专利名称：特定融合疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗的制备方法。
背景技术：
疫苗是一个古老的名词，传统疫苗的概念局限于对体外病原体(如细菌，病毒等)的预防，免于受其感染。由于近年来对肿瘤免疫的突破性进展，治疗性癌症疫苗给癌症患者带来了新的希望。从此，疫苗从它的传统概念中解放出来，不仅用于被动的预防，而且用于主动的治疗了。随着疫苗概念的进展，疫苗的物质基础也随之发生了改变预防性疫苗由原来用灭活病原体作疫苗，发展到合成多肽作疫苗和合成核酸(DNA和RNA)作疫苗。其原理是合成的多肽抗原和核酸抗原直接或间接地刺激机体免疫细胞产生免疫预防作用。无论上述合成性多肽疫苗还是核酸疫苗，大都是针对病原体某一两个蛋白质的已知抗原为目标设计的，虽然较传统的用整个病原体作疫苗来得安全，无毒性和致感染性，所面临的问题是抗原表达率低；效价低。
治疗性疫苗目前最大的突破是将上述的多肽或和核酸抗原在体外和机体树状细胞(dendritic cell)先作用，使树状细胞变成所谓抗原携带细胞(antigen presenting cell)，进而刺激机体免疫细胞产生免疫治疗作用。目前已用于癌症和病毒的治疗。但有待进一步突破。即是否能用特定融合疫苗的形式，结合抗原携带细胞为媒介，刺激机体细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte)产生更有效的免疫治疗作用呢？
发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫效果好的特定融合疫苗的制备方法。
本发明的技术解决方案是一种特定融合疫苗的制备方法，依次包括下列步骤①用PCR方法合成靶基因或靶抗原；②将抗原在基因内和/或基因间易位重组；
③克隆到表达载体，表达融合抗原；④筛选高效融合抗原克隆；⑤制取特定融合疫苗。
步骤②的具体方法是采用限制性内切酶，将消化的片段再连接，完成重组。
上述将抗原在基因内和/或基因间易位重组主要包括1)抗原随意易位重组方法由于靶基因是已知的，可根据重组的要求，按常规方法选用限制性内切酶，将消化的片断再连接，完成重组；2)形式(a)抗原在基因内随意易位重组(如下图所示，+表示抗原决定基，A、B、C、D代表4个不同的抗原决定基)A B基因甲5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′B A抗原易位 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′C D基因乙5′000+00000000+000 3′DC抗原易位 5′000+00000000+000 3′如基因具有两个以上抗原可以类推。(b)抗原在基因内和基因间随意易位重组各易位重组模式如下图所示(如下示意图是是以上两个基因四个抗原为例排列的，如为两个基因和四个抗原以上者，可以类推)A B CD1 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′A B DC2 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′
B A CD3 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′B A DC4 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′CD A B5 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′CD B A6 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′DC A B7 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′DC B A8 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′A B C9 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′A B D10 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′B A C11 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′B A D12 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′C D A13 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝3′C D B14 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝3′DC A15 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝3′
DC B16 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝3′CA B17 5′000+0000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′CB A18 5′000+0000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′DA B19 5′000+0000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′DB A20 5′000+0000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′A CD21 5′＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′A DC22 5′＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′B CD23 5′＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′B DC24 5′＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′A C B D25 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′A D B C26 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′B C A D27 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′B D A C28 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′C A DB29 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000＝＝+＝＝＝＝3′
