专利名称：海兔(Aplysia punctata)的细胞毒性cyplasin、其cDNA克隆及生物反应性重组体的表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码称为“cyplasin”的蛋白质的一种核酸，cyplasin示出对自主生长的哺乳动物细胞具有优先毒性。由这种蛋白质诱导的细胞死亡与凋亡和坏死均不同。当在细胞培养物中重组制备cyplasin时发生的胞内细胞死亡可以通过除去cyplasin序列中的分泌信号而避免。这种修饰使得可以在哺乳动物细胞培养基中表达cyplasin，其优选是所获得蛋白的糖基化模式。因此，本发明还涉及一种在真核细胞，优选在哺乳动物细胞中，重组产生一种蛋白质的方法，所述蛋白质当外部应用时对所述细胞具有细胞毒性。
海洋生物是一类基本未开发的潜在生物学和/或药物学的令人感兴趣的基因和代谢产物的原料库(1，2，3)。迄今为止，关于衍生自海洋生物的天然产物的文献主要涉及细胞毒性的低分子量化合物。许多这种天然药物被临床应用或者作为潜在的抗癌药物被评估(1，2，3)。相反，关于海洋生物的可开发的基因及其产物的报道很罕见。来自水母Aequorea Victoria的绿色荧光蛋白例如是基础生物学令人感兴趣的基因，其作为报道基因广泛用于生物工程学中以在活细胞中研究基因表达和蛋白质定位(4)。
海兔(Sea hare)看起来代表了另一个产生令人感兴趣的高分子量基因产物的物种。最初软体动物Aplysia的毒性是由于衍生自藻类食物的低分子量代谢物而发现的(5)。然而，在海兔Aplysia kurodai，Aplysia juliana和Dolabella auricularia的高分子量生物化学分离物中可以检测到细胞溶解的、抗微生物及抗真菌的活性。由此提示这些生物体也许产生药理学上令人感兴趣的水溶性基因表达的生物聚合物(5，6)。另外，这些生物化学研究提示海兔产生许多密切相关的不同大小及不同生物活性的糖蛋白。首先尝试在序列水平定性这些蛋白质导致一个Aplysia kurodai衍生的cDNA的分子克隆，其示出与编码由大非洲蜗牛Achatina fulica产生的蛋白质的cDNA具有显著序列相同性(7)。然而，未获得克隆的Aplysia kurodai cDNA编码的蛋白质与任何生物学活性之间的明确关联。这最可能是由于所述生物活性分子是糖蛋白而且在大肠杆菌中的重组表达产生生物活性丧失的蛋白质。
因此，本发明的潜在技术难题是提供重组产生生物活性形式的细胞毒性蛋白质如来自Aplysia的cyplasin的方法。
所述技术难题的解决通过提供具有权利要求书所述特征的实施方案而实现。
Aplysia衍生的蛋白质的潜在药理学价值促使本发明人在序列水平鉴别欧洲海兔Aplysia punctata的细胞毒性活性。生物活性测定引导的分级分离得到蛋白腺分泌的粘液所释放的一种56kDa的糖蛋白，其在纳摩尔浓度对自主生长的细胞表现出细胞毒性作用。基于其细胞毒性，对瘤形成的可能作用以及其源自Aplysia，将该蛋白质命名为cyplasin。Cyplasin示出对自主生长转化的哺乳动物细胞优先的毒性。由这个蛋白质诱导的细胞死亡与凋亡和坏死均不同。该细胞毒性作用是不可逆的而且以细胞类型依赖性方式在纳摩尔浓度即显而易见。相反，以微摩尔浓度注射入小鼠是耐受的，无明显阴性结果。对该56kDa的蛋白质的微量测序释放一个肽序列，其相应的核苷酸序列用作探针以筛选基于Aplysia punctata RNA的cDNA，并选择编码包含靶肽的多肽的cDNA克隆。检测两个密切相关的cDNA。编码长度为558aa的多肽的cDNA认为是反映编码所述细胞毒性蛋白质的真正的克隆。将其蛋白质编码节段再克隆到分别适于在大肠杆菌、哺乳动物细胞及昆虫细胞中表达的载体中。大肠杆菌表达的多肽是生物学失活的。转染的哺乳动物细胞表达一个细胞毒性因子而导致其死亡，正如用所述真的细胞毒性蛋白质处理一样。相反，被证明对用真蛋白质的处理敏感性低得多的转染的昆虫细胞表达细胞毒性因子并持续增殖，使得可以建立表达足够量的细胞毒性因子的稳定昆虫细胞系以进一步定性。最后，可以看出当使用编码无分泌信号序列的蛋白质的DNA序列时，可以在哺乳动物细胞中重组产生生物活性蛋白质。
图1通过生物活性测定引导的分级分离而从A.punctata的分泌粘液分离的cyplasin的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
该图示出加载有最强活性组分的12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(cyplasin泳道)。蛋白质样物质迁移具有的表观分子量为56kDa。泳道M加样标志蛋白。
图2(a)衍生自包含编码(未记录的)内部肽SGDYILIASYAD的核苷酸亚序列的A.punctata cDNA的前体蛋白的氨基酸序列上方的序列(558aa残基)衍生自编码称为cyplasin-L的多肽的cDNA的核苷酸序列，下方序列(421aa残基)衍生自编码称为cyplasin-S的多肽的cDNA的核苷酸序列。所述核苷酸序列在数据库中发现，登记号为AJ304802(cyplasin-L cDNA)和AJ304801(cyplasin-S cDNA)。除了这些明显可区分的转录物，还可能存在具有额外差异的其它mRNA。使用总cDNA作为模板及cyplasin-L特异性引物对进行PCR，产生与克隆的cyplasin-L及cyplasin-S编码cDNA序列略不同的一些序列。通过PCR程序检测的氨基酸置换在括号中表示。Asn-连接的糖基化位点在N-151、N-271、N-401、N-416和N-422位发现。推定分泌信号序列的切割点在aa 52(S)和aa 53(A)之间。
(b)蛋白质Cypl-Mut-Sig.Seq)的核苷酸序列。
图3用表达cyplasin-L-EGFP的pIZ载体驱动的构建体转染的昆虫细胞(Sf9)上图示出在明场中的Sf9细胞，下图示出在荧光模式(515nm)下的相同部分，标尺10μm。
图4在从SF9细胞中释放的细胞毒性蛋白质级分中重组cyplasin-L-EGFP融合蛋白的富集(enrichment)如材料与方法章节所述，从表达cyplasin-L-EGFP的SF9细胞中制备含有细胞毒性因子的提取物。在12％聚丙烯酰胺凝胶上分离相同的样品。在平行凝胶组上跑胶的多肽与一种蛋白质大小标记一起通过银染色程序或者印迹于一PVDF膜上而观测。所述膜用抗EGFP抗体探查，应用碱性磷酸酶偶联的二级抗体观测形成的免疫复合物。(a)示出蛋白质大小标记，(b)示出在提取物中存在的显著多肽，(c)示出通过EGFP特异性抗体检测的抗原。应注意抗EGFP抗体检测到一个70kDa的多肽，其显著大于EGFP(27kDa)。这个结果表明在细胞毒性级分中富集EGFP标记的融合蛋白。经计算cyplasin-L前体蛋白(57.2kDa)和EGFP之间的融合蛋白的分子量为84.2kDa。缺失信号序列的加工cyplasin-L计算分子量为41.6kDa，当与EGFP融合时分子量为68.6kDa，这与在印迹上检测的融合蛋白大小很相近。因此，推测所述细胞毒性提取物含有EGFP标记的及经加工的cyplasin-L。
