环糊精衍生物的药物用途及其药物组合物的制作方法

专利名称：环糊精衍生物的药物用途及其药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物化学和药物制剂领域，具体而言，本发明涉及环糊精衍生物的新的药物用途及其药物组合物。
背景技术：
在分子水平上模拟酶活性部位的微环境，引入在天然酶中对催化反应起主导作用的因素，设计和合成结构简单、活力稳定的有机分子作为人工模拟酶，是当今自然科学领域中的前沿课题之一。鉴于人工酶分子可能具有与天然酶相同的专一性和催化功能，而本身具有物化性质稳定、原料广泛易得、制备工艺简便等优点，预示着它在化工、酶学、医药学等领域具有广阔的应用前景。为此，美国和许多欧洲国家都把对酶的人工模拟列入未来研究的发展规划。近年来，人们已建立起许多小分子仿酶体系，如环糊精、冠醚、环番，环芳烃和卟啉等。
谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是生物体内重要的含硒酶。它具有优良的抗氧化性，能够有效地清除体内的自由基，因此对治疗和预防心脑血管疾病、糖尿病、肝脏损伤、呼吸系统疾病、风湿与类风湿、皮肤病、肿瘤、白内障等由自由基紊乱诱发的疾病等方面具有很大潜力。但由于该酶不稳定，来源有限，分子量大、易引起人体免疫反应等缺点，极大限制了此酶在医药学方面的开发和应用。而含硒人工酶可克服天然酶的弱点，因此，对此酶进行人工模拟越来越受到科学工作者的重视。被称为“小分子硒酶”的GPX模拟物Ebselen(PZ51)，是人工酶的突出代表，其催化机制及生物学活性已被详细研究过。动物实验表明，PZ51具有广谱抗炎活性，对糖尿病、肿瘤、心血管疾病均有疗效[参见Pamham MJ，Leyck S，GrafE，Dowling EJ.Blake DR，Agents and Actions，1991，324-9；或者Sies H，MasumotoH，Advances in Pharmacology，1997，38229-246]，目前在国外已进入临床试验阶段。但作为药物，PZ51最大缺点是活性较低、水溶性差，为了弥补PZ51的不足，解决GPX小分子模拟物普遍存在的活性低、水溶性差的问题，我们选用环糊精作为酶模型，合成了一系列环糊精衍生物来模拟GPX，我们研究发现，这些环糊精衍生物具有多种药物活性，可以用于治疗多种疾病。