C B DA30 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000＝＝+＝＝＝＝3′D A CB31 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000＝＝+＝＝＝＝3′D B CA32 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000＝＝+＝＝＝＝3′A C B33 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′A D B34 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′B C A35 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′B D A36 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′C A D37 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′C B D38 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′D A C39 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′D B C40 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′A D41 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000 3′B C42 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000 3′C A43 5′ 000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′
D B44 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′以上A；B；C和D各抗原位点可以重复，如BBAAACCDD等。各易位重组体也可重复，如DAC-DAR-DB-DB-DB等。各易位重组体也可再重组，如ABCD-DCBA等等。任何重组都要确保能表达正确的蛋白质，即蛋白质阅读框需正确无误。
基因与基因之间的融合可以为同种之间，如人体肝脏甲胎蛋白和人体其它肿瘤表达的胚胎抗原的基因易位重组，表达融合蛋白作疫苗等等。也可以在异种之间基因之间进行。如人体基因和植物基因，人体基因和微生物的基因，植物基因和微生物的基因之间的抗原基因易位重组，表达融合蛋白制作疫苗等等。
步骤③的方法是基因易位重组后，将其克隆到哺乳动物细胞表达载体，表达融合抗原。
步骤④筛选高效融合抗原克隆的具体方法是步骤③的克隆纯化质粒后，直接免疫动物，测试抗体效价，筛选出具有较强抗原性的克隆。
步骤⑤制取特定融合疫苗的方法是经步骤④筛选出的哺乳动物细胞表达质粒，即直接作为特定DNA融合疫苗。
将步骤④筛选出的哺乳动物细胞表达质粒DNA作模板进行PCR扩增，扩增时5’端质粒引物内含RNA启动子T7或T3、SP6序列，3’端质粒引物内含POLY(T)序列；再将PCR产物用相应的RNA聚合酶把全部的克隆转化为有义链RNA，外加脱氧核糖核酸酶I消化DNA模板即得特定RNA融合疫苗。
将步骤④筛选出的纯化质粒DNA表达为蛋白质，并加以纯化即得特定蛋白融合疫苗。
步骤①用PCR方法合成靶基因或靶抗原，可以采用下列方法中的一种1)对属DNA基因组的生物体(例如细菌、DNA病毒等)，抽取纯化的DNA分子作模板，用PCR扩增分离出靶基因、抗原；2)对属RNA基因组的生物体(例如RNA病毒等)，先抽取并纯化双链RNA分子，再将双链的RNA分子逆转录为DNA分子，并以此作为PCR模板，用PCR扩增法分离出靶基因或抗原，整个过程称之为RT-PCR，其中将RNA逆转录为DNA分子的具体步骤包括a)将双链RNA分子和随机引物按分子比1∶50或1∶100或1∶500或1∶1000或1∶10000的比例进行混合。随机引物序列5′-----------------------XXXX-3′5′-----------------------XXXXX-3′5′-----------------------XXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXXXXX-3′“X”为随机碱基A或T或G或C。
“-----”为随意DNA序列，其中可含有内切酶位点。引物的的熔点(Tm)为50-80℃。
b)将双链RNA分子和随机引物的混合液加热变性(温度85-98℃；30秒-30分钟)。
c)迅速置于4℃到-4℃，退火3分钟左右。
d)加逆转录酶、相应缓冲液和dNTP完成第一链的的合成。
e)用PCR完成第二链的合成。所用引物与第一链合成相同。
也可用传统的第二链合成方法合成。如由大肠杆菌DNA多聚酶加大肠杆菌RNA连接酶和核糖核酸酶H(RNase H)共同完成。在此情形下，上述随机引物的随意DNA序列可以去除。随机引物序列如下所示5′-XXXX-3′
5′-XXXXX-3′5′-XXXXXX-3′5′-XXXXXXX-3′5′-XXXXXXXX-3′5′-XXXXXXXXX-3′5′-XXXXXXXXXX-3′5′-XXXXXXXXXXX-3′5′-XXXXXXXXXXXX-3′“X”为随机碱基A或T或G或C。3)如生物体是具有POLY(A)RNA的寄生虫或哺乳动物、人体等，总体RNA的抽提可用中国专利申请号01113523.9的抽提液抽提(或用现有技术的其它方法抽提)，由总体RNA合成cDNA的方法可按中国专利申请号01113524.7的相应方法进行(或用现有技术的其它方法进行)，以此合成的cDNA为模板，用PCR扩增法分离出靶基因或抗原；如是为制备癌症特定融合疫苗，且基因属于稀含基因，则在上述用PCR扩增前需要加一步肿瘤相关基因的扣除性筛选步骤，去除和正常细胞相同的基因，筛选出肿瘤基因，以防疫苗产生自身免疫反应，此扣除性筛选步骤可按公开号为US6,465,219的美国专利和申请号为PCT/US01/24730的相应方法进行。
本发明方法新颖、独特，制取的疫苗免疫效果好，能对外来的病原体入侵和自身突变细胞的繁殖和扩散进行免疫预防，还能结合抗原携带细胞(APC)为媒介，刺激机体的细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte)对外来的病原体和自身突变细胞产生有效的免疫治疗作用。
