专利名称：灯盏花素脂质体及其冻干粉针剂与制备方法
技术领域：
本发明属于含中草药有效部位的脂质体及其冻干粉针剂与制备方法，具体为含灯盏花素的脂质体、其脂质体冻干粉针剂及相应的制备方法。
背景技术：
灯盏花为菊科短葶飞蓬属一年生草本植物(Erigron brevi-scapus(vaniot)HandMazz)，其活血化瘀的主要有效成分为灯盏乙素(Scutellarein-7-O-glucuronide)。目前灯盏花提取物中除主要有效成分灯盏乙素外，尚有少量灯盏甲素和其它多种成分。灯盏乙素其化学结构为黄酮甙元，本身不稳定且难溶于水。一般在碱性pH下溶解配制注射液，但受多成分及降解的影响，澄明度和稳定性均难以保证。现临床使用的小针注射液，生产中采用添加吐温80等表面活性剂的方法增溶，当将注射液加入到输液中稀释给病人静脉注射时，由于吐温80被稀释和pH值的改变，增溶效果下降，输液往往产生沉淀，尤其在给药剂量较大时更为严重，带来不安全因素。国内对灯盏花素注射液开展了制剂学研究，举行过二次全国性的灯盏花素注射液专题研讨会，实践证明本品不能直接制备成输液剂，用冷冻干燥技术可以制备注射用粉针，对提高贮存稳定性有一定作用，但不能解决稀释过程中的溶解和安全性问题。另一方面，在临床用药中，灯盏花素的给药剂量为50-100mg/日，即将灯盏花素注射剂20-40ml加5％葡萄糖注射液或0.9％氯化钠注射液滴注，10-20天为1疗程，剂量大，给药间隔短，而其适应症都是一些慢性病，因此，病人的顺医性差，严重影响了其疗效和临床应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于研究一种临床适用的灯盏花素脂质体及其注射用冻干粉针，既能显著提高贮存稳定性，又能使灯盏花素脂质体冻干粉在加入注射用水重新溶散后，能以任意比例与输液稀释给药而不产生沉淀和降解产物，尤其是在给药剂量较大情况下，最大限度的减少临床用药的不安全因素。另外，使脂质体中的药物持续释放，提高血药浓度、延长在血液中循环时间，以提高药物有效成份的生物利用度。
本发明还要解决所述灯盏花素脂质体及其注射用冻干粉针的可工业化生产的制备方法。
为解决上述问题，本发明提供如下技术方案。
一种灯盏花素脂质体，其特征在于灯盏花素、磷脂、胆固醇的重量比为1∶2-65∶0-15份。
其较好的比例为灯盏花素1份、磷脂30-60份、胆固醇5-10份。
所述灯盏花素脂质体，其特征在于灯盏花素主要由灯盏乙素组成，可含少量灯盏甲素(常用的规格为干燥品中灯盏乙素标示量80-105％含量范围，余为灯盏甲素及少量相关成分)；磷脂为大豆磷脂、卵磷脂或合成磷脂。
一种灯盏花素脂质体的制备方法，其特征在于经下述步骤制备，1)按重量比取磷脂2-65份与胆固醇1-15份，溶于氯仿和/或甲醇溶剂中，除去溶剂；再加入溶有1份灯盏花素的pH6-8的磷酸盐缓冲液；形成混悬液，匀化；或者2)向pH6-8的磷酸盐缓冲液中通入氮气，按重量比将1份灯盏花素溶于其中，再加入磷脂2-65份，混合乳化，匀化；或者3)按重量比取灯盏花素1份加入pH6-8的磷酸盐缓冲液中，取磷脂2-65份和胆固醇1-15份溶于低极性有机溶剂，混合两液，乳化，除去有机溶媒；或者4)按重量比取磷脂2-65份与胆固醇1-15份溶于低极性有机溶剂，加入pH6-8的磷酸盐缓冲液，混合乳化，除去溶媒。
较好的灯盏花素脂质体的制备方法，其特征在于1)按重量比取磷脂30-60份与胆固醇5-10份，溶于氯仿/甲醇混合溶剂中，加热蒸去溶剂；再加入溶有1份灯盏花素的pH6-8的磷酸盐缓冲液；形成混悬液，匀化；或者2)向pH6-8的磷酸盐缓冲液中通入氮气，按重量比将1份灯盏花素溶于其中，再加入磷脂30-60份，混合乳化，匀化；或者3)按重量比取灯盏花素1份加入pH6-8的磷酸盐缓冲液中，取磷脂30-60份和胆固醇5-10份溶于乙醚，混合两液，乳化，除去有机溶媒；或者4)按重量比取磷脂30-60份与胆固醇5-10份溶于乙醚，加入pH6-8的磷酸盐缓冲液，混合乳化，除去溶媒；与含有1份灯盏花素的pH6-8的磷酸盐缓冲液混合。
