辛卡利特制剂的制作方法

专利名称：：辛卡利特制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及药学上可接受的辛卡利特(sincalide)制剂。
背景技术：
：KINEVAC(注射用辛卡利特)是一种非肠道给药的胆囊胰腺胃肠道激素肽。该活性药物成分，1-脱(5-氧代-L-谷氨酰胺-5-L-脯氨酸)-2-脱-L-甲硫氨酸蛙皮素(caerulein)或“辛卡利特”(CAS#25126-32-3)，是一种合成制备的具有以下氨基酸序列的C-末端八肽的缩胆囊素(CCK-8)Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2。KINEVAC于1976年首次出品，它是一种装于5mL(标定)玻瓶中的无菌、无热原、冷冻干燥的白色粉末，其含有5μg辛卡利特，45mg提供张力的氯化钠；可能已加入氢氧化钠或盐酸进行pH调节(pH5.5-6.5)。用TompkinsB0849封口仪在氮气顶空下密封I型玻瓶。这种两组分制剂收载于2000年1月1日执行的美国药典/国家配方手册(NationalFormulary)USP24，NF19中。自KINEVAC出品以来，已在KINEVAC的生产和分析中发现出多种的缺点。例如，该两组分制剂含量发生变化。采用豚鼠胆囊收缩生物测定法分析该制剂辛卡利特和KINEVAC的效能的事实加剧这种变化。这种生物测定不能区分辛卡利特的生物活性和辛卡利特降解物的生物活性。因此，需要在以前的辛卡利特制剂中加入过量20％的辛卡利特以补偿所述生物测定的限度。因此，需要一种具有改进及不变效能的制剂，其效能可通过辛卡利特特异性测定法(如HPLC)确立。发明概述本发明通过提供消除20％超量辛卡利特的需要的制剂而满足了改善辛卡利特制剂的需求。本发明的辛卡利特制剂还比现有技术的制剂的纯度更高，并且具有更少的降解物及更稳定的含量。另外，可通过HPLC测定这些制剂的纯度，从而消除了的现有技术制剂的生物测定的需求。本发明提供适于注射给药的辛卡利特制剂。这些辛卡利特制剂特征在于稳定性得到改善，并且一批次生产可制备的体积较大(约100L)。一方面，本发明特征在于辛卡利特制剂，该制剂包括有效量的辛卡利特、填充剂/张力调节剂、一或多种稳定剂、表面活性剂、螯合剂和缓冲剂。本发明特征还在于提供药剂盒和制备改良的辛卡利特制剂的方法，以及采用辛卡利特制剂治疗、预防和诊断胆囊相关疾病的方法。本发明制剂优选具有的pH范围为6.0-8.0。适合的缓冲剂包括但不限于磷酸盐、柠檬酸盐、磺基水杨酸盐、硼酸盐、乙酸盐和氨基酸缓冲液。优选磷酸盐缓冲剂，如磷酸氢二钾。在本发明的各实施方案中，所述表面活性剂为非离子表面活性剂，优选多乙氧基醚，如多乙氧基醚20或多乙氧基醚80；所述螯合剂为喷替酸(penteticacid)(DTPA)；所述稳定剂为抗氧化剂和/或氨基酸。在本发明特别描述的实施方案中，所述制剂包括多种稳定剂，优选L-精氨酸单盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸单盐酸盐和焦亚硫酸钠。适合的填充剂/张力调节剂包括但不限于甘露糖醇、乳糖、氯化钠、麦芽糖、蔗糖、PEG’s、环糊精、右旋糖酐、聚蔗糖(polysucrose)(Ficoll)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。D-甘露糖醇为优选的填充剂/张力调节剂。在特别优选的实施方案中，所述重构制剂(reconstututedformulation)包括0.0008-0.0012mg/mL的活性成分(即，辛卡利特)；20.0-50.0mg/mL的甘露糖醇；2.0-7.0mg/mL的精氨酸；0.2-1.0mg/mL的甲硫氨酸；2.0-30.0mg/mL的赖氨酸；0.002-0.012mg/mL的焦亚硫酸钠；0.000001-0.003mg/mL的多乙氧基醚20；0.1-3.0mg/mL的喷替酸(DTPA)；及5.4-12.0mg/mL的磷酸氢二钾。