专利名称：槲寄生碱的制法及其在制备治疗癌症药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗癌药物的制法及其应用，具体地说是以中草药为原料提取的生物碱及其在制备治疗癌症的药物方面的应用。
背景技术：
癌症是危害人类健康的大敌。我国每年新发癌症病例约有160万人，每年死于癌症的约有130万人。全国因癌症而死亡的人数逐年上升。我国为肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等癌症高发区，癌症死亡率居高不下。
目前尚无有效的药物治愈大多数癌症患者。化疗药物对癌症虽有一定疗效，但毒副作用大。中成药对癌症的疗效普遍较低，如参莲胶囊对肺胃癌的癌灶缓解率为3.5％，疗效还不理想。
槲寄生为桑寄生科槲寄生属植物。我国槲寄生属分布11种及1变种，药用部分为干燥带叶茎枝。槲寄生是一味传统中药，其性平，味苦，具有强筋骨、安胎、祛风湿、益血、补肝肾等功能。目前，已有文献报道欧洲槲寄生和朝鲜槲寄生的提取物具有抗肿瘤活性。国内报道采用稀醋酸浸提法或稀盐酸浸提法从槲寄生Viscum coloratum(Kom.)Nakai中提取的总生物碱在50，75mg/kg时对小鼠移植性肿瘤S180、S37、EAC、ARS及L1210白血病均有明显抑制作用((1)王庆端，刘梅筠，王东阳等，槲寄生总生物碱的抗肿瘤作用中国中药杂志，1994，19(1)45；(2)胡家会，张永忠，郭善利等，槲寄生总碱抗肿瘤及抗炎作用研究聊城师院学报，2001，14(2)64；(3)陈世伟，李俊峰，胡家会等，槲寄生碱的提取纯化及抗肿瘤研究山东中医药大学学报，2001，25(5)373)，在50，75mg/kg时对Lewis肺癌的抑瘤率为59.0％和65.2％，并对Lewis肺癌肺转移有抑制作用(1)。
发明内容
1、发明目的本发明的目的是提供一种高效低毒、抗癌谱广的抗癌药物，具体地说是以白果槲寄生、扁枝槲寄生、槲寄生为原料提取的生物碱及其在制备治疗肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌的药物方面的应用。
2、技术方案经资料查阅目前还没有文献报道槲寄生碱用于抗肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌等癌症的治疗。本发明从白果槲寄生Viscum album L.var.meridianum Danser、扁枝槲寄生Viscum articulatum Burm.f.、槲寄生Viscum coloratum(Kom.)Nakai中提取的生物碱(槲寄生碱)，提取的步骤为①将白果槲寄生，或扁枝槲寄生，或槲寄生的带叶茎枝，经自然风干后粉碎。②用粉碎后的槲寄生粗粉2-5kg加入70％-95％乙醇6～10倍回流提取3～5小时，减压回收提取液中的乙醇，浓缩至浸膏。③加入1％～2％盐酸700～1000ml，充分搅拌使生物碱溶解，静置，倾出上清液，抽滤，滤液置于1000ml分液漏斗，滴加浓氨水调至PH9，使生物碱游离。④加入氯仿150-300ml，振摇萃取，分取氯仿层，上层碱性水液再以氯仿萃取4～8次。⑤合并氯仿液，水洗，用无水硫酸钠干燥后回收氯仿，静置，析出结晶即为槲寄生碱。
本发明涉及抗癌药槲寄生碱在制备治疗肝癌的药物方面的应用。