发明内容
因此，本发明的目的是提供了本发明环糊精衍生物用于制备治疗多种疾病的药物的用途；本发明的另一目的是提供了含有本发明环糊精衍生物作为活性成分的药物组合物。
本发明涉及的环糊精衍生物的结构通式如下 其中其母体环糊精结构式如下所示 在本发明中母体环糊精可以是α-环糊情(n＝5)、β-环糊精(n＝6)、γ-环糊精(n＝7)，其结构可用 或 来表示；取代基R1可以是2位或6位，取代基R2也可以是2位或6位，其条件是R1可以是在环糊精不同葡萄糖环的相同取代位上，R2可以是在环糊精不同葡萄糖环的相同取代位上；R1可以是-Se、-Te、-SeCys、-TeCys，其中，Cys表示半胱氨酸，SeCys表示硒代半胱氨酸，TeCys表示碲代半胱氨酸；R2可以-OH、-SeO2H、-TeO2H，其中SeO2H表示亚硒酸，TeO2H表示亚碲酸。
本发明涉及的优选的环糊精衍生物的结构式为 2-SeCD，即2-硒桥联环糊精 6-SeCD，即6-硒桥联环糊精 2-SeCysCD，即2，2′-N，N′-硒代半胱氨酸-硒桥联环糊精 6-SeCysCD，即6，6′-N，N′-硒代半胱氨酸-硒桥联环糊精 2-diSeCD，即2A，2B-二亚硒酸-2A′，2B′-硒桥联环糊精 6-diSeCD，即 6A，6B-二亚硒酸-6A′，6B′-硒桥联环糊精 2-TeCD，即2-碲桥联环糊精 6-TeCD，即6-碲桥联环糊精 2-TeCysCD，即2，2′-N，N′-碲代半胱氨酸-碲桥联环糊精 6-TeCysCD，即6，6′-N，N′-碲代半胱氨酸-碲桥联环糊精 2-diTeCD，即2A，2B-二亚碲酸-2A′，2B′-碲桥联环糊精 6-diTeCD，即6A，6B-二亚碲酸-6A′，6B′-碲桥联环糊精(上面结构式中，n＝5、6、7)其中，CD表示环糊精。
本发明优选使用n＝6的β环糊精；更优选使用，例如，2-Se-β-CD即2-硒桥联-β-环糊精，6-Se-β-CD即6-硒桥联-β-环糊精，2-Te-β-CD即2-碲桥联-β-环糊精，2-diSe-β-CD即2A，2B-二亚硒酸-2A′，2B′-硒桥联-β-环糊精，2-SeCys-β-CD即2，2′-N，N′-硒代半胱氨酸-硒桥联-β-环糊精，6-SeCys-β-CD即6，6′-N，N′-硒代半胱氨酸-硒桥联-β-环糊精，2-diTe-β-CD即2A，2B-二亚碲酸-2A′，2B′-碲桥联-β-环糊精。
我们研究发现，这些环糊精衍生物具有多种药物活性，可以用于治疗多种疾病。
我们通过利用各种药理模型对本发明的环糊精衍生物进行了测试，发现本发明环糊精衍生物具有多种药理活性，可以用于治疗心脑血管疾病、肝脏损伤、糖尿病、白内障、呼吸系统疾病、风湿与类风湿性疾病、皮肤病、肿瘤等由自由基紊乱诱发的疾病。其中心脑血管疾病主要是指心肌缺血、心肌梗塞、心绞痛、心律失常、高血脂、高血压、冠心病、动脉粥样硬化、脑出血、脑梗塞以及其联合症状等；肝脏损伤疾病主要是指酒精肝、各种原因引起的肝纤维化、各型肝炎、脂肪肝等肝病；呼吸系统疾病主要是指由各种原因引起的肺部感染、肺炎、肺气肿、慢性支气管炎、支气管哮喘等呼吸道疾病；皮肤病主要是指白癜风、鱼鳞病、牛皮癣、黄褐斑、红斑狼疮、带状疱疹等常见的皮肤病。
本发明人还发现，可以通过常规技术将本发明的环糊精衍生物与可药用载体或辅料制备药物组合物，这种药物组合物可以采用多种制剂形式，可以是液体制剂、注射剂、颗粒剂、片剂、栓剂、软膏剂、气雾剂、眼用制剂、缓释控释制剂、靶向制剂等。
最佳实施方式下面通过实例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明实例仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明进行简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数。一.制备实例本发明涉及的化合物可以通过下列方法制备。实施例1NaHSe的制备方法将100mg NaBH4溶解在装有5ml水的小瓶中，再将100mg硒粉缓慢加入到NaBH4的溶液中，盖上一插有针头的胶盖，此时可以看到水中产生大量气体，并伴随有热量放出。由于反应过于剧烈，所以需在冰浴中进行，以控制反应速度，其反应方程式如下由于NaBH4与H+反应，还伴有少量H2Se气体产生，为防中毒，必须在通风橱中反应。反应结束后，有大量盐析出。NaHSe极易氧化，故应通入N2保存。实施例22-Se-β-CD(即2-硒桥联β环糊精)的合成合成路线如下所示 (1).β-CD2位磺酰化(产物为β-CD-2-位羟基苯磺酸脂，简称2-OTs-β-CD)将2.0gβ-CD溶于100ml NaOH(0.3mol/L)溶液中，室温滴加含2.0g的p-TsCl的乙腈溶液5ml，滴加过程中不断加入1mol/L NaOH使溶液pH＞12.5，3小时滴加完毕，再搅拌1小时，加入1mol/LHCl中和至中性，加入100ml甲醇，滤去不溶物，减压蒸去甲醇和大部分水至20ml，放入5℃冰箱一周后有盐析出，过滤后以水为洗脱剂经Bio-gel P-2柱层析，收集第一峰，冻干，得产物。(2).2-OTs-β-CD硒化将100mg 2-OTs-β-CD溶于50mM磷酸缓冲液中，通高纯氮去氧，加入100μl 1MNaHSe，60℃反应36小时，然后使反应体系充分暴露在空气中氧化，离心除硒，上清液经Bio-gel P-2柱(5.0×50cm)分离纯化，254nm紫外监测收集第一峰，冻干，用丙酮洗三次，真空烘干得淡黄色粉末标题化合物2-Se-β-CD。实施例36-Se-β-CD(即6-硒硚联β环糊精)合成方法合成路线如下所示 (1).6-对甲苯磺酰-β-环糊精(6-OTs-β-CD)的合成β-CD重结晶后于120℃真空干燥一天，吡啶用KOH回流17小时，再用BaO干燥整夜，用时常压蒸馏。p-TsCl 3.6g，溶解于吡啶10mL，在冰浴条件下缓慢将p-TsCl的吡啶溶液滴加到β-CD的吡啶溶液中27g，160mL，滴加完毕后室温反应24小时。反应完毕用丙酮沉淀，抽滤，固体粉末用水重结晶。最后用乙醚浸泡，产物为棕白色。(2).6-OTs-β-CD硒化及分离纯化将100mg 6-OTs-β-CD溶于1mL 50mM PBS和1mL DMF混合溶液中，通高纯氮去氧，加入100μL 1M NaHSe，60℃反应36小时，然后使反应体系充分暴露在空气中氧化，离心除硒，上清液经Biogel P-2柱分离纯化，254nm紫外监测，收集第一峰，冻干，用丙酮洗三次得淡黄色粉末。P-2柱分离出现三个吸收峰，第一峰为硒桥联β-CD吸收峰(即目标产物峰)，第二峰为单硒氢化β-CD，第三峰为未反应的6-OTs-β-CD和小分子杂质峰。实施例42-Te-β-CD(即2-碲桥联β环糊精)和6-Te-β-CD(即6-碲桥联β环糊精)合成方法(1).6-位-对甲苯磺酰-β-环糊精(6-OTs-β-CD)的合成见实施例3(2).2-位-对甲苯磺酰-β-环糊精(2-OTs-β-CD)的合成见实施例2(3).碲氢化钠(NaTeH)的制备将3.5g碲粉和2g NaBH4加入到70mL无水乙醇中，有气体产生，并伴随有热量放出。通氮气数分钟使体系保持无氧。小火加热回流约1小时，碲粉和NaBH4全部溶解，溶液呈紫红色。冷却至室温，加入4.5mL无氧冰醋酸，加热至沸腾。有黑色沉淀产生，溶液呈无色透明。冷却后，溶液即可使用。(4).6-位-碲桥联β-CD的合成(6-Te-β-CD)将100mg 6-OTs-β-CD溶于0.5mL 50mM PBS(pH7)和0.5mL DMF的混合溶液中，通高纯氮除氧25分钟，加入2mL上述NaHTe溶液，60℃反应36小时后，使反应体系充分暴露在空气中氧化，有黑色沉淀产生，溶液为黄色。6000rpm离心10分钟，黄色溶液经Sephadex G-25(Φ5×A50cm)柱分离纯化，用去离子水作洗脱液，254nm紫外监测，收集第一峰溶液，冻干后用丙酮洗三次，干燥后得浅黄色粉末目标化合物。(5).2-位-碲桥联β-CD的合成(2-％-β-CD)将100mg 2-OTs-β-CD溶于1mL 50mM PBS(pH7)溶液中，通高纯氮去氧25分钟，加入2mL上述NaHTe溶液，60℃反应36小时。然后使反应体系充分暴露在空气中氧化，有黑色沉淀产生，溶液为黄色。6000rpm离心10分钟，黄色溶液经Sephadex G-25(Φ5×A50cm)柱分离纯化，用去离子水作洗脱液，254nm紫外监测，收集第一峰溶液，冻干后用丙酮洗三次，干燥后得浅黄色粉末目标化合物。实施例52-SeCys-β-CD(即2，2′-N，N′-硒代半胱氨酸-硒桥联环糊精-β-环糊精)的合成方法(1).β-CD 2位磺酰化(产物为β-CD-2-位羟基苯磺酸脂，简称2-OTs-β-CD)将2.0g β-CD溶于100ml NaOH(0.3mol/L)溶液中，室温滴加含2.0g p-TsCl的乙腈溶液5ml，滴加过程中不断加入1mol/L NaOH使溶液pH＞12.5，3h滴加完毕再搅拌1h，加入1mol/L HCl中和至中性，加入100ml甲醇，滤去不溶物，减压蒸去甲醇和大部分水至20ml，放入5℃冰箱一周后有盐析出，过滤后以水为洗脱剂经Bio-gel P-2柱层析，收集第一峰，冻干，得产物。(2).2-碘-β-环糊精(2-I-β-CD)的合成DMF用五氧化二磷干燥数天，用时减压蒸馏。2-OTs-β-CD 8.5g溶于DMF(50mL)，然后加入KI(6.8g)，反应液中通入N2以排除O2。在密封条件下，于80-90℃剧烈搅拌反应8个小时。反应完毕加入三氯甲烷沉淀碘代β-CD，抽滤，将固体用水溶解，加入四氯乙烯后沉淀，收集固体。(3).2，2′-N，N′-硒代半胱氨酸-硒桥联-β-环糊精的合成(2-SeCys-β-CD)SeCyss(硒代胱氨酸)14mg溶于6mL水，然后加入17mg Na2CO3，再将此溶液加到2-I-β-CD的DMF溶液510mg，于65℃在无氧条件下反应20小时。反应物处理在空气中氧化，离心，上清液经Sephadex G-25(Φ5×A50cm)柱层析，收集第一峰，冻干，冻干粉为淡黄色目标化合物。实施例66-diTe-β-CD(即6A，6B-二亚碲酸-6A′，6B′-碲桥联β环糊精)合成方法(1).6A，6B-帽连-β-CD(即6A，6B-Capped-β-CD)的合成β-环糊精7.0g溶于50mL吡啶。1，3-间苯磺酰氯的吡啶溶液1.28g，缓慢于室温下滴加到β-CD的溶液中，剧烈搅拌下室温反应20小时。反应完毕，减压蒸馏，用丙酮浸泡整夜，抽滤，在真空下干燥。粗产物8g加入到50mL H2O-乙醇(3∶2)，滤掉不溶物，在搅拌下逐滴滴加700mL CH3CN-H2O(6∶1)，滤掉白色沉淀，滤液减压蒸馏。终产物溶于60mL 20％的乙醇水溶液，加入50mL DEAE-52，室温搅拌0.5小时，过滤，滤液减压蒸馏，得到白棕色产品。(2).合成6A，6B-二亚碲酸-6A′，6B′-磅桥联-β-环糊精(6-diTe-β-CD)6A，6B-Capped-β-CD(100mg)溶于1mL的50mM pH7.0的磷酸缓冲液，加入1mLDMF促溶。反应混合液通氮气20分钟以排除氧气，密闭。然后用注射器加入100μLNaHTe溶液，在氮气保护下，于60℃反应36小时。在空气中氧化，离心，上清液经Sephadex G-25柱纯化，有三个峰出现，收集第一峰，冻干，冻干粉为淡黄色目标化合物。实施例76-SeCys-β-CD(6，6′-N，N′-硒代半胱氨酸-硒桥联-β-环糊精)的合成方法(1).6-对甲苯磺酰β-环糊精(6-OTs-β-CD)的合成
β-CD重结晶后于120℃真空干燥一天。吡啶用KOH回流17小时，再用BaO干燥整夜，用时常压蒸馏。p-TsC l3.6g，溶解于吡啶10mL，在冰浴条件下缓慢将p-TsCl的吡啶溶液滴加到β-CD的吡啶溶液中27g，160mL，滴加完毕后室温反应24小时。反应完毕用丙酮沉淀，抽滤，固体粉末用水重结晶。最后用乙醚浸泡，产物为棕白色。(2).6-碘-β-环糊精(6-I-β-CD)的合成DMF用五氧化二磷干燥数天，用时减压蒸馏。6-OTs-β-CD 8.5g溶于DMF(50mL)，然后加入KI(6.8g)，反应液中通入N2以排除O2。在密封条件下，于80-90℃剧烈搅拌反应4个小时。反应完毕加入三氯甲烷沉淀碘代β-CD，抽滤，将固体用水溶解，加入四氯乙烯后沉淀，收集固体。(3).6，6′-N，N′-硒代半胱氨酸-硒桥联-β-环糊精的合成(6-SeCys-β-CD)SeCyss(10mg，0.03mmol)溶于4mL水，然后加入13mg(0.12mmol)Na2CO3，再将此溶液加到6-I-β-CD的DMF溶液(400mg，32mmol)，于65℃在无氧条件下反应20小时。反应物处理在空气中氧化，离心，上清液经Sephadex G-25(Φ5×A50cm)柱层析，收集第一峰，冻干，冻干粉为淡黄色目标化合物。实施例86-diSe-β-CD(6A，6B-二亚硒酸-6A′，6B′-硒桥联β环糊精)合成方法(1).合成6A，6B-二亚硒酸-6A′，6B′-硒桥联-β-环糊精(6-diSe-β-CD)6A，6B-Capped-β-CD(100mg)溶于1mL的50mM pH7.0的磷酸缓冲液，加入1mL DMF促溶。反应混合液通氮气20分钟以排除氧气，密闭。然后用注射器加入100μL NaHSe溶液，在氮气保护下，于60℃反应36小时。在空气中氧化，离心，上清液经SephadexG-25柱纯化，有三个峰出现，收集第一峰，冻干，冻干粉为淡黄色目标化合物。二.药效试验药效试验(一)1名称治疗缺血再灌注引起的损伤(以2-Se-β-CD为例说明)2方法2.1动物分组及模型建立48只健康家兔(雌雄兼有)，体重1.5～2.1kg，随机将动物分成3组，即对照组、模型组和给药组。按Pussinell′s四血管结扎法制造家兔脑急性完全性缺血再灌注模型。模型组和给药组均缺血20min，再灌注180min。但给药组缺血20min后，于再灌注10min时，经股静脉注射2-Se-β-CD溶液1ml/kg，继续再灌170min。对照组只进行血管分离，不进行缺血和再灌注处理。各组于180min后立即开颅取枕顶皮层标本，制备10％的组织匀浆，用Lowry法测定蛋白质含量。2.2测定指标脑组织过氧化氢酶的活性测定，乳酸含量测定，Ca2+-ATPase活性检测。3 结果见下表1