图5天然(genuine)的cyplasin-L-EGFP及重组cyplasin-L-EGFP的细胞毒性作用将四种不同的细胞系用天然(genuine)的cyplasin及来自稳定表达cyplasin-L-EGFP的SF9细胞中的标准提取物(实施例1)处理4小时。天然的cyplasin人原代皮肤成纤维细胞(HSF)与50nM cyplasin温育。在此浓度HSF细胞示出微弱但典型的反应，提示细胞膜退缩与部分脱附。在此浓度未观测到细胞死亡，细胞恢复并持续增殖。取自活组织检查的人原代黑素瘤细胞与HSF细胞相比对cyplasin的细胞毒性作用更敏感。在加入cyplasin(2nM)之后，细胞示出典型的cyplasin诱导的膜改变并最终死亡。源自大鼠胚胎脑皮质的永久细胞系的神经胶质细胞当用cyplasin处理时最敏感。加入0.5nM cyplasin足以诱导细胞死亡。袋鼠(rat kangaroo)PtK细胞需要2nM cyplasin才表现死亡细胞形态学。重组cyplasin-L-EFGP在平行培养中，重组cyplasin-L-EFGP的标准提取物(100μl/500μl培养基)的标准提取物示出基本相同的和梯度的细胞毒性作用。标尺10μM。
图6各种细胞系的cyplasin剂量应答曲线神经胶质细胞是对cyplasin最敏感的细胞。小于1nM的cyplasin足以将其大部分杀死。人原代黑素瘤细胞及PtK细胞也示出对cyplasin高度敏感，而HSF则更耐受，只有当cyplasin剂量高达100nm时才杀死这些细胞。
图7由星形孢菌素诱导的凋亡及由天然的cyplasin诱导的细胞死亡将PtK细胞用10nM cyplasin处理5小时(上图)，或者用1μg/ml星形孢菌素处理3小时(下图)。将细胞用FITC标记的AnnexinV与碘化丙啶的混合物染色(8)。FITC-AnnexinV染色示出磷脂酰丝氨酸从质膜内至质膜外的特征性易位。在cyplasin处理的细胞中未发现FITC-AnnexinV染色，其示出特征性cyplasin诱导的形态学改变。星形孢菌素和cyplasin均不可使细胞通透，这一点通过核没有被碘化丙啶染色而证实，标尺10μM。
图8在用2nM天然的cyplasin处理1小时的培养物中存在的PtK细胞的分裂后期进展从左上到右下未观测到对分裂后期过程的干扰，分裂后期以一种表观正常的胞质分裂而终止。在进入分裂间期后，这个细胞示出典型的cyplasin诱导的形态学改变。标尺10μm。
图9cyplasin对人原代黑素瘤细胞肌动蛋白细胞骨架的作用Cyplasin(10nM)导致肌动蛋白纤维快速解聚，例外的是皮质区中1-肌动蛋白持续染色(箭头所指处)。(a)未处理的对照组；(b)30分钟cyplasin温育；(c)60分钟cyplasin温育；(d)90分钟cyplasin温育；(e)120分钟cyplasin温育；(f)150分钟cyplasin温育。标尺10μm。
图10在cyplasin的N末端氨基酸序列中信号肽及其剪切位点的预测剪切的最高概率是在氨基酸位置19和20之间或者(较低概率)在氨基酸位置52和53之间。
图11除去了分泌前导序列的cyplasin的氨基酸序列在用编码这种蛋白质的cyplasin变体(仍具有细胞毒性)的cDNA转染的人体细胞中，所述变体存在于该细胞的胞质中。
图12用修饰的cyplasin cDNA转染的HeLa细胞的显微照相下图明场；上图在荧光模式中的相同区域。所有细胞均含有EGFP及作为结果的，cyplasin。
因此，本发明涉及一种分离的核酸分子，其编码缺失或无功能性分泌信号序列的蛋白质cyplasin或者表现其生物学活性的蛋白质，所述核酸选自如下组中(a)编码包含图2(a)氨基酸位置20或53至558的氨基酸序列的蛋白质的核酸分子；(b)包含图2(b)的核苷酸序列的核酸分子；(c)一种核酸分子，其核酸序列由于遗传密码的简并衍生自(a)或(b)中所述序列；(d)一种核酸分子，其代表(a)，(b)或(c)中所述核酸序列的片段、衍生物或等位基因变体。
正如本文所使用的，表现cyplasin的生物学性质的蛋白质是指一种蛋白质，其具有cyplasin的至少一种生物学活性，例如细胞毒性。
正如本文所使用的，术语“分离的核酸分子”包括本质上没有前体的核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物或其天然相关的其它材料的核酸分子。例如，分离的核酸分子可以是载体或者组合物的一部分，或者可以包含在细胞内，但仍然是“分离的”，因为载体、组合物或者特定的细胞不是所述核酸分子的初始环境。
本发明的核酸分子可以是DNA和RNA分子。合适的DNA分子例如是基因组或cDNA分子。应理解所述分子还包括编码全部或部分cyplasin的所有核酸分子，只要它们编码具有生物学活性的蛋白质即可。本发明的核酸分子可以从天然原料中分离或者可以根据已知方法合成。
本发明的核酸分子还包括具有由于遗传密码简并的序列的分子。
在进一步的实施方案中，本发明提供了核酸分子，其包含上述编码本发明蛋白质的核酸分子的片段、衍生物和等位基因变体。“片段”是指所述编码所述蛋白质之一的足够长的一部分核酸分子。这些片段包含与本发明核酸分子的转录物特异性杂交的核酸分子。这些核酸分子可以例如用作诊断分析和/或试剂盒中的探针或引物，优选是长度为至少15个、更优选至少50个核苷酸的寡核苷酸。本发明的核酸分子和寡核苷酸也可以用作例如PCR反应的引物。
文中术语“衍生物”是指这些分子的序列与上述核酸分子的序列在一或几个位置不同，但与这些序列具有高水平相同性。在此相同性是指至少40％、特别是60％、优选80％或85％以上及特别优选90％、92％、95％或98％以上的序列相同性。由所述核酸分子编码的这些蛋白质与图2所示权利要求的氨基酸序列的相同性为至少60％或70％，优选80％或85％，特别优选90％、95％、97％和99％以上。上述核酸分子的衍生物可以通过缺失、代换、插入或重组而产生。
与上述分子同源的或者代表这些分子的衍生物的核酸分子通常是这些分子的变体，其代表具有相同生物学功能的修饰。它们可以天然发生变化，例如来自其它生物体的序列，或者可以是天然发生的或通过特异性诱变而导入的突变。而且，所述变体可以是合成产生的序列。等位基因变体可以是天然发生的变体或者合成产生的变体或者通过重组DNA方法产生的变体。
一般地，通过常规分子生物学方法(例如Sambrook等，1989，分子克隆实验指南，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY)可以在本发明的核酸分子中导入不同的突变。