在更优选的实施方案中，所述重构制剂包括约0.001mg/mL的辛卡利特；约34mg/mL的D-甘露糖醇；约6mg/mL的L-精氨酸单盐酸盐；约0.8mg/mL的L-甲硫氨酸；约3mg/mL的L-赖氨酸单盐酸盐；约0.008mg/mL的焦亚硫酸钠；不多于约0.01mg/mL的多乙氧基醚20；约0.4mg/mL的喷替酸(DTPA)；和约1.8mg/mL的磷酸氢二钾。本发明的药剂盒可包括例如作为粉末形式混合物的所述制剂的各种组分和一种盛装所述粉末混合物的容器(如小瓶(vial))，以及用于重构制剂的生理学上可接受的流体。所述制剂的各组分可以或者以粉末混合物的形式或者以液体部分存在于药剂盒中。本发明的药剂盒还可包括在液体混合物中的所有组分或者部分液体形式的组分以及部分粉末形式的组分。与以前的辛卡利特制剂相比，本发明的制剂稳定性和效能都得到提高，因此可用作成像患者肝胆系统的诊断辅助剂。当用作诊断辅助剂时，可将所述辛卡利特制剂与例如具有快速肝脏吸收的放射性药物(如99mTc-甲溴菲宁(Mebrofenin))或类似的肝胆显像剂联合使用，以帮助诊断胆囊疾病和相关疾病。另外，所述制剂的给予可在诊断成像(包括例如磁共振成像、闪烁照相成像和超声成像等)之前和/或之后进行。为治疗和/或预防TPN-相关的疾病，还可将本发明的辛卡利特制剂给予接受全肠外营养(TPN)的患者服用。从下列详细的说明和权利要求书中，可明显清楚本发明的其它特征和优点。图标简述图1是显示1-脱(5-氧代-L-谷氨酰胺-5-L-脯氨酸)-2-脱甲硫氨酸蛙皮素或“辛卡利特”(CAS#25126-32-3)的化学结构的图。氨基酸残基“Met3”和“Met6”由虚线划出。图2是显示辛卡利特(Met3)单亚砜的化学结构的图。图3是显示辛卡利特(Met6)单亚砜的化学结构的图。图4是显示辛卡利特(Met3，6)双亚砜的化学结构的图。图5是pH对35mM磷酸盐缓冲液中辛卡利特回收率的24小时影响的图解说明。在显示资料的各pH处，各条形从左至右依次代表0、6和24小时。图6是pH对本发明制剂中辛卡利特回收率的8小时影响的图解说明。在显示资料的各pH处，各条形从左至右依次代表0、4和8小时。图7是在喷替酸(DTPA)存在和不存在下，辛卡利特Met3和Met6单亚砜(相对于辛卡利特)百分率的图解说明。图8是添加0.63mMCu2+的KINEVAC试验制剂(无DTPA)的色谱图。图9是添加0.63mMCu2+的KINEVAC试验制剂(1mMDTPA)的色谱图。图10是添加0.18mMMn2+的KINEVAC试验制剂(无DTPA)的色谱图。图11是添加0.18mMMn2+的KINEVAC试验制剂(1mMDTPA)的色谱图。图12显示用5mL水重构的冷冻干燥的重构的KINEVAC的全范围和放大范围的色谱图，结果得出辛卡利特浓度为1μg/mL。发明详述为研制一种改良的辛卡利特制剂，进行了一系列研究(在以下各实施例中说明)，以确定各种赋形剂对辛卡利特制剂的影响。通过这些研究我们发现，通过仔细选择可提供某些所要求功能的赋形剂，辛卡利特制剂的功能和稳定性可明显增高。因此，本发明提供新型的辛卡利特制剂，与以前辛卡利特制剂相比，新型制剂的稳定性和/或功效得到改善。本发明中所用的术语“辛卡利特”包括合成制备的具有以下氨基酸序列的C-末端八肽的缩胆囊素(CCK-8)Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2，及其被优化或修饰(改善稳定性、效能、药动学等)但保留原八肽的生物学活性的衍生物。例如，其中甲硫氨酸和/或天冬氨酸残基被取代同时不明显影响所述生物学活性的肽包括在本文所用的术语“辛卡利特”之中。类似地，术语“辛卡利特”不仅包括所述肽的单体形式，也包括其多聚体形式，以及所述肽及其衍生物的生理学上的活性降解物或部分。本发明的辛卡利特制剂可包括各种赋形剂，如抗氧化剂、缓冲剂、填充剂/张力调节剂、螯合剂、复合剂、交联剂、共溶剂、同渗质量摩尔浓度调节剂、加溶剂、表面活性剂、稳定剂、pH调节剂、冷冻保护剂(lyoprotectants)/防冷冻剂(cryoprotectants)、空气/液体和/或冰-液体界面保护剂(防止诱发表面变性的保护剂)、冷冻-融化保护剂、防止蛋白质/肽变性保护剂、再水合保护剂和湿润剂。