具体实施例方式实施例1一种特定融合疫苗的制备方法，依次包括下列步骤①用PCR方法合成靶基因或靶抗原对属DNA基因组的生物体(例如细菌、DN病毒等)，抽取纯化的DNA分子作模板，用PCR扩增分离出靶基因、抗原；②将抗原在基因内和/或基因间易位重组采用限制性内切酶，将消化的片段再连接，完成重组。
上述将抗原在基因内和/或基因间易位重组主要包括1)抗原随意易位重组方法由于靶基因是已知的，可根据重组的要求，按常规方法选用限制性内切酶，将消化的片断再连接，完成重组；2)形式(a)抗原在基因内随意易位重组(如下图所示，+表示抗原决定基，A、B、C、D代表4个不同的抗原决定基)A B基因甲5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′B A抗原易位 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′CD基因乙5′000+00000000+000 3′DC抗原易位 5′000+00000000+000 3′如基因具有两个以上抗原可以类推。(b)抗原在基因内和基因间随意易位重组各易位重组模式如下图所示(如下示意图是是以上两个基因四个抗原为例排列的，如为两个基因和四个抗原以上者，可以类推)A B CD1 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′A B DC2 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′B A CD3 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′
B A DC4 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′CD A B5 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′CD B A6 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′DC A B7 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′DC B A8 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′A B C9 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′A B D10 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′B A C11 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′B A D12 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′CD A13 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝3′CD B14 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝3′DC A15 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝3′DC B16 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝3′CA B17 5′000+0000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′
CB A18 5′000+0000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′DA B19 5′000+0000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′DB A20 5′000+0000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′A CD21 5′＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′A DC22 5′＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′B CD23 5′＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′B DC24 5′＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′A C B D25 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′A D B C26 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′B C A D27 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′B D A C28 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′C A DB29 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000＝＝+＝＝＝＝3′C B DA30 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000＝＝+＝＝＝＝3′D A CB31 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000＝＝+＝＝＝＝3′