实验方法是取接种7天后的肝癌H22腹水，用生理盐水稀释成13的悬液备用。将肝癌H22悬液以0.2ml/只的量接种于小鼠右前肢腋部皮下，24小时后将已接种的小鼠随机分为5组，每组10只，设对照组、5-FU组、槲寄生碱大小剂量组。槲寄生碱组，每天给小鼠灌胃给药1次；5-FU组为腹腔注射给药，每天1次，每次0.2ml/20g体重；对照组每天灌胃等量1％CMC-Na液。各组均连续给药7天。小鼠停药后1～3天拉颈处死，剥取瘤块称重，按“抑瘤率＝(1-T/C)×100％”公式计算抑瘤率。
实验结果表明当槲寄生碱的用量在60mg/kg-120mg/kg时，对小鼠肝癌细胞的抑瘤率达41.5％～68.9％。
本发明涉及抗癌药槲寄生碱在制备治疗胃癌的药物方面的应用。
实验方法是在无菌条件下，取荷瘤传代鼠，消毒腹部皮肤，用无菌空注射器抽吸腹水，以无菌生理盐水作1∶2倍的稀释，取雌性小鼠50只，每只鼠接种0.2ml，接种后次日随机分为5组，每组10只，按大小3个剂量灌胃给药，每日1次，连续10d，记录小鼠生存时间，计算生命延长率，实验重复3次。
实验结果表明当槲寄生碱的用量在60mg/kg～120mg/kg时，对小鼠胃癌细胞的抑瘤率达33.6％～71.9％本发明涉及抗癌药槲寄生碱在制备治疗乳腺癌的药物方面的应用。
实验方法是采用MTT法测定槲寄生碱对人乳腺癌细胞生长抑制作用。取对数生长期的乳腺癌细胞调整至1×105/ml，0.2ml接种于96孔板上，置37℃、5％CO2培养24h后弃原培养液，加入含不同浓度槲寄生碱培养液各0.2ml(设0.125mg/ml、0.0625mg/ml、0.03125mg/ml3个浓度)，每个浓度设9个复孔(分3次重复)，并设无药物(含配制药物的乙醇)培养液和空白对照孔(同时作3个板)。作用24h后倾去上清液，各孔加入MTT0.1ml，37℃4h后吸去上清液，加入DMSO0.1ml于各孔，30min后上酶标仪570nm处测OD值。抑制率(％)＝(对照孔OD值-实验组OD值)/对照孔OD值×100％。
实验结果表明随槲寄生碱浓度的升高，对乳腺癌细胞的抑制率也升高。在0.03125mg/ml以上剂量对乳腺癌细胞生长均有明显抑制作用。
本发明还涉及抗癌药槲寄生碱在制备治疗食管癌的药物方面的应用。
实验方法是采用MTT法测定槲寄生碱对食管癌细胞生长抑制作用。取对数生长期的食管癌细胞调整至1×105/ml，0.2ml接种于96孔板上，置37℃、5％CO2培养24h后弃原培养液，加入含不同浓度槲寄生碱培养液各0.2ml(设0.125mg/ml、0.0625mg/ml、0.03125mg/ml3个浓度)，每个浓度设9个复孔(分3次重复)，并设无药物(含配制药物的乙醇)培养液和空白对照孔(同时作3个板)。作用24h后倾去上清液，各孔加入MTT0.1ml，37℃4h后吸去上清液，加入DMSO0.1ml于各孔，30min后上酶标仪570nm处测OD值。抑制率(％)＝(对照孔OD值-实验组OD值)/对照孔OD值×100％。
实验结果表明，随槲寄生碱浓度的升高，对食管癌细胞的抑制率也升高，在0.03125mg/ml以上剂量对食管癌细胞生长均有明显抑制作用。
3、有益效果本发明药物的-个重要特点是抗癌活性高，抗癌谱广，毒性低。
本发明的药物经抗癌药理研究和动物试验的结果表明，有如下优点①癌活性高。用量在60mg/kg～120mg/kg时，对小鼠肝癌H22的抑瘤率达41.5％～68.9％，对小鼠移植胃癌的抑瘤率达33.6％～71.9％。
②抗癌谱广。对肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌均有明显的抑制作用。