本实验结果显示，采用了Pussinell′s四血管结扎法制造家兔脑急性完全性缺血再灌注模型，模型组的过氧化氢酶和Ca2+-ATPase活性较对照组均有极显著性降+低，(与对照组相比)而乳酸含量则明显升高；同时过氧化氢酶与乳酶比值和Ca2+-ATPase与乳酸比值均有极明显下降(与对照组相比)。说明在缺血再灌期，由于神经细胞缺血缺氧产生大量的自由基，消耗掉大量的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)，造成细胞清除自由基、H2O2的能力下降，末被及时清除的氧自由基可攻击生物膜上多不饱和脂肪酸，使之发生脂质过氧化反应，使膜的抗损伤和自身稳定性下降，引起膜流动性和完整性等破坏，进而影响膜的功能和结构。因此使脂膜上Na&mdash；K+-ATPase和Ca2+-ATPase功能活动受到影响，Na+泵和Ca2+泵机制障碍，细胞内Na+和Ca2+积聚，而导致脑细胞水肿和Ca2+过载性脑损伤，以致最后死亡。
给药组过氧化氢酶、Ca2+-ATPase活性明显高于模型组，乳酸含量低于模型组。过氧化氢酶和Ca2+-ATPase与乳酸比值均显著高于模型组。说明(1)2-Se-β-CD能有效地维持缺血再灌注大脑的GPX活性，它能直接抑制大脑MDA生成减少，GPX的消耗，刺激过氧化氢酶活性代偿性增高所致，从而减轻了缺血脑组织的脂质过氧化反应；(2)2-Se-β-CD能通过改善缺血组织代谢和缺氧状况，减少乳酸生成，从而减轻脑组织代谢性酸中毒；(3)2-Se-β-CD通过减轻缺血脑组织过氧化反应，减轻了缺氧及酸中毒。因此在一定程度上保护了细胞膜的完整性，以致明显改善了质膜上Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性，恢复Na+泵和Ca2+泵的正常转运，从而减轻脑细胞水肿和Ca2+超载，以达到对缺血再灌注损伤大脑的积极保护作用。4结论2-Se-β-CD能较好冶疗心肌缺血、心肌梗塞、动脉粥样硬化等心脑血管疾病。药效试验(二)1名称治疗脑卒中(以6-Se-β-CD为例说明)2方法2.1动物分组及模型建立由美国NIH引进，在中国北京阜外心血管病医院动物科繁殖的第38代SHRsp，种鼠饲育在屏障环境中，实验大鼠笼养，每笼6只，光照12小时/日，室温为23±2℃，相对温度为50±10％。用北京实验动物中心生产的实验动物大鼠配合饲料喂养。取104只大鼠，雌雄各半。自八周龄开始自由饮用1.0％盐水(浓度逐渐增加，最高到1.5％)，以加速高血压发展和脑卒中发生。每日至少观察大鼠两次，待出现脑卒中症状，给与评分并随机分组，开始用药灌胃治疗，疗程2周。治疗结束后继续观察10天，存活大鼠断头处死。①A组(6-Se-β-CD小剂量治疗组)16.05mg/kg②B组(6-Se-β-CD中剂量治疗组)160.5mg/kg③C组(6-Se-β-CD大剂量治疗组)1605mg/kg④D组(对照组)溶媒(蒸馏水)对照。每日上午9时称重、评分，按体重调整药量灌胃治疗。2.2测定指标(1)SBP实验前及后第4周用尾套法各测一次收缩压(SBP)。
(2)心率实验前及后第4周各测一次心率。(测血压同时测心率)(3)体重实验前及后每周称重2次。给药后每天称重，以计算喂药剂量。
(4)脑卒中临床表现评分大鼠出现脑卒中临床症状及体征，每日按本评分标准予以评分记录，每天上午一次。统计治疗后各组脑卒中表现最高分和累积平均分数平均值。大鼠脑卒中评分标准如下0——正常1——(活动少)运动量轻度减少，或轻度兴奋。
2——(活动很少)运动量明显减少，或激惹性亢进。
3——(俯卧不动)不能步行，忧郁性症状。
4——不能站立，肢体麻痹(瘫痪)，任何一侧体肢瘫痪。
(5)生存天数记录每组大鼠卒中治疗期间存活天数。如大鼠发生脑卒中后临床病情严重、全身极度衰竭则断头处死并分离脑组织及心脏。
(6)脏器官称重及脑卒中病理检查取自然死亡或断头处死大鼠的心脏和脑组织，分别称重并计算心、脑组织重量比值。器官重量比值＝(器官重量/体重)×1000(7)脑卒中病理检查脑卒中包括脑梗塞、脑出血及联合病变(梗塞+出血)。将脑组织固定于10％福尔马林溶液中，每个脑组织切成6片，经HE染色处理，光镜下进行脑卒中病理观察。
(8)脑组织透射电镜检查每组3只大鼠取左侧大脑组织约0.3mm×0.3mm×0.3mm，立即固定在2.5％的戊二醛内，在经1％的锇酸充分固定后，酒精逐级脱水，EPON812环氧树脂包埋，KLB超薄切片机切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后，日立H-600透射电镜观察照相。
(9)颈总动脉扫描电镜检测取右颈动脉1cm左右，立即固定在2.5％的戊二醛内，在经1％的锇酸充分固定后，酒精逐级脱水，醋酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，IB-3型离子溅射仪度金后，日立S-520扫描电镜观察照相。3 结果见下表2