为通过遗传工程操作原核细胞，本发明的核酸分子或这些分子的一部分可以导入质粒中，使得可以通过重组DNA序列而诱变或修饰所述序列。通过常规方法(例如Sambrook等，1989，分子克隆实验指南，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY，美国)，可以置换碱基及可以加入天然或合成的序列。为将所述DNA片段彼此连接，可在片段中加入连接物或接头。此外，可以进行操作以提供合适的剪切位点或者除去多余的DNA或剪切位点，优选除去分泌信号。如果可以插入、缺失或代换，则可以进行体外诱变、引物修复、限制或连接。通常使用的分析方法是序列分析、限制分析及其它生物化学或分子生物学方法。
由本发明核酸分子的各种变体编码的蛋白质示出一些共有特性，如酶活性、分子量、免疫反应性或者构象或物理性质如电泳迁移性、层析行为、沉降系数、溶解性、光谱学性质、稳定性；最佳pH、最佳温度。
而且本发明涉及包含本发明核酸分子的载体。优选它们是质粒、粘粒、病毒、噬菌体及遗传工程领域通常使用的其它载体。适用于本发明的载体包括但非限于针对在细菌中表达的基于T7的表达载体，针对在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体及针对在昆虫细胞中表达的杆状病毒衍生载体。优选本发明的核酸分子在本发明的重组载体中可操纵地与调节元件连接，这样保证RNA在可翻译的原核和/或真核细胞中转录及合成。转录的核苷酸序列可以可操纵地与一个启动子连接，如T7、金属硫蛋白I或多角体蛋白启动子。
在进一步的实施方案中，本发明涉及瞬时或稳定含有本发明的核酸分子或载体的重组宿主细胞。宿主细胞是指一种生物体，其能吸收体外重组DNA，而且如果是这种情况则可以合成本发明的核酸分子编码的蛋白质。优选地，这些细胞是原核细胞或真核细胞，例如哺乳动物细胞、细菌细胞、昆虫细胞或酵母细胞。本发明的宿主细胞优选特征在于导入的本发明的核酸分子与转化的细胞是异源的，即在这些细胞中不是天然发生的，或者位于与相应天然发生的序列不同的基因组位置。
本发明进一步的实施方案涉及表现cyplasin生物学性质的由本发明核酸分子编码的分离的蛋白质及其产生方法，优选其中正常发生的分泌序列已经除去或者是无功能的cyplasin。从而例如将本发明的宿主细胞在允许所述蛋白质合成的条件下培养，随后将所述蛋白质从培养的细胞和/或培养基中分离。重组产生的蛋白质的分离和纯化可以通过常规方法进行，包括制备层析及包括用单克隆或多克隆抗体亲和层析的亲和性与免疫性分离。正如本文所使用的，术语“分离的蛋白质”包括基本没有其它蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物或其天然相关的其它材料的蛋白质。然而这种蛋白质不仅包含重组产生的蛋白质，而且还包含分离的天然发生的蛋白质、合成产生的蛋白质、或者通过这些方法组合产生的蛋白质。本领域熟知制备这种蛋白质的方法。本发明的蛋白质优选是本质上纯化的形式。
除了cyplasin之外，有许多种蛋白质对肿瘤细胞是细胞毒性的，因此可能具有治疗价值。为获得足够数量/质量的这种蛋白质，它们是重组产生的。优选所述蛋白质应在哺乳动物细胞中生产，优选在人体细胞中，以保证对细胞毒性活性所必需的如糖基化等的二级修饰存在。然而，在所述蛋白质从宿主细胞中分泌而且细胞毒性仅在细胞膜的外侧起反应的情况中，不能实现所述蛋白质的重组产生，因为分泌的蛋白质杀死其宿主细胞。本发明人发现这个问题可以克服，即如果其在合成之后从宿主细胞中的输出被阻断，则这种细胞毒性蛋白质可以在哺乳动物细胞中产生。这可以通过表达编码无分泌前导序列的蛋白质的基因而实现。这种修饰的蛋白质保留在其宿主细胞中，并因此对宿主细胞不再有细胞毒性。在细胞裂解/同质化之后，所述蛋白质释出并可以通过如细胞毒性化合物那样确定的生物化学方法分离并纯化(见实施例11，该实施例是关于在HeLa细胞中重组产生除去分泌信号前导序列的cyplasin)。
因此，本发明还涉及在真核宿主细胞，优选哺乳动物细胞(例如HeLa细胞)中产生蛋白质的一种通常方法，所述蛋白质当外部应用于细胞时对所述细胞是细胞毒性的，所述方法包括如下(a)在所述蛋白质表达的条件下，培养用一种核酸序列转染的一种宿主细胞，所述核酸序列编码缺失或没有功能性分泌信号序列的蛋白质，(b)从所述细胞中回收所述蛋白质。
转染细胞、在细胞中重组产生蛋白质及回收蛋白质的方法已经在上文加以描述。本领域技术人员可以通过熟知的方法例如体外诱变方法产生一种核酸序列，所述核酸序列编码不再从宿主细胞中分泌的蛋白质。确定分泌信号序列的位置(location/position)的方法也为本领域技术人员所熟知，例如在参考文献19-22中所述。
最后，本发明还涉及一种药物组合物，其包含(i)一种核酸分子，优选编码有或无分泌前导序列的蛋白质的核酸分子，或者(ii)本发明的蛋白质与一种药物学可接受的赋形剂、稀释剂或者载体的组合，本发明还涉及所述化合物在制备治疗癌症的药物组合物中的应用。
本领域熟知适宜的药物载体等，包括磷酸盐缓冲溶液、水、乳剂如油/水乳剂、各种类型的增湿剂、灭菌溶液等。这种载体可以通过常规方法配制，并可以以适当剂量给予治疗对象。可以通过不同方式给予合适的组合物，例如通过静脉内给药、腹膜内给药、皮下给药、肌内给药、局部给药或皮内给药。当然给药途径依赖于肿瘤的性质、其位置及药物组合物中含有的化合物类型。使用的剂量方案由临床医生及其它临床因素决定。正如医学领域所熟知的，任一患者的使用剂量依赖于许多因素，包括患者的体重、体表面积、年龄、性别、给予的特定化合物、给药时间和途径、肿瘤的性质和阶段、一般健康状况及同时施用的其它药物。
本发明核酸分子的输送可以通过直接应用或者优选通过使用一种重组表达载体而实现，所述重组表达载体如含有这些化合物的嵌合病毒或者胶体分散系。本发明核酸分子可以作为胶体分散系例如通过弹道输送或者通过动脉导管直接应用于靶位点。可用于输送上述核酸分散分子的胶体分散系包括大分子复合物、毫微囊剂、微球、磁性微球、珠以及基于脂质的系统包括水包油乳剂(混合的)、微团、脂质体和lipoplexes。优选的胶体系是脂质体。脂质体的组合物通常是磷脂和类固醇尤其是胆固醇的组合物。技术人员能够选择适于输送所希望的核酸分子的脂质体。可以使用器官特异性或细胞特异性脂质体以输送至指定的肿瘤。本领域技术人员可以应用已知的方法进行脂质体靶向。这种靶向包括被动靶向(例如应用脂质体的天然趋向性使之分布于含有窦样毛细管的器官的RES的细胞中)或主动靶向(例如通过熟知方法将所述脂质体与一特异性配体偶联，所述配体为抗体、受体、糖、糖脂、蛋白质等)。在本发明中优选使用单克隆抗体通过特异性细胞表面配体将脂质体靶向于特定肿瘤。