③毒性低。在动物体内抗癌实验中，未发现其有明显的毒副反应。
④药物原料来源丰富，提取工艺简单。
具体实施例方式实施例1白果槲寄生的带叶茎枝，经自然风干后粉碎。粉碎后的槲寄生粗粉5kg用95％乙醇10倍回流提取5小时，减压回收提取液中的乙醇，浓缩至浸膏。加入2％盐酸1000ml，充分搅拌使生物碱溶解，静置，倾出上清液，抽滤，滤液置于1000ml分液漏斗，滴加浓氨水调至PH9，使生物碱游离。加入氯仿300ml，振摇萃取，分取氯仿层，上层碱性水液再以氯仿萃取8次。合并氯仿液，水洗，用无水硫酸钠干燥后回收氯仿，静置，析出结晶即为槲寄生碱。
实施例2白果槲寄生的带叶茎枝，经自然风干后粉碎。粉碎后的槲寄生粗粉2kg用70％乙醇6倍回流提取3小时，减压回收提取液中的乙醇，浓缩至浸膏。加入1％盐酸700ml，充分搅拌使生物碱溶解，静置，倾出上清液，抽滤，滤液置于1000ml分液漏斗，滴加浓氨水调至PH9，使生物碱游离。加入氯仿150ml，振摇萃取，分取氯仿层，上层碱性水液再以氯仿萃取4次。合并氯仿液，水洗，用无水硫酸钠干燥后回收氯仿，静置，析出结晶即为槲寄生碱。。
实施例3
以扁枝槲寄生的带叶茎枝为原料，提取方法和步骤与实施例1相同。
实施例4以槲寄生的带叶茎枝为原料，提取方法和步骤与实施例2相同。
实施例5槲寄生碱对小鼠肝癌H22的抑制作用。
1、实验材料瘤株肝癌H22，上海动物研究所提供。实验动物昆明种小鼠，雌雄各半，体重18g～22g，南京中医药大学实验动物中心提供。对照药5-氟尿嘧啶(5-FU)，批号010104，上海旭东海普药业有限公司出品。
2、实验方法取接种7天后的肝癌H22腹水，用生理盐水稀释成1∶3的悬液备用。将肝癌H22悬液以0.2ml/只的量接种于小鼠右前肢腋部皮下，24小时后将已接种的小鼠随机分为5组，每组10只，设对照组、5-FU组、槲寄生碱大小剂量组。槲寄生碱组，每天给小鼠灌胃给药1次；5-FU组为腹腔注射给药，每天1次，每次0.2ml/20g体重；对照组每天灌胃等量1％CMC-Na液。各组均连续给药7天。小鼠停药后1～3天拉颈处死，剥取瘤块称重，按“抑瘤率＝(1-T/C)×100％”公式计算抑瘤率。
3、实验结果见表1。
表1 槲寄生碱对小鼠肝癌H22瘤体生长的影响剂量动物数 动物体重(g) 瘤体重(g) 抑瘤率组别(mg/kg×(开始/结 (开始/结束) (X±SD) (％)d) 束)对照组 10/10 19.6/26.11.29±0.335-FU 20×7 10/9 19.9/21.70.38±0.29**70.54槲寄生碱 120×7 10/10 20.0/21.60.35±0.42**72.8790×7 10/10 20.4/26.80.49±0.31**62.0260×7 10/10 20.7/26.20.73±0.36**43.41对照组 10/10 19.5/26.91.30±0.415-FU 20×7 10/10 20.3/21.60.41±0.23**68.46槲寄生碱 120×7 10/9 20.0/26.80.34±0.36**73.8590×7 10/10 19.9/27.10.51±0.33**60.7760×7 10/10 20.1/26.50.76±0.33* 41.54注*P＜0.05，**P＜0.01与对照组比较实验中对照组用药为5-氟尿嘧啶，其毒副作用有骨髓抑制；胃肠道反应；神经系统损害；肝肾功能损害。