3.1脑组织电镜透射检查结果A组神经细胞核染色质轻度凝聚，胞浆内线粒体肿胀，有的嵴紊乱，内质网轻度扩张，有的细胞质和核轻度疏松。B组神经细胞核质均匀，核膜呈连续的双层结构，胞浆内线粒体轻度肿胀，内质网轻度扩张，有的细胞在胞浆内可见到较多的溶酶体，神经细胞胞浆内细胞器较多。C组神经细胞核染色质有的较均匀，有的核染色质脱失，胞浆内细胞器较多，线粒体轻度肿胀，嵴紊乱，内质网大致正常。D组神经细胞核有的固缩，核膜消失，有的核染色质凝聚，有的核染色质脱失，核膜失去连续结构。胞浆内的线粒体有的明显肿胀，嵴消失，有的嵴紊乱，内质网高度扩张。3.2颈动脉电镜扫描结果A组血管内皮细胞排列大致正常，个别内皮细胞轻度受损，有的内皮细胞表面可见到火山口样结构。B组血管内皮细胞排列有序，形状大致正常，内皮细胞表面的微绒毛清晰可见，内皮细胞很少粘附有血小板和红细胞。C组血管内皮细胞排列大致正常，个别内皮细胞轻度受损，表面可见到火山口样结构。内皮细胞表面的微绒毛可见，内皮细胞未见到有较多的红细胞和血小板粘附。D组有的血管内皮细胞严重受损，失去细胞的正常形态，内皮细胞失去正常的排序结构，受损的内皮细胞表面粘附有红细胞和血小板，有的部位内皮细胞有轻度受损脱落，有的内皮细胞表面可见到火山口样结构。3.3体重变化见下表3

SHRsp是从SHR品系培育的一种药亚系，是遗传性卒中易感型自发性高血压大鼠，100％发生高血压，成年鼠收缩压达230mmHg以上；80％发生脑卒中，包括脑梗塞、脑出血及联合病变(脑梗塞+脑出血)。SHRsp是高血压卒中实验的最佳模型。SHRsp脑的主要病理学表现是脑内小动脉壁有纤维样坏死，管腔常有血栓伴管腔闭塞，也常见有微动脉瘤。损害多见于皮质，也见于小脑和基底神经节。
本实验结果表明A、B、C、D四组大鼠基础脑卒中表现分数相似，说明组间基础数据是可比的。光镜病理说明四组大鼠脑卒中病理特性，是脑卒中实验的良好大鼠模型A、B、C三组联合病变(69.2％，53.8％，84.6％)较D组(100％)少，表明6-Se-β-CD的治疗可以减轻大鼠脑卒中病变的程度。
6-Se-β-CD治疗2周A、B、C组脑卒中临床表现评分分数均较D组低，其中B、C组与D组比较差异明显，6-Se-β-CD治疗可以减轻的症状和体征。
脑卒中发生后生存天数A、B、C组均高于D组，C与D组比较差异明显，表明6-Se-β-CD的治疗可延长卒中大鼠的生存期。
脑组织电镜检查提示A、B、C组脑神经细胞损害较轻。颈动脉组织电镀检查提示A、B、C组血管内皮细胞受损轻于D组。组织电镜检查说明6-Se-β-CD治疗可减轻脑组织和颈动脉组织的损害，对神经细胞和血管内皮细胞有保护作用。
本实验结果表明，6-Se-β-CD对SHRsp脑卒中有一定的治疗效果，可减少脑卒中临床表现评分分数，减轻脑组织和颈动脉内皮细胞的损害。4 结论6-Se-β-CD可以治疗脑出血、脑梗塞以及其联合症状等脑血管疾病。药效试验(三)1 名称治疗高脂血症(2-Se-β-CD)2 方法2.1 动物分组、模型建立及指标测定将大鼠随机分为2-Se-β-CD大小剂量治疗组(500mg/kg、100mg/kg)及模型组。每组20只，各组均喂高脂饲料10天(1％胆固醇加10％猪油加0.25％甲亢平加88.75％基础饲料)，每天灌胃给药1次；模型组给予0.5％羧甲纤维素纳液。在末次给药后1小时，处死动物取血，用琼脂糖凝胶电泳法测定血清中总胆固醇(TC)及低密度脂蛋白(LDL)含量，推算高密度脂蛋白(HDL)水平。3 结果见下表4

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实验证实LDL的浓度与冠心病的形成有着密切的联系，降低血清中高胆固醇水平，可以延缓动脉粥样硬化的发展。实验采用琼脂糖凝胶电泳法测定了高脂大鼠血清TC及LDL。结果表明，2-Se-β-CD能明显降低食饵性高脂血症大鼠的血脂水平。4 结论2-Se-β-CD可以治疗高血脂，高血压、冠心病等心脑血管疾病。药效试验(四)1 名称治疗酒精性肝损伤(以2-Te-β-CD为例说明)2 方法2.1 动物分组及模型建立2.1.1 肝脏脂质过氧化物(LPO)、谷胱甘肽(GSH)的测定小鼠92只随机分为正常组20只，模型组24只，2-Te-β-CD大、小剂量组各24只，各组小鼠于实验环境中用普通饲料喂养3天。禁食12小时后，大、小剂量组分别给予2-Te-β-CD 500mg/kg体重和100mg/kg体重，正常组和模型组以等体积的生理盐水灌胃。1小时后，除正常组外，各观察组给予56°白酒16ml/kg体重，正常组灌胃等体积的10％葡萄糖溶液。给白酒6小时后，断头处死小鼠，取出肝脏，在冰浴下制备20％的肝匀浆，测定肝LPO、肝GSH。2.1.2 肝线粒体膜流动性、线粒体膨胀抑制百分率的测定小鼠90只随机分为正常组、模型组和治疗组，每组30只。各组动物于实验环境普通饲料喂养3天。实验时于每日上午治疗组小鼠灌胃2-Te-β-CD 250mg/kg体重；正常组和模型组小鼠灌胃等体积的生理盐水。4小时后，给模型组和治疗组小鼠灌胃56°白酒16ml/kg体重，正常组小鼠灌胃等体积的10％葡萄糖溶液。第3天给酒后5小时处死动物，取出肝脏，低温冷冻保存。2.2测定指标2.2.1肝脏LPO测定以硫代巴比妥酸法。2.2.2肝脏GSH测定采用5，5′-二巯基-双硝基苯甲酸法。2.2.3肝线粒体膜流动性测定常规制备小鼠肝线粒体，用Lowry法测定线粒体蛋白质含量，标准品为牛血清白蛋白。分别测定各样本荧光偏振度(P)(荧光分光光度计激发波长362nm，发射波长432nm)，按Perrin公式计算微粘度(η)值，该值增加表示膜的流动性降低。2.2.4肝线粒体膨胀水平测定将新鲜鼠肝线粒体加入盛有介质的试管中，各管蛋白含量均为0.5mg/ml，反应总体积为3.0ml。充分混匀，以紫外/可见分光光度计(波长540nm)测定各管浊度。然后，每管加入表面活性剂Triton X-100 0.1ml，2分钟后在上述同等条件下比色，测得光密度值。比较加入表面活性剂前后的差异，观察药物对线粒体膨胀的影响，以抑制百分率表示。3结果3.1肝脏LPO、GSH变化下面的表5示，实验动物一次大量饮酒后，肝脏LPO含量明显升高，而预先给予2-Te-β-CD(大、小剂量组)可使肝脏LPO含量下降。说明2-Te-β-CD可抑制酒精引起的肝脏脂质过氧化反应。小鼠灌胃白酒后，肝脏GSH含量明显下降，2-Te-β-CD两个剂量组肝脏GSH含量显著高于模型组，表明2-Te-β-CD可阻止酒精所致的肝脏GSH的耗竭。表5 各组实验动物肝脏LPO、GSH含量比较(x±s)

3.2肝线粒体膜流动性、线粒体膨胀水平分析小鼠连续3天灌胃白酒后，其肝线粒体膜的荧光偏振度及相应的微粘度均有明显提高，2-Te-β-CD治疗组的P及相应的η值比模型组明显降低，表明2-Te-β-CD能够抑制酒精引起的肝线粒体膜流动性升高。见表6。表6 肝线粒体膜P、η及线粒体膨胀抑制百分率比较