前述灯盏花素脂质体的制备方法，其特征在于灯盏花素溶于pH6-8的磷酸盐缓冲液时，加入氢氧化钠、磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、半胱氨酸、烟酰胺、苯甲酰胺、脲、硫脲、乙二胺、二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、三乙胺、葡甲胺和/或三羟甲基氨基甲烷。
所述灯盏花素脂质体的冻干粉针剂，其特征在于基本由脂质体与右旋糖酐、单糖、双糖和/或多糖组成；右旋糖酐、单糖、双糖和/或多糖的量按磷脂重量比计算，1份磷脂加入0.2-4.0份右旋糖酐、单糖、双糖和/或多糖。
较好的灯盏花素脂质体的冻干粉针剂，其特征在于单糖为甘露醇、葡萄糖，双糖为乳糖、蔗糖，多糖为海藻糖，其量按磷脂重量比计算，1份磷脂加入0.5-1.0份的右旋糖酐、单糖、双糖和/或多糖。
一种灯盏花素脂质体冻干粉针剂的制备方法，其特征在于将前述灯盏花素脂质体冷却到室温，加入右旋糖酐、单糖、双糖和/或多糖，其量按磷脂的重量比计算，1份磷脂加入0.2-4.0份，过滤后，冷冻干燥。单糖为甘露醇、葡萄糖，双糖为乳糖、蔗糖，多糖为海藻糖，其较好的量为按磷脂重量比计算，1份磷脂加入0.5-1.0右旋糖酐、单糖、双糖和/或多糖。
所述灯盏花素脂质体的冻干粉针剂，其特征在于以任意比例与输液稀释后，包封率为60％～90％，粒径为20nm～1μm。所述任意比例与输液稀释，是指以药学上适用比例与输液稀释。
为了完成本发明之目的，特别涉及一种灯盏花素脂质体和冻干粉及它们的制备方法，其特征在于灯盏花素与磷脂的重量比为1∶2-60，与胆固醇的重量比为1∶0-10。根据本发明可以使用常用的磷脂，如大豆磷脂或卵磷脂或合成磷脂。磷脂酰胆碱纯度可在76％-100％间，优选纯度＞93％。磷脂酰胆碱纯度高时，其用量可适当减少。
所述脂质体中优选每ml脂质体混悬液中含有1-5mg灯盏花素。加入pH调节剂如氢氧化钠、磷酸盐，碳酸盐，柠檬酸盐，半胱氨酸及有机胺，如烟酰胺、苯甲酰胺、脲、硫脲、乙二胺、二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、三乙胺、葡甲胺、三羟甲基氨基甲烷，调节pH值至6-8，可以增加灯盏花素在脂质体中的包封率。加入冻干保护剂如甘露醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖等有助于脂质体冻干粉的重组及稳定。其中甘露醇、葡萄糖和海藻糖尤佳。冻干保护剂与磷脂之比为0.2-4∶1，以0.5-1∶1为佳。
本发明的脂质体可用旋转蒸发法、逆相蒸发法、高压匀化法、pH梯度法等方法制备。
本发明灯盏花素脂质体的单位体积中的灯盏花素含量高，表明了本发明的配方与工艺既可使脂质体达到高的包封率，又有稳定的载药量。脂质体中的药物持续释放，显著提高了血药浓度，延长药物在血液中循环时间。本发明临床适用的灯盏花素脂质体注射用冻干粉针，既能显著提高贮存稳定性，又能使灯盏花素脂质体冻干粉在加入注射用水重新溶散后，能以任意比例与输液稀释给药而不产生沉淀和降解产物，尤其是在给药剂量较大情况下，从而最大限度的减少临床用药的不安全因素。本发明灯盏花素脂质体注射用冻干粉针剂的生物利用度是普通注射剂的8倍，从而可以减少剂量。
本发明还解决了所述灯盏花素脂质体及其注射用冻干粉针的可工业化生产的制备方法。
图1、灯盏花素脂质体与市售普通注射剂家兔耳缘静脉注射的经时曲线(n＝3)具体实施方式
原料来源市售灯盏花素，可从灯盏花、灯盏细辛或其他植物中按常规方法提取。允许规格为干燥品中灯盏乙素标示量80-105％含量范围，余为灯盏甲素及少量相关成分。