用于基因治疗的优选的重组载体是病毒载体，例如腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒，或者更优选的，是一种如逆转录病毒的RNA病毒。更优选所述逆转录病毒载体是鼠或禽类逆转录病毒的衍生物。可用于本发明的这种逆转录病毒例如是莫洛尼鼠类白血病毒(MoMuLV)、Harvey鼠类肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳癌病毒(MuMTV)及劳氏肉瘤病毒(RSV)。最优选地，应用一种非人灵长类动物逆转录病毒载体，如长臂猿白血病毒(GaLV)，与鼠载体相比提供更广泛的宿主范围。由于重组逆转录病毒是缺陷的，因此需要加以辅助以产生可感染的颗粒。这种辅助可例如通过使用含有编码在LTR内的调节序列控制下的逆转录病毒的所有结构基因的质粒的辅助细胞系来提供。本领域技术人员熟知合适的辅助细胞系。所述载体可额外含有编码一种可选择标记的一种基因，以便可以鉴别转导的细胞。另外，所述逆转录病毒可以以使其成为靶向特异性的方式修饰。这可以通过例如插入一种编码糖、糖脂或蛋白质，优选一种抗体的多核苷酸而实现。本领域技术人员已知产生靶特异性载体的其它的方法。体外或体内基因治疗的其它合适的载体和方法在文献中加以描述并为本领域技术人员所已知，例如WO94/29469或WO97/00957。
为实现仅在靶器官例如所治疗的特定肿瘤中表达，本发明的核酸分子可以与组织特异性启动子连接并用于基因治疗。本领域技术人员熟知这种启动子(见例如Zimmermann等(1994)Neuron12，11-24；Vidal等(1990)EMBO J.9，833-840；Mayford等(1995)，细胞81，891-904；Pinkeret等(1987)，Gene&Dev.1，268-76)。
如下实施例例证了本发明。
概括而言，实施例的结果支持了先前关于Aplysia物种产生并分泌高分子量的细胞毒性物质的观点(5，6)。A.punctata分泌的粘液的蛋白质级分当加入不依赖于增殖控制活性的细胞例如培养的细胞中时示出细胞毒性及最终的杀伤活性。这些因子之一已经在肽序列水平定性并称为cyplasin。令人感兴趣地，cyplasin示出对培养细胞的梯度细胞毒性。其对建立的细胞系具有高度细胞毒性，如对神经胶质细胞系和PtK细胞，以及许多原代肿瘤细胞如受试的人黑素瘤细胞具有高度细胞毒性。人皮肤成纤维细胞示出显著的较高耐受性。由于受试的其它肿瘤细胞也是高度敏感的(未示出)，表明cyplasin对建立的细胞系及原代肿瘤细胞尤其具有细胞毒性。人原代成纤维细胞的不同应答可能由于这些细胞不能被认为是肿瘤细胞，尽管它们自主生长(17)。因此，cyplasin可用于在生物体中特异性消除非所需的细胞，如肿瘤细胞。
这种观点通过初步的体内实验支持。当在正常小鼠中注射时，甚至当使用高浓度cyplasin时，也未发现注射的cyplasin有毒性作用。
Cyplasin的天然来源有限，因此其重组产生看起来是其作为抗癌药物的潜在应用的先决条件。在第一个步骤中，我们寻找一种cDNA，其可以被认为编码表观分子量为56kDa的蛋白质，其已经通过生物活性引导测定的分级分离程序分离。使用这种蛋白质的亚序列作为探针以及使用常规的PCR和cDNA克隆技术，我们发现有一种以上的A.punctata转录物包含用作特异性探针的亚序列。在序列水平上可以鉴别编码具有不同羧基末端的多肽的两种cDNA。进而，当基于完整的A.punctata cDNA文库模板以及适应于第一步鉴别的cDNA编码区的引物对而制备的PCR产物被克隆时，各个cDNA克隆示出略微不同的核苷酸序列。实际上，迄今为止研究的所有克隆均示出略微不同的核苷酸序列，结果导致相应多肽中一或多个氨基酸交换。所有这些转录物均源自A.punctata中不同的基因是非常不可能的。翻译后加工如可变剪接、差别性聚腺苷酸化及RNA编辑可产生编码不同多肽的转录物。
在此阶段尚未知在转录水平鉴别的不同多肽是否均表现相同功能。在这种情况中看起来需要选择仅仅一种cDNA(编码称为cyplasin-L的蛋白质)，及研究这个序列是否编码一种细胞毒性蛋白质。发现在大肠杆菌中产生的重组多肽是没有生物学活性的。然而，用表达该选择的cDNA或者该cDNA与EGFP编码核苷酸序列的融合体的构建体转染的真核细胞产生一种细胞毒性因子，其在未转染的细胞或者在cyplasin-S转染的细胞中不存在。用pIZ驱动的表达构建体转染的昆虫细胞(Sf9)变得尤为有用。在这种情况下，可以建立稳定转染的细胞系，其能够制备生物学活性的EGFP标记的cyplasin-L，其数量足以使重组蛋白的生物学活性与从A.punctata分泌粘液中生物化学分离的材料进行对比。通过生物化学分离物及通过重组表达的蛋白质实现的非常相似的形态学作用提示所选择的cDNA是一个有效克隆，其编码表现A.punctata的天然(genuine)的cyplasin的细胞毒性的蛋白质。最后，可以示出当使用编码没有分泌信号序列的蛋白质的DNA序列时，生物学活性的cyplasin可以在HeLa细胞中重组产生。获得了生物活性的重组cyplasin之后，现在可以评价其潜在的抗肿瘤的治疗价值。
实施例1材料和方法(A)cyplasin的生物化学分离海兔A.punctata的蛋白腺的粘液可以在产卵季节期间当它们到达海岸时(在大约4月，在约岛(Ile d’Yeu))从动物上得到。通过轻轻挤压动物，排泄出紫色粘液(大约2.5ml)，当暴露于空气中时形成凝胶。将其立即用磷酸盐缓冲液(PBS，150mMNaCl，10mM NaH2PO4，pH7.2)稀释(1∶1，v/v)并在4℃放置。在2-3小时后，所述混合物成为完全可溶的。随后通过在10000×g在4℃离心15分钟以除去碎片。上清可以冷冻并保持在-80℃而不丧失活性。为进一步纯化，将粘液用1000体积的50mM MOPS，1mM二硫赤藓糖醇，0.5mMEDTA，5mM KCl，pH7.2在4℃透析24小时。含有所述细胞毒活性的蛋白质级分通过用硫酸铵分级分离沉淀而分离。在收集的沉淀物中检测细胞毒活性分别在33％/50％(沉淀1)和50％/66％(沉淀2)饱和度之间。通常在沉淀1中发现大多数细胞毒活性。为进行细胞毒性测试，将所述沉淀溶解于300μl PBS中，用上述缓冲液透析。大多数活性级分包含在SDS-PAGE凝胶上形成一条单带迁移的蛋白质(图1)。
(B)在细胞毒性蛋白质的级分中SGDYILIASYAD肽的鉴别用于微量测序程序的材料在包含50mM MOPS，1mM二硫赤藓糖醇，0.5mM EDTA，5mM KCl，pH7.2的缓冲液中通过凝胶过滤(G-200层析柱，Sigma-Aldrich，Taufkirchen，德国)进一步纯化。将透析及冻干的流出物进行SDS-PAGE并印迹于PVDF膜(ProtoBlot，Applied Biosystems)上。含有令人感兴趣的区域的部分通过WITAGmbH(德国柏林)进行的微量测序程序分析。