实施例6槲寄生碱对小鼠移植胃癌的抑制作用。
1、实验材料实验动物昆明种小鼠，雌雄各半，体重18g～22g，南京中医药大学实验动物中心提供。对照药环磷酰胺，由上海华联制药有限公司生产，批号010304。瘤株胃癌瘤株购自省肿瘤医院肿瘤研究所。
2、实验方法在无菌条件下，取荷瘤传代鼠，消毒腹部皮肤，用无菌空注射器抽吸腹水，以无菌生理盐水作1∶2倍的稀释，取雌性小鼠50只，每只鼠接种0.2ml，接种后次日随机分为5组，每组10只，按大小3个剂量灌胃给药，每日1次，连续10d，记录小鼠生存时间，计算生命延长率，实验重复3次。
3、实验结果见表2表2槲寄生碱对小鼠移植胃癌的抑制作用(X土S)组别 剂量 n 生存时间 生命延长率(mg/kg) (d) ％荷瘤对照组 1011.2±2.90环磷酰胺 501015.9±3.01**41.96槲寄生碱 120 1018.9±2.57**68.75901017.0±2.23**51.79601015.4±2.16* 37.50荷瘤对照组 1010.7±2.10环磷酰胺 501016.3±2.90**52.34槲寄生碱 120 1018.4±2.65**71.96901016.6±2.47**55.14601014.3±2.83* 33.64荷瘤对照组 1011.8±1.90环磷酰胺 501015.9±2.57* 34.75槲寄生碱 120 1018.3±2.80**55.08901016.7±2.07**41.52601014.8±2.28 25.42注*P＜0.05，**P＜0.01与对照组比较实验中对照组用药为环磷酰胺，其毒副作用有骨髓抑制；胃肠道反应；出血性膀胱炎；肝脏损伤。
实施例7槲寄生碱对人乳腺癌细胞的抑制作用。
1、实验材料瘤株人乳腺癌MCF-7细胞株购自省肿瘤医院肿瘤研究所。RPMI1640培养液(GIBCO公司产品)，内含10％小牛血清，L-谷氨酰胺2nM，青霉素100IU/ml和链霉素100ug/ml。人乳腺癌细胞培养于RPMI1640培养液中，培育在37℃、5％CO2培养箱内。化合物是从槲寄生中提取的生物碱。
2、实验方法采用MTT法测定槲寄生碱对乳腺癌细胞生长抑制作用。取对数生长期的乳腺癌细胞调整至1×105/ml，0.2ml接种于96孔板上，置37℃、5％CO2培养24h后弃原培养液，加入含不同浓度槲寄生碱培养液各0.2ml(设3个浓度)，每个浓度设9个复孔(分3次重复)，并设无药物(含配制药物的乙醇)培养液和空白对照孔(同时作3个板)。
作用24h后倾去上清液，各孔加入MTT0.1ml，37℃4h后吸去上清液，加入DMSO0.1ml于各孔，30min后上酶标仪570nm处测OD值。抑制率(％)＝(对照孔OD值-实验组OD值)/对照孔OD值×100％。
3、实验结果结果如表3显示，随槲寄生碱浓度的升高，对乳腺癌细胞的抑制率也升高。在0.03125mg/ml以上剂量对乳腺癌细胞生长均有明显抑制作用。
表3槲寄生碱对乳腺癌细胞生长抑制作用(n＝9)药物 浓度(mg/ml)OD值(A±S)抑制率(％)0 0.346±0.02100.0槲寄生碱 0.125 0.103±0.017**70.230.06250.152±0.015**56.070.03125 0.198±0.020*42.77注*P＜0.05，**P＜0.01与对照组比较实施例8槲寄生碱对食管癌细胞的抑制作用。