在优选实施方案中，所述制剂包括至少具有以下功能的赋形剂(i)填充剂/张力调节剂，(ii)稳定剂，(iii)表面活性剂，(iv)螯合剂，和(v)缓冲剂。一般地，这些功能的每一种通过不同的赋形剂完成。但是，在本发明的某些实施方案中，单一的赋形剂可行使一种以上的功能。例如，单一的赋形剂可行多种功能，如氨基酸可作为填充剂、稳定剂和/或缓冲剂，其它赋形剂可同时作为例如稳定剂和螯合剂或者同时作为填充剂和张力调节剂。另外，可使用行使相同功能的多种赋形剂。例如，所述制剂可含有一种以上的具有稳定剂功能的赋形剂。下表1显示所研究的各种赋形剂的浓度范围。所研究的范围通常以冷冻干燥之前每瓶中2mL填充体积的溶液剂为基础。用5mL注射用水重构后，最终的辛卡利特制剂为等渗溶液。如果必要，可结合以下条件，可将表1中提供的各成分的浓度范围上下调节增加或降低每瓶的填充体积、获得理想的pH、获得理想的重构体积以及要求使最终重构溶液达到等渗。例如，如上所示，研制表1中提供的各浓度以提供等渗溶液；但是，本领域技术人员应清楚如果不需要等渗溶液，则可使用更宽的浓度范围。表1.用于优选的辛卡利特制剂的赋形剂的浓度范围其它赋形剂包括TWEEN-80、焦亚硫酸钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和氯化钾。其它选择在以下列出。表2呈现所述本体溶液、瓶装固体剂和重构后优选的赋形剂的优选范围。溶液剂中所示的所有浓度以2mL填充体积为基础。组分的用量要与得到的略低于中性的pH相匹配，并要与按所示将冷冻干燥瓶装制剂重构后的等渗溶液相匹配，其同渗质量摩尔浓度范围为180-320mOsm/kg，优选240-320mOsm/kg。标题为“终制剂”的表栏代表特别优选的制剂。表2.各种辛卡利特制剂的同渗质量摩尔浓度值(所有制剂均含有0.0025mgCCK-8/mL；“dibasic”和“monobasic”指二元的和一元的磷酸钾；“Nameta”指焦亚硫酸钠)螯合剂赋形剂杂质和/或提取终止剂(stopperextractables)可带入药物制剂中痕量的金属。辛卡利特含有两个甲硫氨酸残基(Met3和Met6)，它们易于受到游离金属的氧化作用。因此，本发明的辛卡利特制剂含有抑制辛卡利特中存在的两个甲硫氨酸残基(Met3和Met6)氧化作用的螯合剂。优选的螯合剂包括喷替酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)及其衍生物(包括其盐)。DTPA是优选的螯合剂。如在以下实施例2中所述，在某些金属存在且无DTPA存在下，降解物(辛卡利特Met3和辛卡利特Met6单亚砜)的量增加，而DTPA的存在具有抑制这些单亚砜形成的作用。尤其是，在无DTPA存在下，铜和锰对辛卡利特的各甲硫氨酸残基具有最大的氧化作用，使得Met3和Met6单亚砜的合并重量百分比(与辛卡利特相比)分别为85.5和128.9。在优选的实施方案中，所述辛卡利特制剂在重构后每mL含有0.1-3.0mg的DTPA。在特别优选的实施方案中，本发明辛卡利特制剂在用5mL再溶解配制后含有0.4mgDTPA/mL。缓冲剂应用缓冲剂稳定本发明辛卡利特制剂的pH，因此可在极限pH值时降低化学稳定性的风险。制备本发明制剂盒中所用的缓冲剂包括但不限于磷酸、磷酸盐(如磷酸二氢钠或磷酸氢二钠，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾等)、柠檬酸、柠檬酸盐(如柠檬酸钠等)、磺基水杨酸盐、乙酸、乙酸盐(如乙酸钾，乙酸钠等)、甲基硼酸(boronicacid)、硼酸盐(boronate)、六水合琥珀酸二钠、包括氨基酸盐的氨基酸(如组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、咪唑)、乳酸、乳酸盐(如乳酸钠等)、马来酸、马来酸盐、氯化钾、苯甲酸、苯甲酸钠、碳酸、碳酸盐(如碳酸钠等)、碳酸氢盐(如碳酸氢钠等)、硼酸(boricacid)、硼酸钠、氯化钠、琥珀酸、琥珀酸盐(如琥珀酸钠等)、酒石酸、酒石酸盐(如酒石酸钠等)、三-(羟甲基)氨基甲烷、生理缓冲液(如N-2羟乙基哌嗪，N’-2-乙磺酸(HEPES)，CHAPS等其它“Good’s”缓冲液)等。