(C)细胞毒性测试测试溶解于300μl PBS中的每一沉淀的等分试样对自主生长细胞的毒性作用。术语“自主生长细胞”用于表示能在体外增殖的所有细胞，对比与在生物体内增殖的细胞。用袋鼠(rat kangaroo)细胞系PtK2及人细胞系HeLa进行常规测试。将细胞种植于含有500μl培养基/孔的24孔平板中，使用在24小时后达到约50％铺满的细胞密度。此时加入溶解的沉淀的未稀释等分试样(5μl)，将平行孔中的细胞培养物补加系列稀释液的等分试样(5μl)。
(D)由天然的cyplasin诱导的细胞死亡的鉴定经cyplasin诱导的死亡的细胞的形态学改变通过光学显微镜记录。另外通过将cyplasin处理的细胞与0.5μg/ml非膜通透性化合物H33257(SIGMA-ALDRICH，Taufkirchen，Germany)或者1μg/ml碘化丙啶(Boehringer Ingelheim，Germany)温育。认为核染色是与坏死或者凋亡的最后阶段相关的病理学通透性改变的指征。为区分死亡的凋亡形式，将cyplasin处理的细胞与5μg/ml FITC标记的AnnexinV(Boehringer Ingelheim，Germany)在含有Ca2+的缓冲液中温育20分钟，使用合适的滤光片通过荧光显微镜评价潜在的磷脂酰丝氨酸-Annexin复合物的存在情况(8)。作为对照，细胞凋亡用0.2μg/ml星形孢菌素温育3小时诱导，这种处理诱导磷脂酰丝氨酸明显转位至质膜的外表面，因此变得易与FITC-Annexin结合(9)；另一方面，星形孢菌素的浓度足够低以防止细胞核与碘化丙啶的染色平行进行。
(E)A.punctata cDNA利用Qiagen RNA分离试剂盒从海兔A.punctata的蛋白腺中分离总RNA。使用Clontech SMART II PCR cDNA合成试剂盒(K1052-1)将100ng总RNA转变为cDNA。第一链合成使用所述试剂盒中的修饰的寡-dT引发，用推荐的Rnase H-点突变逆转录酶(Superscript II，Gibco BRL)进行引物延伸。在第一链反应中包括SMART II寡聚物在5’末端诱导模板开关。根据试剂盒使用说明进行这些反应及利用修饰的寡聚物(dT)和SMART II引物进行第一链cDNA的PCR扩增。
(F)编码包含肽SGDYILIASYAD的蛋白质的cDNA的分子克隆扩增的cDNA用作模板，使用相应于搜索序列的特异性引物及非特异性引物的组合例如分别为修饰的寡-dT和Smart II进行PCR。将扩增产物克隆入pBluescript衍生的T突出端载体中并测序。这些序列的真实性通过用相应于特异性SGDYILIASYAD编码引物上游和下游序列的寡脱氧核苷酸引发的PCR反应证实。这些探针非依赖性产物含有编码肽SGDYILIASYAD的核苷酸序列。发现除了文中所述几个碱基交换之外，在SGDYILIASYAD编码序列上游的序列是单一序列。相反，可以检测到两个3’末端序列长度不同(L和S)。
(G)融合及表达构建体将蛋白质编码部分用引物进行PCR扩增，以将合适的限制位点置于扩增产物的5’和3’末端。在用相应的限制酶消化后，将产物直接克隆入表达载体pcDNA3(Invitrogen，以在哺乳动物细胞中表达)、pQE30(Qiagen，以在大肠杆菌中表达)、pIZ/V5-His(Invitrogen，以在昆虫细胞中表达)，或者与在pBluescript载体的XhoI/NotI位点中制备的EGFP编码的cDNA(Clontech)融合。EGFP标记的片段的切除及在pcDNA3载体或pIZ/V5-His载体的合适位点中克隆分别产生相应的cyplasin-EGFP表达构建体，分别适于在哺乳动物细胞和昆虫细胞中表达荧光标记的融合蛋白。
(H)转染及重组蛋白质表达将大肠杆菌M15细胞用在所述载体的His标记的读框中含有cyplasin-L和cyplasin-S编码插入体的pQE30质粒转化。表达的His标记的蛋白质利用Ni-NTA琼脂糖根据Qiagen提供的方案分离。将HeLa细胞利用Effectene转染试剂盒(Qiagen)用含有EGFP-标记的或者未标记的cyplasin-L和cyplasin-S编码插入体的pcDNA3质粒转染。用含有编码cyplasin-L或cyplasin-L-EGFP的插入体的构建体转染的细胞不能长期存活。然而，这种培养物的上清含有文中所述细胞毒性因子。将SF9细胞使用另外的Effectene转染试剂盒(Qiagen)用含有EGFP标记的或未标记的cyplasin-L编码插入体的pIZ/V5-His质粒转染。与哺乳动物细胞相反，转染的昆虫细胞存活。表达之后通过荧光显微镜观测存活细胞或者测试胞质提取物的细胞毒性因子的存在情况。
(I)稳定转染SF9细胞以大规模生产cyplasin-L-EGFP将用质粒pIZ/V5-His-cyplasin-L-EGFP转染的SF9细胞在26℃在补加10％胎牛血清、5mM Glutamax(LIFE Technologies，Karlsruhe，Germany)和100μg/ml zeocin(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)的TNM-FH昆虫培养基(Applichem，Darmstadt，Germany)中作为半贴壁细胞生长3个月。将细胞培养物间隔4天以1∶3稀释。初始的转染效率未大约10％，在3个月之后5％的细胞保持荧光。认为后者是稳定转染的。将这部分细胞通过流式细胞仪(Beckton-Dickinson)分离。在4周后进行的第二次分选之后，可以将所得培养物以几升规模旋动培养生长，90％的这些细胞表达cyplasin-L-EGFP融合蛋白。
(J)从稳定表达cyplasin-L-EGFP的SF9细胞中回收细胞毒性因子EGFP-标记的cyplasin-L不是分泌入SF9的培养基中。通常地，将1-2×108稳定转染的Sf9细胞悬浮及离心(1000×g，3分钟)而洗涤，一次在PBS中，一次在50mM MES、lmM EDTA、5mM KCl、0.1％巯基乙醇，pH6.0中。将它们在5ml的后一缓冲液中匀浆。匀浆及随后的步骤均在4℃进行。在纯化步骤中使用蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)。将所述匀浆离心(100000×g，60分钟)，将上清用于已经用上述缓冲液平衡的DEAE-Cellulose柱(DE52，Sigma Aldrich，Taufkirchen，Germany)中。将该柱使用用于平衡的缓冲液充分洗涤，随后应用NaCl梯度(0-200mM)洗涤。将100μl每个级分加入到500μl培养基中生长的指示细胞(PtK)中，测试洗脱的级分中所述细胞毒性因子的存在情况。如果存在所述细胞毒性因子，则在大约5小时后观测到细胞毒性作用。含有所述因子的级分在60和80mM NaCl之间洗脱。认为具有这些特性的级分是“标准”提取物，并用于其它生物学测试中，例如在图5所述那些测试。