D B CA32 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000＝＝+＝＝＝＝3′A C B33 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′A D B34 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′B C A35 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′B D A36 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′C A D37 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′C B D38 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′D A C39 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′D B C40 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′A D41 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000 3′B C42 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000 3′C A43 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′D B44 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′以上A；B；C和D各抗原位点可以重复，如BBAAACCDD等。各易位重组体也可重复，如DAC-DAR-DB-DB-DB等。各易位重组体也可再重组，如ABCD-DCBA等等。任何重组都要确保能表达正确的蛋白质，即蛋白质阅读框需正确无误。
基因与基因之间的融合可以为同种之间，如人体肝脏甲胎蛋白和人体其它肿瘤表达的胚胎抗原的基因易位重组，表达融合蛋白作疫苗等等。也可以在异种之间基因之间进行。如人体基因和植物基因，人体基因和微生物的基因，植物基因和微生物的基因之间的抗原基因易位重组，表达融合蛋白制作疫苗等等。
③克隆到表达载体，表达融合抗原基因易位重组后，将其克隆到哺乳动物细胞表达载体，表达融合抗原。
④筛选高效融合抗原克隆的具体方法是步骤③的克隆纯化质粒后，直接免疫动物，测试抗体效价，筛选出具有较强抗原性的克隆。
⑤制取特定融合疫苗经下列方法之一，制取特定DNA融合疫苗或特定RNA融合疫苗、特定蛋白融合疫苗1)经步骤③筛选出的哺乳动物细胞表达质粒，即直接作为特定DNA融合疫苗。
2)将步骤③筛选出的哺乳动物细胞表达质粒DNA作模板进行PCR扩增，扩增时5’端质粒引物内含RNA启动子T7或T3、SP6序列，3’端质粒引物内含P0LY(T)序列；再将PCR产物用相应的RNA聚合酶把全部的克隆转化为有义链RNA，外加脱氧核糖核酸酶I消化DNA模板即得特定RNA融合疫苗。
3)将步骤③筛选出的纯化质粒DNA表达为蛋白质，并加以纯化即得特定蛋白融合疫苗。
实施例2用PCR方法合成靶基因或靶抗原对属RNA基因组的生物体(例如RNA病毒等)，先抽取并纯化双链RNA分子，再将双链的RNA分子逆转录为DNA分子，并以此作为PCR模板，用PCR扩增法分离出靶基因或抗原，整个过程称之为RT-PCR，其中将RNA逆转录为DNA分子的具体步骤包括a)将双链RNA分子和随机引物按分子比1∶50(或1∶100或1∶500或1∶1000或1∶10000)的比例进行混合。随机引物序列5′-----------------------XXXX-3′5′-----------------------XXXXX-3′5′-----------------------XXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXXXXX-3′“X”为随机碱基A或T或G或C。
“-----”为随意DNA序列，其中可含有内切酶位点。引物的的熔点(Tm)为50-80℃(例50、60、70、80℃)。
b)将双链RNA分子和随机引物的混合液加热变性，温度；85-98℃(例85、90、93、98C)，时间30秒-30分钟(例30秒、1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟)。
c)迅速置于4℃到-4℃(例4、2、0、-2、-4℃)，退火2～4分钟(可以是2、3、4分钟)。
d)加逆转录酶、相应缓冲液和dNTP完成第一链的的合成。
e)用PCR完成第二链的合成。所用引物与第一链合成相同。
也可用传统的第二链合成方法合成。如由大肠杆菌DNA多聚酶加大肠杆菌RNA连接酶和核糖核酸酶H(RNase H)共同完成。在此情形下，上述随机引物的随意DNA序列可以去除。随机引物序列如下所示5′-XXXX-3′5′-XXXXX-3′5′-XXXXXX-3′5′-XXXXXXX-3′5′-XXXXXXXX-3′
5′-XXXXXXXXX-3′5′-XXXXXXXXXX-3′5′-XXXXXXXXXXX-3′5′-XXXXXXXXXXXX-3′“X”为随机碱基A或T或G或C。其余步骤均同实施例1。
权利要求
1.一种特定融合疫苗的制备方法，其特征是依次包括下列步骤①用PCR方法合成靶基因或靶抗原；②将抗原在基因内和/或基因间易位重组；③克隆到表达载体，表达融合抗原；④筛选高效融合抗原克隆；⑤制取特定融合疫苗。
2.根据权利要求1所述的特定融合疫苗的制备方法，其特征是步骤②的具体方法是采用限制性内切酶，将消化的片段再连接，完成重组。
3.根据权利要求1或2所述的特定融合疫苗的制备方法，其特征是步骤③的方法是基因易位重组后，将其克隆到哺乳动物细胞表达载体，表达融合抗原。
4.根据权利要求1或2所述的特定融合疫苗的制备方法，其特征是步骤④筛选高效融合抗原克隆的具体方法是；步骤③的克隆纯化质粒后，直接免疫动物，测试抗体效价，筛选出具有较强抗原性的克隆。
5.根据权利要求1或2所述的特定融合疫苗的制备方法，其特征是步骤⑤制取特定融合疫苗的方法是经步骤④筛选出的哺乳动物细胞表达质粒，即直接作为特定DNA融合疫苗。
6.据权利要求1或2所述的特定融合疫苗的制备方法，其特征是步骤⑤制取特定融合疫苗的方法是将步骤④筛选出的哺乳动物细胞表达质粒DNA作模板进行PCR扩增，扩增时5’端质粒引物内含RNA启动子T7或T3、SP6序列，3’端质粒引物内含POLY(T)序列；再将PCR产物用相应的RNA聚合酶把全部的克隆转化为有义链RNA，外加脱氧核糖核酸酶I消化DNA模板即得特定RNA融合疫苗。
7.据权利要求1或2所述的特定融合疫苗的制备方法，其特征是步骤⑤制取特定融合疫苗的方法是将步骤④筛选出的纯化质粒DNA表达为蛋白质，并加以纯化即得特定蛋白融合疫苗。
全文摘要
本发明公开了一种特定融合疫苗的制备方法，依次包括①用PCR方法合成靶基因或靶抗原；②将抗原在基因内和/或基因间易位重组；③克隆到表达载体，表达融合抗原；④筛选高效融合抗原克隆；⑤制取特定融合疫苗。本发明方法新颖、独特，制取的疫苗免疫效果好，能对外来的病原体入侵和自身突变细胞的繁殖和扩散进行免疫预防，还能结合抗原携带细胞为媒介，刺激机体的细胞毒T淋巴细胞对外来的病原体和自身突变细胞产生有效的免疫治疗作用。
文档编号A61K45/00GK1416898SQ0214843
公开日2003年5月14日 申请日期2002年12月2日 优先权日2002年12月2日
发明者朱远源 申请人:朱远源