实施例1称取600mg大豆磷脂(纯度＞76％磷脂酰胆碱)和100mg胆固醇溶解于氯仿/甲醇(1∶1)(氯仿与甲醇的比为1∶0.5-2)混合溶剂中，将该溶液置于磨口圆底烧瓶中，于26-28℃恒温水浴上用旋转蒸发仪在100rpm并减压的条件下蒸去有机溶剂，使磷脂等成膜材料在烧瓶底部形成一均匀类脂膜，置于真空干燥器中，室温条件下放置4小时(4-12小时)备用。另将10mg灯盏花素，2mg氢氧化钠加入5ml(2-10ml)pH7.4磷酸盐缓冲液中，再将其加入到上述圆底烧瓶中，在32℃下用旋转蒸发仪转动洗膜，直至类脂薄膜水合变成乳白色脂质体混悬液，高压匀化(Avestin均质机)减小粒径(5000psi，3次)即得。将300mg甘露醇溶解在脂质体中，无菌过滤后(膜滤器孔径0.2μm)，将最终分散物分装西林瓶中，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的脂质体在40℃贮存3个月后，灯盏花素含量为95.5％，且加入2ml注射用水重组得到的脂质体包封率为80％，粒径为600nm，以5％葡萄糖注射液或0.9％氯化钠注射液稀释后10小时无沉淀析出。
实施例2在20ml pH6.8磷酸盐缓冲液中通入氮气10分钟。通氮后将100mg灯盏花素和40mg乙醇胺溶于其中，然后加入800mg大豆磷脂(纯度＞93％磷脂酰胆碱)。使用高速搅拌机在65℃将该混合物分散达10分钟。在补充蒸发水分后，将预分散物转移至高压匀化器中。在5000psi和65℃下匀化3次，将脂质体冷却至室温。将1.2g葡萄糖溶于脂质体中，无菌过滤后(膜滤器孔径0.2μm)，将最终分散物分装入西林瓶中，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的脂质体在40℃贮存3个月后，灯盏花素含量为96.5％，且加入2ml注射用水重组得到的脂质体包封率为90％，粒径为100nm，以5％葡萄糖注射液或0.9％氯化钠注射液稀释后10小时无沉淀析出。
实施例3将30mg灯盏花素、12mg碳酸氢钠加入10ml pH6.8磷酸盐缓冲液溶解，再将900mg卵磷脂(纯度＞93％磷脂酰胆碱)、100mg胆固醇溶于20ml乙醚中，再将灯盏花素水溶液加至磷脂乙醚溶液中，二者混合进行乳化，然后减压除去有机溶媒，探针式超声0.5min即可。将900mg海藻糖溶解在脂质体中，无菌过滤后(膜滤器孔径0.2μm)，将最终分散物分装入西林瓶中，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的脂质体在40℃贮存3个月后，灯盏花素含量为97.5％，且加入2ml注射用水重组得到的脂质体包封率为85％，粒径为25nm，以5％葡萄糖注射液或0.9％氯化钠注射液稀释后10小时无沉淀析出。
实施例4称取900mg合成磷脂(DMPC，纯度＞93％磷脂酰胆碱)、100mg胆固醇溶于20ml乙醚中，再将5ml pH8.0磷酸盐缓冲液加至磷脂乙醚溶液中，二者混合进行乳化，然后减压除去有机溶媒，探针式超声0.5min，备用，作为空白脂质体。另将30mg灯盏花素和18mg半胱胺酸加到5ml pH8.0磷酸盐缓冲液中溶解，再与空白脂质体混合，用0.1MHCL调pH值至7.0，之后在37℃水浴中平衡30min(15-60min).脂质体冷却至室温后，将600mg乳糖溶于脂质体中，无菌过滤后(膜滤器孔径0.2μm)，将最终分散物分装入西林瓶中，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的脂质体在40℃贮存3个月后，灯盏花素含量为98.5％，且加入2ml注射用水重组得到的脂质体包封率为88％，粒径为200nm，以5％葡萄糖注射液或0.9％氯化钠注射液稀释后10小时无沉淀析出。
实施例5灯盏花素脂质体家兔体内药代动力学性质的考查a.给药与取血方案灰兔3只，雌雄不限，体重(1.87±0.058kg)，由本校实验动物中心提供，分别由一耳静脉注射市售灯盏花素注射剂，2min内注射完毕，给药后分别于5，15，30，45，60，120，180，300，420，540min从另一侧耳缘静脉取血，每次0.5ml。所采血样均用肝素抗凝，并立即分离血浆。一周后，在同一动物上等剂量(4mg/kg)注射本发明灯盏花素脂质体混悬液(将冻干粉针用注射用水溶解分散)，给药后分别于5，15，30，45，60，120，180，300，540，720，1440min取血，置于肝素化的离心管中。
b.经时曲线，参见图1。
c.有关药动参数