表6同时显示，模型组肝线粒体明显肿胀，其抑制百分率明显降低，2-Te-β-CD治疗组线粒体肿胀得到明显抑制，其抑制百分率与模型组相比明显升高，表明2-Te-β-CD可抑制酒精中毒小鼠肝线粒体肿胀。3.3 2-Te-β-CD能够抵抗酒精引起的肝脏脂质过氧化损伤急性酒精中毒会导致肝损伤，其损伤机制之一是通过激活氧分子产生氧自由基，导致肝细胞膜脂质过氧化反应引起肝细胞损伤。LPO在酒精性肝病发病机制中占重要地位。体内依赖于还原型GSH的抗氧化系统能够低抗酒精所致肝损伤作用。
本实验结果显示酒精可引起肝脏脂质过氧化反应，而预先给予2-Te-β-CD则可显著抑制酒精导致的肝脏LPO含量增加。表明2-Te-β-CD可对抗酒精所致的肝脏脂质过氧化反应，减轻酒精对肝细胞的损害。肝脏GSH含量变化显示，酒精可导致肝脏脂质过氧化损伤而引起GSH的耗竭，预先给予2-Te-β-CD可阻抑肝脏GSH的下降。
可以认为，2-Te-β-CD对酒精性肝损伤有明显保护作用。其作用机理是减轻酒精对肝脏的脂质过氧化损伤反应，提高机体的抗氧化能力。从而清除酒精在肝脏产生的自由基而稳定肝细胞膜的结构，也可能通过减少自由基与膜脂质和膜蛋白共价结合而减轻酒精的肝毒性反应。3.4 2-Te-β-CD能够保护酒精中毒状态下肝线粒体结构与功能的完整性生物膜在生命活动中具有重要意义。线粒体膜的流动性与膜的各种重要功能如能量转换、物质运送、信息传递等密切相关。本实验结果显示，酒精中毒可使肝线粒体膜的流动性发生变化，致肝线粒体膜的流动性降低，从而影响线粒体的能量(ATP)代谢和耗氧功能；2-Te-β-CD能够对抗酒精中毒引起的肝线粒体膜流动性的改变，增强肝线粒体膜流动性，保护线粒体结构和功能的完整性。
线粒体肿胀是常见的病理变化，是由于水分进入线粒体所致，可由多种病理因素如缺氧、中毒等引发。在电子显微镜下观察，酒精性肝损伤时，肝线粒体可发生明显肿胀。本实验用表面活性剂Triton X-100诱导肝线粒体膨胀，发现模型组肝线粒体明显肿胀，显示酒精对Triton X-100诱导的线粒体肿胀有协同作用。2-Te-β-CD可明显抑制酒精中毒所致的线粒体肿胀，其抑制百分率显著高于模型组，也高于正常组。说明2-Te-β-CD不仅能够对抗酒精中毒引起的线粒体肿胀，而且对Triton X-100诱导的正常肝细胞线粒体肿胀也有一定的抑制作用，从而维持线粒体的正常功能。
超氧阴离子是自由基反应的启动者，在过渡元素存在下，迅速转化为羟自由基。羟自由基可直接参与线粒体膜多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的链锁反应，破坏膜脂的结构，其终产物是小分子醛类、氢过氧化物和烷烃气等。上述产物又可诱发线粒体膨胀，改变膜的流动性和ATP酶活性，这些变化都是破坏线粒体结构与功能完整的因素。2-Te-β-CD对肝线粒体结构和功能的保护作用与其抗肝脏脂质过氧化反应有密切关系。4 结论2-Te-β-CD不仅可以解除醉酒患者的痛苦，而且对酒精性肝损伤具有良好的保护功能，因此，2-Te-β-CD可以作为很好的治疗酒精肝损伤的药物。药效试验(五)1名称治疗肝纤维化(以2-diSe-β-CD为例说明)2方法2.1动物分组及模型建立健康Wistar大鼠80只，5月～6月龄，雌雄兼有，体重190g～230g。雌雄分笼混养，自由饮食，观察1周后用于实验。将大白鼠随机分成正常组、模型组和2-diSe-β-CD大(治疗组1)、小(治疗组2)量治疗组，每组各20只动物。后3组参照猪血清注射法复制肝纤维化动物模型猪血清0.5ml，1次/周；8周，治疗组的大、小剂量组分别给予2-diSe-β-CD 500mg/kg体重和100mg/kg体重，4周。12周后，各组动物同时取材。戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉，剖开胸部，经心脏取血5ml，剖腹，取肝脏。2.2测定指标2.2.1肝功能检测采用常规分析法测定谷丙转氨酶(ALT)，尿素氮(BUN)，白球蛋白比值(A/G)。2.2.2血清LN，HA含量测定采用免疫分析法。2.2.3 MDA和SOD的测定按照试剂盒规定操作。2.2.4肝组织间质细胞计数。2.2.5肝组织胶原纤维定量分析采用面数密度测量法。
统计学处理经方差齐性检验后，采用方差分析进行统计学处理。3结果猪血清诱导的肝损伤大鼠与正常组大鼠相比，在实验期间毛发光泽、一般状态良好，饮食，饮水无异常波动，4周后体重增长速度较正常组缓慢，而且少数动物尿色偏黄。3.1血清生化3.1.1肝功能变化模型组ALT值显著高于正常对照组，A/G值显著低于正常组，BUN含量高于正常组。治疗组与正常组无明显差异，与模型组具有显著性差异(表7)。3.1.2血清LN，HA含量变化模型组LN，HA含量明显高于其他组，治疗组与正常组之间无显著性差异(表7)。3.1.3血清中SOD活性和MDA含量的变化模型组与正常组相比SOD活性和MDA含量均有显著性差异；治疗组大鼠血清中SOD活性明显高于模型组，MDA含量低于模型组；而与正常组相比则无明显差异；2-diSe-β-CD治疗组组间无显著性差异(表7)。表7 各组大鼠血清生化检测结果(x±s，n＝13)

*P＜0.01；**P＜0.05 vs模型组当各种致病因素引起肝细胞病变时，肝细胞膜出现不同程度的损伤，影响膜的形态与正常生理功能，严重时导致细胞部分或全部膜溶解，内容物向外释放，如肝炎病变中，血清中ALT酶活性升高是细胞膜损伤的结果。本研究实验对照在组光镜下，肝细胞可见变性、坏死、细胞膜破裂，血清学检测ALT酶活性增高，BUN升高，清蛋白合成减少，球蛋白合成增高，即A/G比值降低，在电镜下线粒体内膜出现部分溶解或成为单层膜，且数量减少，内质网扩张呈不规则泡状，粗面内质网有脱颗粒现象。而2-diSe-β-CD治疗细在光镜下肝细胞基本正常，血清学检测ALT，BUN，A/G与正常组比无明显差别。在电镜下肝细胞膜、线粒体膜结构完整，基本与正常组相一致，粗面内质网大都平行排列，线粒体数量增加，说明2-diSe-β-CD有保护膜结构的功能。实验结果表明，2-diSe-β-CD可以加速清除自由基，阻止自由基对组织细胞膜中不饱和脂肪酸的链锁反应，延缓组织细胞膜老化和损伤。因此2-diSe-β-CD对细胞膜结构有保护作用。
肝脏是生物转化和能量代谢的重要场所，而线粒体和内质网是这一过程中最重要的细胞器；线粒体内膜完整及其两侧的电化学势是完成氧化磷酸化的基本前提，内膜的特性是对物质交换选择性很强。因此正常内膜是整个线粒体结构和功能的保证。本实验模型组亚细胞结构上发生多方面的病理改变，如线粒体膜出现部分溶解、破裂、内膜消失、体积增大，嵴消失或减少、电子密度降低等等，随之表现为肝功能障碍、自由基增多等(表7)，说明模型组肝细胞内生物代谢发生障碍，而治疗组和正常组基本一致，说明2-diSe-β-CD在保护细胞膜结构的同时也起到了调节代谢的作用。3.2肝脏病理学3.2.1光镜观察①肝细胞和肝小叶的形态变化正常大鼠肝因间质成分较少，肝小叶分界不清。HE染色肝细胞排列呈索状，围绕中央静脉呈放射状排列，肝细胞呈多边形，边界不十分清晰，核1～2个呈圆形，嗜碱性，位于细胞中央，细胞质微嗜酸性。Mallory染色肝细胞核呈蓝色，细胞质微黄色。间质胶原纤维呈蓝色，正常肝组织胶原纤维很少。实验对照组HE染色可见肝细胞变性，细胞质中有大量空泡，有的肝细胞质膜破裂，肝细胞变性坏死。Mallory染色局部增生的胶原纤维组成粗大的兰色纤维束，纵横交错，使肝内有类假小叶样结构形成，胶原纤维面数密度远远多于其他各组(表8)。2-diSe-β-CD治疗1，2组肝细胞结构清晰，小叶分界不清，中央静脉和汇管区内胶原纤维较实验对照组少，治疗2组胶原纤维面数密度与正常组接近，治疗1组胶原纤维面数密度与正常组比较则较高并有显著性差异(表8)。②间质细胞及基质正常对照组肝内间质细胞(库氏细胞、贮脂细胞、窦内皮细胞等)细胞核较小，分散在血窦处及汇管区，数目较少；实验对照组间质细胞数目明显增多；而2-diSe-β-CD组间质细胞数明显低于实验对照组。结果(表8)。表8肝组织间质细胞数和胶原纤维面数密度(x±s，n＝13)