(K)分离自稳定转染的SF9细胞的细胞毒性提取物中cyplasin-L-EGFP的鉴别将如上所述分离的并具有细胞毒性活性的蛋白质级分浓缩，通过12.5％SDS-PAGE分离。在同一凝胶上分离两个相同的样品(包括一种蛋白质标准物)。将一部分凝胶使用银染程序染色，另一部分电印迹(半干印迹设备，Biometra，Gottingen，Germany)到PVDF转移膜(Western，Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)上。缓冲液成分为3.03g硼酸、200ml甲醇、800ml H2O，pH9.0。在用BLOTTO封闭后(10)，将该膜与含有0.1％BSA、1∶2000稀释的抗GFP抗体(ABCAM，Cambridge，U.K.)，pH7.2的PBS中温育3小时。在PBS中延长漂洗后，利用一种碱性磷酸酶偶联的山羊抗兔抗体(Dianova，Hamburg，Germany)进行免疫检测，所述抗体在26℃，以在含有0.1％BSA的PBS，pH7.2中1∶12000稀释液应用3小时。将印迹在PBS中漂洗并置于由100mM TRIS、5mM MgCl2、0.3mg/ml硝基四氮唑蓝、0.15mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐，pH9.5组成的染色溶液中。
(L)动物实验将DBA2小鼠在尾静脉(1组)或皮下(2组)注射300μl(10μM)天然的cyplasin。Cyplasin已经先在4℃用大体积的PBS透析24小时，并在立即注射之前通过将PtK细胞与10nM cyplasin温育测试阳性细胞毒性。重组cyplasin也用PBS透析，也在注射之前测试确定的细胞毒性，并将300μl注射入尾静脉中。将小鼠在标准条件下维持并观测4周。
(M)用于大规模生产无分泌信号序列的cyplasin-L-EGFP的稳定转染的HeLa细胞在用相应限制酶消化之后，将cyplasin L-(-Sig.Seq)编码cDNA与在pBluescript载体的XhoI/NotI位点制备的EGFP编码cDNA(Clontech，Heidelberg，Germany)融合。切除EGFP-标记的片段并再克隆入pcDNA3载体(Invitrogen)的合适位点中，导致在哺乳动物细胞中荧光标记的融合蛋白的相应Cyplasin-L-(-Sig.Seq)-EGFP表达。使用G-418-硫酸盐抗性选择成功转染的细胞。
(N)其它方法利用HUSAR程序包(DKFZ)进行数据库查询和序列分析，所述程序包是基于GCG公司(Madsion，WI.，美国)开发的GCG程序包的序列分析工具的集合。为鉴别所述分泌信号序列，我们应用McGeoch扫描程序(11)。利用373A型自动DNA测序仪(AppliedBiosystems)由A.Hunziker(德国癌症研究中心)进行DNA测序。
实施例2cyplasin编码cDNA的分子克隆从A.punctata的蛋白腺的RNA中制备的cDNA包含一个以上的编码肽SGDYILIASYAD的转录物。克隆编码羧基末端部分显著不同但均包含靶序列的蛋白质的两个cDNA(图2)。这些cDNA之一编码具有558个氨基酸残基分子量为62.4kDa的蛋白质(称为cyplasin-L)，而另一个cDNA反映一个编码较短的蛋白质(421个氨基酸残基，分子量为46.9kDa，称为cyplasin-S)的转录物。另外，用cyplasin-L特异性引物对对总cDNA进行PCR产生序列与分别编码cyplasin-L和cyplasin-S的那些序列不同的DNA片段。因此，看起来存在一些既与cyplasin-L不同又与cyplasin-S不同的mRNA。这些序列的微不均一性提示A.punctata产生未知数目的非常相似但不是100％相同的包含靶序列的蛋白质。基于可利用的数据不能确定这些不同的mRNA和蛋白质是否例如通过可变剪接与RNA编辑组合而衍生自单个基因，或者是否存在非常相似但不是100％相同的一簇基因。
实施例3由克隆的cDNA编码的蛋白质cyplasin-L和cyplasin-S的序列特征生物化学数据(未示出)提示天然发生的cyplasin是一种糖蛋白。Cyplasin-L cDNA衍生的氨基酸序列包含5个在氨基酸位置N-151、N-271、N-401、N-416和N-422的Asn连接(N-X-S或N-X-T)的糖基化位点，这与所述生物化学数据一致。糖基化位点1-4在衍生自cyplasin-S cDNA的多肽中不发生变化，而N-422位在较短的序列中缺失。
N末端以高概率的疏水性分泌信号序列开始，推定的切割位点在氨基酸位置52(Ser)和53(Ala)之间。因此，成熟的及具有期望功能的蛋白质的分子量分别为57.2kDa和41.6kDa。这些成熟蛋白质的计算等电点为cyplasin-L是5.54(电荷-13)，cyplasin-S是6.20(电荷-5)数据库查询核苷酸序列揭示与两个其它Aplysia序列的相似性，所述两个其它Aplysia序列即编码aplysianin-A前体的A.kurodai蛋白腺mRNA((12)，70.9％相同性，D83255)及编码achacin的A.fulicaFerussac mRNA((7)，52.2％相同性，X64584)。数据库查询cyplasin亚序列揭示出上述Aplysia物种的一些氨基酸序列及许多具有较长一串局部相同性或同源性的蛋白质序列。后面的这些序列均属于单胺氧化酶类别。表1示出具有真核及原核单胺氧化酶亚序列的一个显著的cyplasin肽串。令人感兴趣地注意到数据库查询这个及其它cyplasin典型序列揭示与其它类别的蛋白质无明显一致。
表1数据库查询pCyplasin衍生的氨基酸序列产生多个反映单胺氧化酶的序列的查询结果序列 准入号no 生物体-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------62 NIGVFEFCDRVGGRLFT 78 Cyplasin A.punctata+ V E DRVGGR FTI51346Rainbow trout+ V E +RVGGR +TOXLA_CROADCrotalusN+ V E +RVGGR +TAOFA_BOVINBovin++ V E D VGGR +TAOFB_RAT Rat++ V E DRVGGR +TAOFA_HUMANHumanN+ V E DRVGGR +TAOFB_HUMANHuman++ FE +RVGGR+F+T08202Prokaryotic+FE DR+GGR+++T22714Prokaryotic+ VFE DRVGGR TAOFH_MYCTUProkaryotic++ +FE +VGGR TTR2M_AGRVIProkaryotic++ V+E DR+GG+L++TR2M_AGRRAProkaryotic++ ++E DRVGG+L++A20966Prokaryotic+ + E R GGR+ TE69899Prokaryotic++ ++E DRVGG+L++TR2M_AGRT3Prokaryotic+ V E DRVGGR ++PUO_MICRU Prokaryotic实施例4生物学失活的重组体在大肠杆菌中的表达Cyplasin编码cDNA序列在pQE/大肠杆菌M15系统中的重组表达产生完全不溶解于不含去污剂的缓冲液的多肽，当这种重组表达的多肽的悬浮液与培养的细胞一起温育时不能发挥任何细胞毒性作用(未示出)。这种无细胞毒活性推测是由于在大肠杆菌系统中表达的多肽的不正确折叠和/或缺乏翻译后修饰所致。