1、实验材料食管癌细胞株(Eca-109)由南京中医药大学微生物教研室提供。细胞培养于199培养液中，内加10％小牛血清，培育在37℃、5％CO2培养箱内。化合物是从槲寄生中提取的生物碱。
2、实验方法采用MTT法测定槲寄生碱对食管癌细胞生长抑制作用。取对数生长期的食管癌细胞调整至1×105/ml，0.2ml接种于96孔板上，置37℃、5％CO2培养24h后弃原培养液，加入含不同浓度槲寄生碱培养液各0.2ml(设3个浓度)，每个浓度设9个复孔(分3次重复)，并设无药物(含配制药物的乙醇)培养液和空白对照孔(同时作3个板)。
作用24h后倾去上清液，各孔加入MTT0.1ml，37℃4h后吸去上清液，加入DMSO0.1ml于各孔，30min后上酶标仪570nm处测OD值。抑制率(％)＝(对照孔OD值-实验组OD值)/对照孔OD值×100％。
3、实验结果结果如表4显示，随槲寄生碱浓度的升高，对食管癌细胞的抑制率也升高，在0.03125mg/ml以上剂量对食管癌细胞生长均有明显抑制作用。
表4槲寄生碱对食管癌细胞生长的抑制作用(n＝9)药物 浓度(mg/ml) OD值(A±S) 抑制率(％)0 0.349±0.016 0.0槲寄生碱 0.125 0.115±0.019**67.050.0625 0.187±0.012**46.420.031250.210±0.011*39.83注*P＜0.05，**P＜0.01与对照组比较
权利要求
1.一种抗癌药物槲寄生碱的制备方法，其特征是制备步骤为①将白果槲寄生或扁枝槲寄生或槲寄生的带叶茎枝，经自然风干后粉碎；②在粉碎后的槲寄生粗粉中加入乙醇回流提取减压回收提取液中的乙醇，浓缩至浸膏；③加入盐酸，充分搅拌使生物碱溶解，静置，倾出上清液，抽滤，将滤液置于分液漏斗中，滴加浓氨水，使生物碱游离；④加入氯仿振摇萃取，分取氯仿层，上层碱性水溶液再以氯仿萃取；⑤将氯仿液、水洗、用无水硫酸钠干燥回收氯仿，静置，析出的结晶即为槲寄生碱。
2.根据权利要求1所述的槲寄生碱的制备方法，其特征是在②中的槲寄生粗粉用量为2-5kg，乙醇浓度为70％-95％，用量是槲寄生粗粉的6-10倍，回流提取3-5小时。
3.根据权利要求1所述的槲寄生碱的制备方法，其特征是在③中盐酸的浓度为1％-2％，用量为700-1000ml，滴加浓氨水调至PH9。
4.根据权利要求1所述的槲寄生碱的制备方法，其特征是在④中加入氯仿150-300ml，萃取4-8次。
5.抗癌药槲寄生碱在制备治疗肝癌的药物方面的应用。
6.抗癌药槲寄生碱在制备治疗胃癌的药物方面的应用。
7.抗癌药槲寄生碱在制备治疗乳腺癌的药物方面的应用。
8.抗癌药槲寄生碱在制备治疗食管癌的药物方面的应用。
全文摘要
本发明提供了一种抗癌药物，它是以白果槲寄生或扁枝槲寄生或槲寄生为原料提取的生物碱(槲寄生碱)，提取方法步骤是将原料风干粉碎加入乙醇回流提取，减压回收提取液中的乙醇，浓缩至浸膏，再加入盐酸并搅拌使生物碱溶解、静置、浸出上清液、抽滤，再滴加浓氨水使生物碱游离，加入氯仿萃取，将氯仿液水洗，用无水硫酸钠干燥后回收氯仿，静置，析出的结晶即为槲寄生碱。该药物对肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌有显著的抑制作用，具有抗癌活性高、抗癌谱广、毒性低等优点。
文档编号A61K31/7048GK1417208SQ0214840
公开日2003年5月14日 申请日期2002年12月2日 优先权日2002年12月2日
发明者章永红, 彭海燕 申请人:南京中医药大学