸渗滤提取，热提2-3次，每次1-3小时，然后将提取液于低于60℃条件下减压浓缩至比重70℃下1.15-1.30的浸膏；加入原生药量4-6倍量热水，分次溶解，静置24小时，过滤，滤液上聚酰胺为载体的柱层析，用水冲洗及用水∶醇比例为50∶50-5∶95的水一醇混合溶剂洗脱，收集水一醇洗脱液，于低于60℃的条件下减压浓缩，真空干燥后得粗提取物；再用20-40倍量的比例为2∶1或1∶1或1∶2或共沸点的醋酸乙酯—乙醇混合溶剂加热回流提取2-3次，每次1-3小时，然后将提取液于低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥后得精制黄蜀葵花提取物；取精制黄蜀葵花提取物加10倍量醇溶剂加热回流提取2小时，趁热过滤，滤液减压浓缩至1/2-1/3体积，室温放置24小时后，滤取结晶；用3-5倍量醇加热回流2小时，溶解结晶，趁热过滤，滤液于室温放置24小时后，滤取结晶；再用3-5倍量醇复结晶一次，滤取结晶，干燥，得金丝桃苷。
3.如权利要求2所述的金丝桃苷原料药的制备方法，其特征在于该制备方法为取黄蜀葵花生药，粉碎，加10倍量70％乙醇加热回流提取2小时，共3次，合并提取液，放冷，过滤，减压回收乙醇至无醇时，并浓缩至相对密度为1.3(70℃)的浸膏；加相当于生药6倍量的沸水搅拌使溶解，过滤，滤液加于相当于生药7倍量，已处理好的14-30目，14×80cm聚酰胺柱上，用水冲洗至流出液呈淡黄色后，用70％乙醇洗脱，收集洗脱液乙醇至洗脱液呈淡黄色为止，用量为柱体积的7倍，减压回收乙醇，80℃真空干燥至干浸膏，粉碎，得粗提取物；再用10倍量醋酸乙酯—乙醇共沸点溶剂加热回流提取2小时，共3次，合并提取液，减压回收溶剂，80℃真空干燥得精制黄蜀葵花提取物；取精制黄蜀葵花提取物加10倍量95％乙醇加热回流提取2小时，趁热过滤，滤液减压浓缩至1/3体积，室温放置24小时后，滤取结晶；用4倍量95％乙醇加热回流2小时，溶解结晶，趁热过滤，滤液于室温放置24小时后，滤取结晶；再用4倍量95％乙醇复结晶一次，滤取结晶，干燥得金丝桃苷。
4.如权利要求2所述的金丝桃苷原料药的制备方法，其特征在于其中所述热提2-3次，每次1-3小时也可以是冷提1次，48-88小时
5.如专利要求2所述的金丝桃苷原料药的制备方法，其特征在于其中所述的亲水性溶剂为脂肪族低级醇或低级酮。
6.如权利要求2所述的金丝桃苷原料药的制备方法，其特征在于其中所述用于柱层析洗脱的水—醇混合溶剂中的醇为脂肪族低级醇。
7.如权利要求1所述的金丝桃苷原料药在制备治疗乙型肝炎的药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述治疗乙型肝炎是指抑制血清DHBV-DNA水平。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述治疗乙型肝炎是指抑制血DHBV-DNAOD水平。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述治疗乙型肝炎是指抑制细胞的毒性和HBsAg和HBeAg的分泌。
全文摘要
本发明公开了一种金丝桃苷的制备方法及药物新用途。本发明制备方法为将干燥的黄蜀葵花粉碎成粗粉，用亲水性溶剂加热回流提取或冷浸渗滤提取，提取液浓缩至比重1.15－1.30(70℃)的浸膏，水溶，过滤，滤液上聚酰胺为载体的柱层析，收集水一醇洗脱液，浓缩，真空干燥后得粗提取物，再用醋酸乙酯一乙醇混合溶剂提取，提取液，浓缩，真空干燥后得精制黄蜀葵花提取物；用醇复结晶，滤取结晶，得金丝桃苷。本发明方法制备的金丝桃苷原料药纯度为90－98％。本发明还公开了金丝桃苷治疗乙型肝炎的药物新用途。
文档编号A61P31/00GK1493578SQ02146370
公开日2004年5月5日 申请日期2002年10月29日 优先权日2002年10月29日
发明者黄正明, 王先荣, 戴增先, 张福, 莫用元 申请人:中国人民解放军北京军医学院, 安徽省天科药物研究所, 中国中医药科技开发交流中心