实施例5在哺乳动物细胞中产生生物活性的重组体相反，哺乳动物细胞例如HeLa S3悬浮细胞，当用指定的cyplasin-L或EGFP-标记的cyplasin-L的CMV载体驱动的表达构建体转染时，产生一种细胞毒性因子。这个因子在未转染的细胞培养物中或在用表达cyplasin-S的构建体转染的细胞培养物中检测不到。所述细胞毒性因子的产生很明显，因为产生因子的培养物中的所有细胞最后均以典型方式死亡，这在用分离自A.punctata的粘液中的天然的cyplasin处理哺乳动物细胞时观测到的方式相一致。因为在这种培养物中只有一部分细胞被转染，随后所述细胞毒性因子必须从生产细胞中释放，结果生产和非生产细胞均死亡。细胞毒性因子的释放与在cDNA衍生的氨基酸序列的氨基末端的推定的分泌信号非常一致(图2)。
尽管这种自身破坏系统不适于产生显著量的生物活性重组体，但其揭示了cDNA克隆方案的有效性，以及表明由具有较长插入体的cDNA编码的因子示出cyplasin的典型特征。
实施例6生物活性cyplasin-L和cyplasin-L-EGFP在昆虫细胞中的重组表达已知昆虫细胞(例如Sf9)能进行与哺乳动物细胞相似的翻译后修饰。由于Sf9细胞被证实对天然的cyplasin制品的敏感性更低(未示出)，因此它们尤为适于生产进行生物学测试足够量的重组cyplasin。用表达cyplasin-L或EGFP标记的cyplasin-L的pIZ载体驱动的构建体转染SF9细胞不能影响SF9细胞的增殖速度。另外，用cyplasin指定的构建体转染的SF9细胞的用过的培养基含有针对哺乳动物细胞培养物的显著的细胞毒性活性，其示出cyplasin-L的分泌信号在昆虫细胞中也起作用。
相反，从用EGFP标记的cyplasin-L指定的构建体转染的SF9细胞中无细胞毒性因子释放。所述cyplasin-L-EGFP融合蛋白在SF9细胞中明显表达，这也通过EGFP依赖性荧光示出(图3)，但在用过的旋动培养的培养基中未检测到足够量的细胞毒性因子。令人感兴趣地，图4中示出的Western印迹表明所述融合蛋白的cyplasin-L部分中缺失信号序列。这个切割必须以截短的融合蛋白保留细胞溶质的方式发生。或者，假定从ER向胞质逆向运输。这种逆向运输先前在其它系统中已经观测到(13，14，15，16)。
然而，当与EGFP融合时重组表达的截短的cyplasin-L的细胞毒活性仍保留。发现匀浆的表达cyplasin-L-EGFP的SF9细胞的高速上清含有对培养的哺乳动物细胞具有细胞毒性的因子。结果，稳定转染的表达cyplasin-L-EGFP的Sf9细胞系通过流式细胞仪(FACS)分选产生，这种培养物的高速上清部分含有所述cyplasin-L-EGFP融合蛋白(图4)并表现图5所示生物学活性。
实施例7cyplasin依赖性细胞毒性的特点正在增殖的哺乳动物细胞当用经生物化学方法从A.punctata中分离的天然的cyplasin处理时表现时间和浓度依赖性的形态学改变(图5)。天然的cyplasin的细胞毒性作用在例如PtK细胞中在少于1小时在50nM变得可观测到。就此细胞系而言，最小细胞毒性cyplasin浓度为2nM，然而在此浓度所述细胞毒性作用在24小时之后看起来最明显。一旦诱导，则cyplasin作用不可逆，而且甚至将含有cyplasin的培养基置换为新鲜培养基时也可观测到细胞死亡。其它培养的哺乳动物细胞示出较低(人皮肤成纤维细胞)或者甚至较高的敏感性(人黑素瘤细胞，神经胶质细胞)(图5)。
Cyplasin诱导的细胞死亡的形态学时特异性的。细胞如果以单层或成群生长则从基层脱离，皱缩并彼此分离，有时候出现许多小浆泡。这种类型的形态学改变在经历凋亡的细胞中也观测到，但是缺失凋亡的典型指征，包括细胞核断裂而且外膜上磷脂酰丝氨酸的暴露(图6)。
另外，cyplasin只对分裂间期的细胞发挥其细胞毒性作用。在当同一培养基中大多数分裂间期的细胞已经示出cyplasin典型形态学变化时，有丝分裂的细胞仍能完成分裂后期和胞质分裂(图7)。然而，在完成有丝分裂之后，当再进入分裂间期时这些细胞也死亡。细胞通透性和微管骨架及细胞内Ca2+水平均不受cyplasin影响(未示出)。
实施例8生物活性的重组cyplasin-L-EGFP的评价生物化学分离的天然的cyplasin与重组cyplasin-L-EGFP的彻底并排对比遇见的问题是所述重组体目前仅在丰富的提取物水平才可获得。尽管提取物数量远远不够，但显然从稳定转染的SF9细胞中提取的cyplasin-L-EGFP表现与通过生物化学分离的天然的cyplasin诱导的非常相似的细胞毒活性。图5并列示出天然的cyplasin和重组cyplasin-L-EGFP对四种不同的细胞系的作用，所述细胞系确定对天然的cyplasin具有不同敏感性。使用从表达cyplasin-L-EGFP的SF9细胞中提取的常量提取物，显而易见人皮肤成纤维细胞(HSF)对重组cyplasin-L-EGFP相对不敏感，其对生物化学分离的天然的cyplasin也如此。当用天然的cyplasin(50nM)或含有cyplasin-L-EGFP的标准提取物处理时，这些细胞仅示出略微开始收缩及微弱的皱缩趋向。最后，这些细胞恢复并持续增殖。HSF细胞的死亡仅在100nM浓度的cyplasin观测到(未示出)。相反，衍生自人黑素瘤活检组织的细胞当与天然的cyplasin(20nM)及与标准提取物温育时表现显著较高的敏感性。用天然的cyplasin或者用重组cyplasin-L-EGFP处理的黑素瘤细胞示出典型的cyplasin诱导的收缩、液泡形成及最后细胞死亡。这个图的其它部分示出衍生自大鼠胚胎皮层的建立细胞系的神经胶质细胞。这些细胞在目前研究的所有细胞中表现最高的cyplasin敏感性。典型的cyplasin作用在低如0.2nM的浓度观测到，在5小时的观测期间内观测到细胞完全死亡。大袋鼠品系PtK的细胞与2nM天然的cyplasin温育5小时后在5小时内不可逆转地损害。在用标准提取物处理后观测到相似的作用。这些细胞中显著的浆泡和膜改变由天然的cyplasin以及由重组cyplasin-L-EGFP诱导。