权利要求
1.一种灯盏花素脂质体，其特征在于灯盏花素、磷脂、胆固醇的重量比为1∶2-65∶0-15份。
2.根据权利要求1所述灯盏花素脂质体，其特征在于灯盏花素、磷脂、胆固醇的重量比为1∶30-60∶5-10份；灯盏花素主要由灯盏乙素组成，可含少量灯盏甲素；磷脂为大豆磷脂、卵磷脂或合成磷脂。
3.一种灯盏花素脂质体的制备方法，其特征在于经下述步骤制备，1)按重量比取磷脂2-65份与胆固醇1-15份，溶于氯仿和/或甲醇溶剂中，除去溶剂；再加入溶有1份灯盏花素的pH6-8的磷酸盐缓冲液；形成混悬液，匀化；或者2)向pH6-8的磷酸盐缓冲液中通入氮气，按重量比将1份灯盏花素溶于其中，再加入磷脂2-65份，混合乳化，匀化；或者3)按重量比取灯盏花素1份加入pH6-8的磷酸盐缓冲液中，取磷脂2-65份和胆固醇1-15份溶于低极性有机溶剂，混合两液，乳化，除去有机溶媒；或者4)按重量比取磷脂2-65份与胆固醇1-15份溶于低极性有机溶剂，加入pH6-8的磷酸盐缓冲液，混合乳化，除去溶媒。
4.根据权利要求3所述灯盏花素脂质体的制备方法，其特征在于1)按重量比取磷脂30-60份与胆固醇5-10份，溶于氯仿/甲醇混合溶剂中，加热蒸去溶剂；再加入溶有1份灯盏花素的pH6-8的磷酸盐缓冲液；形成混悬液，匀化；或者2)向pH6-8的磷酸盐缓冲液中通入氮气，按重量比将1份灯盏花素溶于其中，再加入磷脂30-60份，混合乳化，匀化；或者3)按重量比取灯盏花素1份加入pH6-8的磷酸盐缓冲液中，取磷脂30-60份和胆固醇5-10份溶于乙醚，混合两液，乳化，除去有机溶媒；或者4)按重量比取磷脂30-60份与胆固醇5-10份溶于乙醚，加入pH6-8的磷酸盐缓冲液，混合乳化，除去溶媒；与含有1份灯盏花素的pH6-8的磷酸盐缓冲液混合。
5.根据权利要求4所述灯盏花素脂质体的制备方法，其特征在于灯盏花素溶于pH6-8的磷酸盐缓冲液时，加入氢氧化钠、磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、半胱氨酸、烟酰胺、苯甲酰胺、脲、硫脲、乙二胺、二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、三乙胺、葡甲胺和/或三羟甲基氨基甲烷。
6.根据权利要求1或2所述灯盏花素脂质体的冻干粉针剂，其特征在于基本由脂质体与右旋糖酐、单糖、双糖和/或多糖组成；右旋糖酐、单糖、双糖和/或多糖的量按磷脂重量比计算，1份磷脂加入0.2-4.0份右旋糖酐、单糖、双糖和/或多糖。
7.根据权利要求6所述灯盏花素脂质体的冻干粉针剂，其特征在于单糖为甘露醇、葡萄糖，双糖为乳糖、蔗糖，多糖为海藻糖，其量按磷脂重量比计算，1份磷脂加入0.5-1.0份。
8.一种灯盏花素脂质体冻干粉针剂的制备方法，其特征在于将权利要求1或2所述灯盏花素脂质体冷却到室温，加入右旋糖酐、单糖、双糖和/或多糖，其量按磷脂的重量比计算，1份磷脂加入0.2-4.0份，过滤后，冷冻干燥。
9.根据权利要求8所述灯盏花素脂质体的冻干粉针剂，其特征在于单糖为甘露醇、葡萄糖，双糖为乳糖、蔗糖，多糖为海藻糖，其量按磷脂重量比计算，1份磷脂加入0.5-1.0。
10.根据权利要求9所述灯盏花素脂质体的冻干粉针剂，其特征在于以任意比例与输液稀释后，包封率为60％～90％，粒径为20nm～1μm。
全文摘要
一种含灯盏花素的脂质体、其脂质体冻干粉针剂及可工业化应用的制备方法，盏花素与磷脂类物质的重量比为1∶2－65份，亦可加入1－15份的胆固醇；按1份磷脂加入0.2－4.0份冻干保护剂的比例，制成冻干粉针剂，既能显著提高贮存稳定性，又能使灯盏花素脂质体冻干粉在加入注射用水重新溶散后，能以任意比例与输液稀释给药而不产生沉淀和降解产物，包封率为60％～90％，粒径为20nm～1μm，生物利用度是普通注射剂的10倍。
文档编号A61P9/00GK1442147SQ0311303
公开日2003年9月17日 申请日期2003年3月24日 优先权日2003年3月24日
发明者平其能, 郭健新, 黄罗生, 吕文莉, 周莉 申请人:中国药科大学