*P＜0.01，vs模型组。3.2.2电镜观察①肝细胞正常组肝细胞周边圆滑，核膜清晰，核周间隙均匀，常染色质呈絮状，异染色质相对较少，呈斑块状，核仁可见，胞质分布均匀；线粒体呈圆形或椭圆形，较均匀分布于胞质内，数量较多，基质电子密度中等，由双层单位膜包绕，嵴突入线粒体内与表面垂直；粗面内质网(RER)亦较丰富，网腔较狭窄，电子密度低，存在于核周和血窦面，一般多弯曲平行排列；滑面内质网(SER)呈泡状，数量较少，多分布在胆小管周围胞质内；核糖体及糖原颗粒也明显面有相邻肝细胞可见；肝细胞血窦面有丰富的指状微绒毛；伸入Disse间隙；肝细胞胆小管膜特化形成的胆小管及管周连结复合体，小管腔面有丰富的微绒毛。
模型组肝细胞质膜或胞质均有不同程度的损伤性超微结构变化。轻者细胞器减少，胞质内脂滴增多，线粒体局部膜断裂或变为单层膜，嵴减少，基质电子密度降低，胞核周边呈锯齿状，异染色质增多，核周隙加宽；重者细胞核染色质溶解，胞质内细胞器消失，粗面内质网扩张呈不规则泡状、脱颗粒。2-diSe-β-CD治疗1组大部分肝细胞超微结构变化不显著，小部分肝细胞质内脂滴正常组多。2-diSe-β-CD治疗2组肝细胞超微结构与正常组无明显差异。②间质正常组鼠肝血窦内皮细胞核内异染色质较多，胞质少，电子密度低，细胞器不发达；库氏细胞的胞质内有丰富的初、次级溶酶体；贮脂细胞核不规则，异染色质多，电子密度高，胞质亦较少，胞质内有1～2个脂滴，细胞器不发达。模型组血窦内皮细胞超微结构变化不明显，胞质中次级溶酶体及线粒体增多；贮脂细胞增多，胞体变大，并且细胞器增多，可见内质网、线粒体等；浆细胞样细胞增多，其胞核结构典型，胞质有丰富的粗面内质网，基质内有较多的带有周期性横纹的胶原原纤维，它们聚集组成粗大的胶原纤维束，即在光学显微镜下经Mallory氏染色后为蓝色条索。细胞溶酶体等细胞器与正常组无明显差异；浆细胞样间质细胞较少或消失；贮脂细胞形态多样，有的胞体较小，和正常组相比无明显差异，有的胞体较大，胞质电子密度低，细胞器散在于胞质中。治疗组基质内仍可见少量胶原纤维束，但与模型组相比减少或仅为细束。
间质细胞包括窦内皮细胞、库氏细胞、各类淋巴细胞和贮脂细胞，活化的贮脂细胞在肝纤维化的发生和发展过程中起着关键性作用。本实验Mallory染色模型组汇管区周围、小叶间，可见增生的胶原纤维，2-diSe-β-CD治疗组肝脏结构基本正常，未见胶原纤维的增生。HE染色模型组汇管区周围出现较多的淋巴细胞及浆细胞等炎性细胞浸润，小叶内也可看到明显的间质增多；治疗组间质细胞增生不明显。间质细胞计数分析，模型组和治疗组之间有显著性差异，治疗组与正常对照组差异不明显。电镜下模型组可以看到胶原原纤维和胶原纤维束，治疗组和正常组纤维束不明显，因此2-diSe-β-CD具有抑制间质细胞增生和防治肝纤维化的作用。4结论2-diSe-β-CD能够保护肝细胞，有治疗和预防肝纤维化的作用。药效试验(六)1名称治疗类风湿性关节炎(以2-Se-β-CD为例说明)2方法2.1动物分组、模型建立及指标测定2.1.1 2-Se-β-CD对大鼠佐剂性关节炎原发病变的影响大鼠60只，随机分为3组，每组20只。将Feund’s完全佐剂0.1ml皮内注射右后足跖内，注射佐剂致炎前1小时给药。(1)模型组相同体积的溶媒(20％的丙二醇5ml/kg)；(2)2-Se-β-CD 500mg/kg，(3)2-Se-β-CD 100mg/kg。致炎前及致炎后18小时使用窄带尺测量关节周长(mm)，以给佐剂注射侧(右后足)肿胀度作为指标，观察其对18小时佐剂原发病变的影响。2.1.2 2-Se-β-CD对大鼠佐剂性关节继发病变的预防作用大鼠60只，随机分3组，每组20只。分别在给予佐剂注射后7天开始给药，剂量与原发病变相同，每天1次，连续一周。观察左后足(佐剂注射对侧)的肿胀度、前肢关节红肿度、耳部红斑及尾部结节等出现情况。全身病变按五级评分法0无红肿；1小趾关节稍肿；2趾关节和足跖关节肿胀；3踝关节以下足肿胀；4包括踝关节在内全部足肿胀。2.1.3 2-Se-β-CD对大鼠佐剂性关节继发病变的治疗作用大鼠60只，174±16g，随机分3组，每组20只。分别在给予佐剂注射后18天继发病变全部形成后开始给药。剂量与原发病变相同，每天1次，连续12天观察左后足(佐剂注射对侧)的肿胀度、前肢、耳部及尾部病变的严重程度。全身病变也按前述五级评分法表示。3结果见下面的表9-1、9-2和9-33.1 2-Se-β-CD对大鼠佐剂性关节炎原发病变的影响表9-1

3.2 2-Se-β-CD对大鼠佐剂性关节继发病变的预防作用表9-2

2-Se-β-CD 100～500mg/kg对大鼠佐剂性关节继发病变具有明显预防作用，能够使左后足的关节肿胀度明显减轻，且大鼠前肢红肿、耳部红斑及尾部小结节等全身病损均比对照组明显减轻。3.3 2-Se-β-CD对大鼠佐剂性关节继发病变的治疗作用表9-3

2-Se-β-CD 100～500mg/kg对大鼠佐剂性关节继发病变具有明显治疗效果，左后足(注射佐剂对侧)的关节肿胀度明显消退，并使再度肿胀的程度逐渐下降。大鼠前肢红肿、耳部红斑及尾部小结节等全身病损均比对照组明显减轻。4结论2-Se-β-CD可以用于治疗风湿性类风湿性关节炎以及其他炎症。药效式验(七)1名称治疗糖尿病(以2-SeCys-β-CD为例说明)2方法2.1动物分组、模型建立及指标测定2.1.1对正常小鼠血糖的影响取小鼠随机分成3组，给药组分别2-SeCys-β-CD100、50mg/kg；正常组喂生理盐水，连续4天，在末次给药前动物禁食2小时，给药后3小时眼眶后静脉丛取血，用葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖含量。2.1.2对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影响取正常小鼠80只，雄性，随机取20只为正常组，其余尾给溶有四氧密啶的生理盐水100mg/kg，造成糖尿病模型，注射前禁食12小时，注射后48小时眼眶取血测血糖，选血糖16.67mmol/L以上者用于实验，均匀分组。给药组分别2-SeCys-β-CD 100、500mg/kg，连续4天，末次给药后1小时取血测血糖。2.1.3对肾上腺素引起小鼠血血糖升高的影响取小鼠随机分为正常组、肾上腺素对照组及肾上腺素加试药组，给药组分别2-SeCys-β-CD 100、500mg/kg，连续4天，末次给药1小时后，除正常对照组外，给肾上腺素0.3mg/kg，30分钟后取血测血糖。3结果见下面的表10-1、10-2和10-33.1 2-SeCys-β-CD对正常小鼠血糖的影响表10-1

与正常组比较*P＜0.05。
结果表明2-SeCys-β-CD 100mg/kg和500mg/kg连续给药4天后血糖水平与正常组比较未见明显变化。3.2 2-SeCys-β-CD对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影响表10-2