概括而言，这些结果示出分子克隆方案揭示了一种cDNA，其编码表现与在A.punctata的分泌粘液中检测的细胞毒性相似活性的因子，所述重组蛋白质的细胞毒性作用没有因与EGFP的融合而丧失。
实施例9cyplasin作用的靶位点目前还未证实cyplasin及重组cyplasin的细胞毒性作用的精确机制。然而，细胞吸收这种大小的蛋白质继而发挥负性细胞内的影响是不太可能的。对cyplasin处理的细胞进行长期观测表明细胞毒性作用的第一个迹象发生在细胞膜外，此时内部细胞形态无异常表现。这个观测结果提示cyplasin停靠于细胞膜外触发一系列仍未知的事件，最后导致细胞死亡。这个观点也与其它观察结果一致。用cyplasin-L或EGFP标记的cyplasin-L的表达构建体转染的哺乳动物细胞最初存活，它们能产生所述细胞毒性因子。然而，一旦所述细胞毒性因子在用过的培养基中可检测到，则它们表现改变的形态。这个结果提示胞外cyplasin是细胞毒性的，而胞内cyplasin则是非毒性的。最后，用自稳定转染的SF9细胞中提取的cyplasin-L-EGFP融合蛋白处理的哺乳动物细胞变为环绕有一圈微弱的荧光融合蛋白，所述细胞随后特征性收缩及皱缩。
实施例10cyplasin没有体内毒性为测试cyplasin在体内是否也示出细胞毒性作用，将天然的cyplasin或重组cyplasin注射入三组小鼠中。1组由12只DBA2小鼠组成，在其尾静脉中注射高浓度的cyplasin。所使用的浓度远远超过发现在体外有毒性的浓度。然而，所有小鼠均存活至少达到4周。当在第2组中对12只小鼠在相同条件下皮下注射cyplasin时，获得相同结果。它们均存活而且在观测期间未发现有负性作用。最后，为第3组(6只小鼠)经尾静脉注射重组的cyplasin。同样，所有小鼠均存活。
实施例11在HeLa细胞中无分泌前导序列的重组cyplasin产生Cyplasin如果是分泌的则对宿主细胞是细胞毒性的。因此，现在研究这个问题是否可以通过使用在人细胞中重组产生cyplasin而克服，产生编码没有分泌信号序列的cyplasin的一种DNA。使用“信号P程序”(19-22)分析cyplasin的氨基酸序列(图2)。在所述氨基酸序列的N末端部分发现信号序列的两个潜在的剪切位点，其使cyplasin定性为分泌的蛋白质(见图10)。推定的剪切位点在氨基酸位置19和20之间(最高概率)或者52和53之间(较低概率)。为保证除去完全的信号序列，将编码从氨基酸位置1-52的信号肽的DNA序列从上述实施例1(F，G)所述cyplasin编码质粒的插入体中除去。将包含EGFP标记的修饰的DNA序列在pcDNA3载体的合适位点克隆，产生相应的cyplasin-L-(Sig-Seq)-EGFP表达构建体。然后用此构建体转染HeLa细胞。为鉴别转化的细胞，使该构建体另外能表达作为标记的编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因。在使用抗生素G418-硫酸盐正确选择转化的细胞之后及将转染的细胞培养几周以选择载体稳定整合入其基因组中的转化体之后，进行单一细胞克隆。如图12所示，稳定转染的细胞表达cyplasin。Cyplasin如实施例1(J，K)所述分离，使用实施例1(C，D)所述方法可以示出其与分离自Aplysia punctata的天然cyplasin表现相同的细胞毒活性。
含有无信号序列的cyplasin的编码序列的质粒(pcDNA3-Cytoplasin.Mut-(-Sig.Seq)-EGFP)，根据布达佩斯条约于2002年8月22日保藏在DSMZ(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen Gmbh，Mascheroder Weg 2，Braunschweig，Germany)。
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权利要求
1.一种分离的核酸分子，其编码具有缺失的或无功能的分泌信号序列的蛋白质cyplasin或者表现其生物学性质的蛋白质，所述核酸分子选自如下一组(a)编码包含图2(a)所示从第20位或第53位至第558位的氨基酸序列的蛋白质的一种核酸分子；(b)包含图2(b)所示序列的一种核酸分子；(c)一种核酸分子，其核酸序列由于遗传密码简并而衍生自(a)或(b)中所述核酸序列；(d)一种核酸分子，其代表(a)、(b)或(c)中所述核酸序列的片段、衍生物或者等位基因变体。
2.一种重组载体，其含有权利要求1的核酸分子。
3.权利要求2的重组载体，其中所述核酸分子可操作性地与调节元件连接，使得可以在原核和/或真核宿主细胞中转录及合成一种可翻译的RNA。
4.一种重组的宿主细胞，其含有权利要求2或3的重组载体。
5.权利要求4的重组宿主细胞，其是哺乳动物细胞、细菌细胞、昆虫细胞或酵母细胞。
6.一种分离的蛋白质，其表现权利要求1的核酸分子编码的cyplasin的生物学性质。
7.一种生产表现cyplasin生物学性质的蛋白质的方法，包括如下步骤(a)在使所述蛋白质表达的条件下培养权利要求4的重组宿主细胞；(b)回收所述蛋白质。
8.一种在真核宿主细胞中生产一种蛋白质的方法，当所述蛋白质中从所述细胞中分泌或者从外部施用时对所述细胞有细胞毒性，所述方法包括如下步骤(a)在使所述蛋白质表达的条件下培养用编码具有缺失或无功能的分泌信号序列的所述蛋白质的核酸序列转染的宿主细胞，；(b)回收所述蛋白质。
9.权利要求8的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
10.通过权利要求7或8的方法生产的蛋白质。
11.一种药物组合物，其包含权利要求1的核酸分子或者权利要求6或10的蛋白质。
12.权利要求1的核酸或者权利要求6或10的蛋白质在制备治疗癌症的药物组合物中的应用。
全文摘要
本发明描述了编码称为“cyplasin”的蛋白质的一种核酸，cyplasin示出对自主生长的哺乳动物细胞的优先毒性。由这种蛋白质诱导的细胞死亡与凋亡和坏死均不同。在细胞培养物中重组制备cyplasin时发生的胞内细胞死亡可以通过除去cyplasin序列中的分泌信号而避免。这种修饰使得可以在哺乳动物细胞培养物中表达cyplasin，这对于所获得的蛋白质的糖基化模式是优选的。因此，本发明还涉及一种在真核细胞、优选在哺乳动物细胞中重组生产一种蛋白质的方法，所述蛋白质当从外部施用时对所述细胞具有细胞毒性。
文档编号A61K38/00GK1622956SQ02828469
公开日2005年6月1日 申请日期2002年12月18日 优先权日2002年1月7日
发明者克里斯蒂安·佩策尔特 申请人:克里斯蒂安·佩策尔特