磷酸盐是优选的缓冲剂，原因是其与辛卡利特不发生相互作用并且在生理pH范围内具有理想的缓冲能力。磷酸氢二钾是本发明的辛卡利特制剂中特别优选的缓冲剂。如以下实施例1中所述，本发明辛卡利特制剂证明在pH5.5-9.1范围内稳定。在pH5.5-8.5范围内，没有观察到本发明辛卡利特制剂的初始辛卡利特回收率中的明显的pH依赖性趋势。本发明辛卡利特制剂优选具有6.0-8.0的pH值。稳定剂所述八肽-辛卡利特含有一个色氨酸和两个甲硫氨酸残基。甲硫氨酸已被鉴定为是最易氧化的氨基酸之一，其降解为其对应的亚砜，并在更强的氧化条件下降解为其砜。该氧化的机理似乎高度依赖于所考虑的活性氧类过氧化物、过氧基、单态氧和羟基已显示可将甲硫氨酸残基氧化为亚砜或其它产物。因此，基于该肽的氧化潜能，有必要确定用于肽稳定作用的功能性添加剂。抗氧化剂/还原剂.在本发明的优选实施方案中，所述辛卡利特制剂含有作为稳定剂的抗氧化剂或还原剂。很多种抗氧化剂或还原剂可用作稳定剂，包括但不限于乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、抗坏血酸、苄醇、柠檬酸、喷替酸(DTRA)、没食子酸丙酯、尼泊金甲酯、次硫酸盐、尼泊金丙酯、依地酸或乙二胺四乙酸(EDTA)、EDTA二钠二水合物、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、一硫代甘油、焦亚硫酸钾、甲醛化次硫酸钠、亚硫酸钠、琥珀酸钠、焦亚硫酸钠、氯化锡、硫代乙酸、硫二甘油、硫代乙醇胺、硫代乙醇酸、2-氨基乙硫醇(巯基乙胺)、丁基化羟基苯甲醚(BHT)和硫酸钠及其衍生物，包括其盐和亚硫酸盐。焦亚硫酸钠是优选的抗氧化稳定剂。另外，作为优选鳌合剂的DTPA也可作为抗氧化稳定剂。氨基酸.氨基酸也一直用作肽的稳定剂或共稳定剂(co-stabilizers)用作冷冻干燥过程中的防冷冻剂、稳定抗热变性、抑制聚集形成、改善溶解性或再水合作用、抑制异构化、降低表面吸收或用作鳌合剂。它们还能增加产品玻璃转化温度(Tg)，从而增加处理过程的稳定性，也能通过最大降低二次干燥过程中过分干燥(overdrying)来稳定产品。在生理pH下，暴露于表面的残基易于与氧化剂反应，清除氧化分子，保护肽的关键区域。可用各种D-和/或L-氨基酸作为辛卡利特制剂中的稳定剂。此处所用的“氨基酸”及特定氨基酸(如精氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸等)的名称包括D-和/或L-氨基酸、氨基酸盐、其衍生物、类似物、二聚体、低聚物或其混合物。本发明中用作稳定剂的优选的氨基酸包括甲硫氨酸、赖氨酸和精氨酸。适用作稳定剂的其它氨基酸(及氨基酸盐)的实例包括但不限于精氨酸谷氨酸盐、天冬酰胺、γ氨基丁酸、甘氨酸(和甘氨酸缓冲剂)、谷氨酸、谷氨酸盐、谷氨酸钠、组氨酸(和组氨酸缓冲剂)、赖氨酸谷氨酸盐、赖氨酸门冬氨酸盐、精氨酸门冬氨酸盐、咪唑、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、聚谷氨酸、多熔素、双甘氨肽等，包括羟丙基和半乳糖衍生物。在一特别优选的实施方案中，使用L-精氨酸单盐酸盐、L-甲硫氨酸和L-赖氨酸单盐酸盐。防冷冻剂/防冷冻剂本发明可使用各种防冷冻剂/防冷冻剂。适合的防冷冻剂构建水分子，使得凝固点降低和/或使得实现玻璃质态(vitreousphase)所必须的冷却速率降低。它们还能升高玻璃质态的玻璃转化温度。这些防冷冻剂包括但不限于二甲亚砜(DMSO)、右旋糖苷、蔗糖、1，2-丙二醇、氨基酸/盐，如甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、脯氨酸等，甘油、山梨糖醇、氯化钠、果糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖(stachychose)、丙二醇、2，3-丁二醇、羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、PEG’s和类似化合物、蛋白质稳定剂，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛γ球蛋白、明胶(或衍生物，如Prionex等)、右旋糖、葡萄糖、麦芽糖、阿拉伯糖、乳糖、肌醇、聚醇(如山梨糖醇、木糖醇、Erithritol、甘油、乙二醇等)、四甲基葡萄糖、硫酸钠、环糊精及其组合。