与正常组较##P＜0.01，与模型组较*P＜0.05，**P＜0.01。
结果表明2-SeCys-β-CD 100mg/kg×4天和500mg/kg×4天能显著降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖。3.3 2-SeCys-β-CD对肾上腺素引起小鼠血糖升高的影响表10-3

与正常组比较##P＜0.01，与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
结果表明肾上腺素引起血糖明显升高，2-SeCys-β-CD 100mg/kg，500mg/kg连续给药4天均能显著对抗由肾上腺素引起的小鼠血糖升高。4结论2-SeCys-β-CD具有降血糖作用，因此2-SeCys-β-CD可用于治疗各种原因引起的糖尿病。药效试验(八)1名称治疗肺部感染(以2-diTe-β-CD为例说明)2方法2.1动物分组、模型建立及指标测定2.1.1动物分组、模型建立健康的大鼠120只，雌性，体重为150～170g，随机将动物分成实验组、正常组。实验组每笼16只，共7笼，对照组8只。实验组给大鼠口服2-diTe-β-CD每只100mg/kg、500mg/kg，每周两次，同时饮水中加入四环素1g/L，以预防细菌性感染。对照组不给药。2.1.2动物解剖及标本采集SD大鼠120只，其中30只作为正常对照，不注射药物，90只给药以诱发其卡氏肺孢子虫感染，用药第4周，随机取60只大鼠分为2-diTe-β-CD治疗的大、小剂量组(100mg/kg，500mg/kg)，每天一次，第6～12周开始陆续剖杀大鼠。无菌分离并部分横断切开气管，插入连接有5ml注射器(内装生理盐水)、粗细适宜的塑料导管，并加以固定。通过注射器行支气管肺泡灌洗(brochial aloveolarlavage fluids.BALs)，连续7～8次，回收30～40ml的支气管肺泡灌洗液。2000rpm离心10min，弃去上清液，取少量沉淀涂片。生理盐水洗净肺脏表面血液，切开肺脏各叶，制成肺组织印片，BALs沉淀、肺组织冻存在-20℃，检出感染阳性率。3结果3.1一般状况见下表11


3.2感染阳性率见下表12

4结论:口服2-diTe-β-CD可以较好的防止肺部感染以及各类肺部疾病。药效试验(九)1名称治疗白癜风(以6-Se-β-CD为例说明)2方法2.1酪氨酸酶标准浓度回归方程的建立取试管5支，各加入1ml L-多巴溶液(2mg/ml)和0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)2.8ml，摇匀，放入25℃恒温水浴中预热10min，再向上述试管中分别加入不同浓度的酪氨酸酶溶液1ml，立即混匀，并准确计量，25℃水浴反应5min，迅速加入0.2％硫脲-乙醇溶液，混匀，终止反应。以0.1mol/L磷酸缓冲液为空白对照管，在721型分光光度计上波长为475nm处测吸收值。2.2动物模型取黑色或黑花色豚鼠80只，随机均分为正常组、模型组和治疗组(6-Se-β-CD大剂量组500mg/kg、6-Se-β-CD小剂量组100mg/kg)。脱去黑毛约4cm×4cm后，正常组在脱毛区涂1ml蒸馏水，每日2次；模型组涂5％过氧化氢1ml，每日2次，治疗组的6-Se-β-CD以少量水溶在脱毛区涂1ml，四组连续30天，末次给药后40min，用乌拉坦麻醉，自腹主动脉取血，分别测酪氨酸酶含量和血液流变性指标。2.3酪氨酸酶含量的检测
将血液离心(2500r/min)，得上清液。然后取20支试管，方法同2.1项。但试管中加上清液1ml，而不是酪氨酸酶，同样终止反应后，以0.1mol/L磷酸缓冲液为空白对照管，在分光光度计波长为475nm处测各管的吸收值，并将其代入上述回归方程计算酶含量。2.4血液流变性指标的检测取血后，用LANG-100型血液比粘度计测血液流变性指标全血比粘度、血浆比粘度、红细胞比容、红细胞电泳、红细胞聚集指数、纤维蛋白原等。3结果3.1酪氨酸酶标准浓度回归方程表13

由表12数据求回归方程。y＝1.9618x+0.1467，r＝0.9881。3.2白癜风模型动物血中酪氨酸酶含量表14

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.013.3白癜风模型动物血液流变性指标表15


与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
用5％过氧化氢涂布于豚鼠的黑毛区，每日2次，连续50d，腹主动脉取血，用分光光度计测酪氨酸酶含量和用LIANG-100型血液比粘度计测血液流变性指标，表明6-Se-β-CD对由白癜风引起的酪氨酸酶含量升高、血液流变性的各项指标有较好的治疗作用。4结论6-Se-β-CD对白癜风、皮炎等皮肤病有较好的治疗作用。药效试验(十)1名称对S180肿瘤、人胃癌细胞移植肿瘤抑止作用(以2-Se-β-CD为例说明)2方法2.1肿瘤悬液的制备及肿瘤模型建立选接种S180肿瘤后7～10天伜健康支动物处死，消毒、剥皮、用空针抽吸腹水，置于加有肝素的试管中，其中瘤细胞数应大于95％，死亡细胞小于1％，用Hanks氏液稀释腹水至适当的浓度(1∶1-4)，细胞数不低于6×107/mL。将S180肿瘤悬液皮下注射于健康小鼠右前肢腋下，每鼠注入0.1mL。将生长良好的人胃癌细胞株MGC-803(100万/0.1mL)注射于裸鼠右腋皮下。整个操作应在60分钟内完成，全部工作均在无菌室内进行无菌操作。2.2分组与给药将接种了肿瘤细胞的小鼠于接种后第2天随机分组。分组情况见表1和表2。全部药物分别腹腔注射，每日1次，连续给药7天(S180肿瘤)和10天(人胃癌移植瘤)。2.3观察指标实验中，要记录动物的一般表现，有无死亡。全部动物于最后一次给药的次日处死，剥离肿瘤，分别称重。计算出每组动物的平均体重及平均瘤重。各组取一部分肿瘤置于2.5％戊二醛溶液中保存，送电镜检查，了解其形态变化。另一部分抽取肿瘤细胞总DNA，用于Northern杂交，观察细胞内癌基因的变化。3结果3.1 2-Se-β-CD实验分组表16

3.2 2-Se-β-CD分组治疗表17

3.3透射电镜观察2-Se-β-CD喂养的小鼠，人胃癌细胞和S180肿瘤细胞均可见典型凋亡细胞特征，细胞体积变小，不规则，细胞核形态发生改变，出现核固缩现象，核内染色质凝集成块，并沿核膜内侧排列，出现核着边现象，偶见核裂解为碎块而形成的凋亡小体。4结论2-Se-β-CD对肿瘤有较好的抑止和治疗作用药效试验(十一)1名称对黑色素瘤的治疗作用(2-Se-β-CD为例说明)2方法2.1肿瘤模型选用黑色素瘤细胞，1×107细胞接种裸鼠右腋皮下。待肿瘤长至1cm直径时取出肿瘤，在生理盐水中将瘤剪碎，用本实验室自制的套管针吸取肿瘤块，每一实验鼠接种约0.3mm3，待肿瘤长至直径约0.5cm3开始用药治疗。实验鼠分3组，分别为模型组、2-Se-β-CD治疗组(每只100mg/kg、500mg/kg)，每组实验鼠40只，体重约20g左右，雌雄兼用。顺铂(CDDP)在注射前用生理盐水稀释至0.12mg/ml，顺铂(CDDP)3mg/kg，腹腔注射，每天1次，共5次，接着用2-Se-β-CD，每天2次，腹腔注射，共2周，7周后处死。2.2观察指标每周测量肿瘤体积及实验鼠体重2次，根据公式W＝a2×b/2计算肿瘤体积，a代表肿瘤最短径，b代表最长径，单位为cm，1cm3＝1g瘤重。于实验结束时，取肿瘤组织，作常规石腊包埋切片，HE染色光镜观察，记录存活天数。3结果见下表18

4 结论研究表明2-Se-β-CD对皮肤癌有较好的治疗作用。
与现有技术相比，本发明有如下特点1.制备方法简单，合成步骤少，产率高，可扩大生产。
2.人工酶模型简单，以环糊精空腔为底物结合部位，以含硒或含碲基团为催化基团。
3.本发明制备的环糊精衍生物GPX活力高。
4.环糊精衍生物作为药物可克服天然GPX不稳定，来源有限，分子量大会引起人体免疫反应，不易跨膜等缺点。
5.环糊精衍生物物理化学性质稳定。
6.环糊精衍生物具有优良的抗氧化性，在治疗和预防心脑血管疾病、糖尿病、肝脏损伤、呼吸系统疾病、风湿与类风湿、皮肤病、肿瘤、白内障等由自由基诱发的疾病方面有广泛的应用。
综上所述，本发明所述的环糊精衍生物制备工艺简单，产率高，可大量生产。并且环糊精衍生物精GPX活性高、稳定性好、能有效预防和治疗心脑血管疾病、糖尿病、肝脏损伤、呼吸系统疾病、风湿与类风湿、皮肤病、肿瘤、白内障等由自由基诱发的疾病。同时可克服天然酶用作药物产生的免疫原性大，跨膜困难，不稳定等缺点。因此，在医药上具有巨大的应用潜力。
权利要求
1.一种环糊精衍生物用于制备治疗心脑血管疾病、肝脏损伤、糖尿病、呼吸系统疾病、风湿与类风湿性疾病、皮肤病、肿瘤等由氧自由基诱发的疾病的药物中的用途，所述环糊精衍生物的结构是 其中母体环糊精结构式如下所示 母体环糊精可以是α-环糊精(n＝5)、β-环糊精(n＝6)、γ-环糊精(n＝7)，其结构用 或 来表示；取代基R1可以是在2位或6位，取代基R2也可以是在2位或6位，其条件是R1是在环糊精不同葡萄糖环的相同取代位上，R2是在环糊精不同葡萄糖环的相同取代位上；R1可以是-Se、-Te、-SeCys、-TeCys，其中，Cys表示半胱氨酸，SeCys表示硒代半胱氨酸，TeCys表示碲代半胱氨酸；R2可以-OH、-SeO2H、-TeO2H，其中SeO2H表示亚硒酸，TeO2H表示亚碲酸。
2.根据权利要求1的用途，其中环糊精衍生物选自 2-硒桥联环糊精 6-硒桥联环糊精 2，2′-N，N′-硒代半胱氨酸-硒桥联环糊精 6，6′-N，N′-硒代半胱氨酸-硒桥联环糊精 2A，2B-二亚硒酸-2A′，2B′-硒桥联环糊精 6A，6B-二亚硒酸-6A′，6B′-硒桥联环糊精 2-碲桥联环糊精 6-碲桥联环糊精 2，2′-N，N′-碲代半胱氨酸-碲桥联环糊精 6，6′-N，N′-碲代半胱氨酸-碲桥联环糊精 2A，2B-二亚碲酸-2A′，2B′-碲桥联环糊情，或者 6A，6B-二亚碲酸-6A′，6B′-碲桥联环糊精其中n＝5、6、7。
3.根据权利要2的用途，其中选用n＝6的环糊精衍生物。
4.根据权利要求3的用途，其中环糊精衍生物选自2-硒桥联-β-环糊精，6-硒桥联-β-环糊情，2-碲桥联-β-环糊精，6A，6B-二亚硒酸-6A′，6B′-硒桥联-β-环糊精，2，2′-N，N′-硒代半胱氨酸-硒桥联-β-环糊精，6，6′-N，N′-硒代半胱氨酸-硒桥联环糊精-β-环糊精，或6A，6B-二亚碲酸-6A′，6B′-碲桥联-β-环糊精。
5.根据权利要求1-4之一的用途，其中，心脑血管疾病是指心肌缺血、心肌梗塞、心绞痛、心律失常、高血脂、高血压、冠心病、动脉粥样硬化、脑出血、脑梗塞以及其联合症状；肝脏损伤疾病是指酒精肝、各种原因引起的肝纤维化、各型肝炎、脂肪肝等肝病；呼吸系统疾病是指由各种原因引起的肺部感染、肺炎、肺气肿、慢性支气管炎、支气管哮喘等呼吸道疾病；皮肤病是指白癜风、鱼鳞病、牛皮癣、黄褐斑、红斑狼疮或带状疱疹。
6.一种用于治疗心脑血管疾病、肝脏损伤、糖尿病、呼吸系统疾病、风湿与类风湿性疾病、皮肤病、肿瘤等由氧自由基诱发的疾病的药物组合物，其含有可药用载体和如下面的环糊精衍生物，该环糊精衍生物的结构是 其中母体环糊精结构式如下所示 母体环糊精可以是α-环糊精(n＝5)、β-环糊情(n＝6)、γ-环糊精(n＝7)，其结构用 或 来表示；取代基R1可以是在2位或6位，取代基R2也可以是在2位或6位，其条件是R1是在环糊精不同葡萄糖环的相同取代位上，R2是在环糊精不同葡萄糖环的相同取代位上；R1可以是-Se、-Te、-SeCys、-TeCys，其中，Cys表示半胱氨酸，SeCys表示硒代半胱氨酸，TeCys表示碲代半胱氨酸；R2可以-OH、-SeO2H、-TeO2H，其中SeO2H表示亚硒酸，TeO2H表示亚碲酸。
7.根据权利要求6的药物组合物，其中环糊精衍生物选自 2-硒桥联环糊精 6-硒桥联环糊精 2，2′-N，N′-硒代半胱氨酸-硒桥联环糊精 6，6′-N，N′-硒代半胱氨酸-硒桥联环糊精 2A，2B-二亚硒酸-2A′，2B′-硒桥联环糊精 6A，6B-二亚硒酸-6A′，6B′-硒硚联环糊精 2-碲桥联环糊精 6-碲桥联环糊精 2，2′-N，N′-碲代半胱氨酸-碲桥联环糊精 6，6′-N，N′-碲代半胱氨酸-碲桥联环糊精 2A，2B-二亚碲酸-2A′，2B′-碲桥联环糊精，或者 6A，6B-二亚碲酸-6A′，6B′-碲桥联环糊精其中n＝5、6、7。
8.根据权利要求7的组合物，其中选用n＝6的环糊精衍生物。
9.根据权利要求8的组合物，其中环糊精衍生物选自2-硒桥联-β-环糊精，6-硒桥联-β-环糊精，2-碲桥联-β-环糊精，6A，6B-二亚硒酸-6A′，6B′-硒桥联-β-环糊精，2，2′-N，N′-碲代半胱氨酸-碲桥联-β-环糊精，6，6′-N，N′-硒代半胱氨酸-硒桥联-β-环糊精，或6A，6B-二亚碲酸-6A′，6B′-碲桥联-β-环糊精。
10.根据权利要求6-9之一的药物组合物，其中，所述心脑血管疾病是指心肌缺血、心肌梗塞、心绞痛、心律失常、高血脂、高血压、冠心病、动脉粥样硬化、脑出血、脑梗塞以及其联合症状；肝脏损伤疾病是指酒精肝、各种原因引起的肝纤维化、各型肝炎、脂肪肝等肝病；呼吸系统疾病是指由各种原因引起的肺部感染、肺炎、肺气肿、慢性支气管炎、支气管哮喘等呼吸道疾病；皮肤病是指白癜风、鱼鳞病、牛皮癣、黄褐斑、红斑狼疮或带状疱疹。
11.根据权利要求10的药物组合物，其可以是液体制剂、注射剂、颗粒剂、片剂、栓剂、软膏剂、气雾剂、眼用制剂、缓释控释制剂、靶向制剂。
全文摘要
本发明属于环糊精衍生物在医药领域中应用。该衍生物是一种具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的人工模拟酶，它能有效地清除人体内的自由基，从而有效预防和治疗心脑血管疾病、糖尿病、肝脏损伤、呼吸系统疾病、风湿与类风湿、皮肤病、肿瘤等由自由基紊乱诱引发的疾病。该衍生物具有制备工艺简单、产率高、稳定性好、可大量生产的特点，作为药物，它克服了天然酶用作药物产生的免疫原性大，过膜困难，不稳定等缺点，在医药领域具有巨大的应用潜力。
文档编号A61P11/00GK1451390SQ0311944
公开日2003年10月29日 申请日期2003年3月13日 优先权日2003年3月13日
发明者罗贵民, 阎岗林, 贾志丹, 牟颖, 任晓君, 刘俊秋, 张鲲, 沈家聪 申请人:吉林大学