赖氨酸和精氨酸是优选的防冷冻剂/防冷冻剂。表面活性剂/加溶剂肽易于通过变性、聚集、沉淀、容器表面吸收和/或搅动诱发变性产生物理降解。向所述制剂中加入非离子表面活性剂(如多乙氧基醚)可降低表面间张力或者帮助溶解，从而预防或降低空气/液体或液体/固体界面处的溶液中所述产品的变性和/或降解。表面活性剂/加溶剂包括以下化合物，如游离脂肪酸；脂肪酸与聚氧化亚烷基化合物(如聚氧丙二醇和聚氧乙二醇)成的酯；脂肪醇与聚氧化亚烷基二醇化合物成的醚；脂肪酸与聚氧烷基化山梨聚糖成的酯；皂；甘油-聚亚烷基硬脂酸酯、甘油-聚氧乙烯蓖麻醇酸酯、聚亚烷基二醇的均聚物和共聚物；聚乙氧基化大豆油和蓖麻油以及氢化衍生物；蔗糖或其它碳水化合物与脂肪酸、脂肪醇成的醚和酯，它们任选被聚氧烷基化；饱和或不饱和脂肪酸的一、二和三甘油酯；甘油酯或大豆油和蔗糖；癸烯酸钠、硫酸铵、十二烷基硫酸钠(SDS)、Triton-100和包含烷基、芳基或杂环结构的阴离子表面活性剂。本发明中使用的优选的表面活性剂/加溶剂的实例包括但不限于普朗尼克类(pluronics)(如LutrolF68，LutrolF127)、泊洛沙姆、SDS、Triton-100、多乙氧基醚(如TWEEN20和TWEEN80)、丙二醇、PEG和类似的化合物、Brij58(聚氧乙烯20十六烷基醚)、聚氧乙烯蓖麻油(cremophorEL)、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)、二甲基乙酰胺(DMA)、NP-40(NonidetP-40)和N-甲基-2-吡咯烷酮(Pharmasolve)、甘氨酸以及其它氨基酸/氨基酸盐和包含烷基、芳基或杂环结构的阴离子表面活性剂，以及环糊精。TWEEN20是本发明制剂中最优选的表面活性剂。填充剂/张力调节剂由于本发明制剂中存在的辛卡利特的量很小，所以使用填充剂/张力调节剂对所述活性组分辛卡利特提供结构和支持，并提供张力。制备本发明冷冻干燥产品中可用的填充剂/张力调节剂(也称为冷冻干燥辅助剂)是本领域已知的，包括甘露糖醇、乳糖、氯化钾、氯化钠、麦芽糖、蔗糖、PEG’s(如PEG300、PEG400、PEG3350、PEG6000、PEG8000等)、海藻糖、棉子糖、葡萄糖、多聚半乳糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基酸(包括氨基酸盐)(如赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、半乳糖等)、环糊精(如羟丙基-γ-环糊精(HP-γ-CD))、葡聚糖、Ficoll和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。当然，D-甘露糖醇是本发明所用的最优选的填充剂/张力调节剂。其它赋形剂本发明制剂中可任选使用的其它赋形剂包括防腐剂(如苯扎氯铵)、同渗质量摩尔浓度调节剂(如右旋糖)、防冷冻剂(如硫酸钠)、加溶剂、张力调节剂(如氯化钠)、饼块形成剂、复合剂和加溶剂。在下列文献中可发现用于非肠道给药的辛卡利特制剂中可使用的各种赋形剂，例如Michael&IreneAsh编辑的第二版TheHandbookofPharmaceuticalAdditives；A.Gennaro，1990，MackPublishingCompany，Easton，PA和Pollock编辑的Remington’sPharmaceuticalSciences(18thEdition)；Strickly，RobertG的1999年美国上市的小分子治疗剂的非肠道制剂-第一部分PDA(ParenteralFormulationsofSmallMoleculesTherapeuticsMarketedintheUnitedStates(1999)-PartI，PDA)JournalofPharmaceuticalScienceandTechnology，53(6)324(1999)；Strickly，RobertG的1999年美国上市的小分子治疗剂的非肠道制剂-第二部分PDA(ParenteralFormulationsofSmallMoleculesTherapeuticsMarketedintheUnitedStates(1999)-PartII，PDA)JournalofPharmaceuticalScienceandTechnology，54(1)69(2000)；1999年美国上市的非肠道给药的小分子治疗剂-第三部分PDA(ParenteralFormulationsofSmallMoleculesTherapeuticsMarketedintheUnitedStates(1999)-PartIII，PDA)JournalofPharmaceuticalScienceandTechnology，54(2)154(2000)；Nema，Sandeep等的注射剂PDA中的赋形剂及其应用(ExcipientsandTheirUseinInjectableProducts，PDA)JournalofPharmaceuticalScienceandTechnology，54(1)166(1997)；Wang，Y.J.等的蛋白质和肽的非肠道给药制剂稳定性和稳定剂(ParenteralFormulationsofProteinsandPeptidesStabilityandStabilizers)(TechnicalReportNo.10)JournalofParenteralScienceandTechnology，Vol.42(2S)，1988增补本；Carpenter，J等的冷冻-和干燥诱发的蛋白质结构的混乱和通过稳定作用的添加剂进行蛋白质保护的机理(Freezing-andDrying-InducedPerturbationsofProteinStructureandMechanismsofProteinProtectionbyStabilizingAdditives)DrugsandThePharmaceuticalSciences，LouisReyandJoanC.May.，eds.，MarcelDekker，Inc.NewYork，NY(1999)；MichaelJ.Pikal，冷冻-干燥和储存过程中蛋白质稳定的机理热力学稳定性和玻璃态弛豫动力学的相对重要性(TheRelativeImportanceofThermodynamicStabilizationandGlassyStateRelaxationDynamics)DrugsandThePharmaceuticalSciences，LouisReyandJoanC.May.，eds.，MarcelDekker，Inc.NewYork，NY(1999)；Shah，D等的各种赋形剂对碱性成纤维细胞生长因子PDA的伸展的影响(TheEffectsofVariousExcipientsontheUnfoldingofBasicFibroblastGrowthFactor，PDA)JournalofPharmaceuticalScience&Technology，52(5)238(1998)；Powell，M.F.等的非肠道制剂PDA的赋形剂概述(CompendiumofExcipientsforParenteralFormulations，PDA)JournalofPharmaceuticalScience&Technology，52(5)238(1998)；以及InactiveIngredientGuide，Div.OfDrugInformationResources，FDA，CDER，1996年1月；HandbookofInjectableDrugs，第8版，Am.Soc.HospitalPharmacists，1994，L.A.Trissel。制剂盒本发明的药剂盒优选含有一或多个小瓶，所述小瓶中装有预测定量的辛卡利特的无菌制剂、冷冻干燥辅助剂或填充剂/张力调节剂、一或多种稳定剂、表面活性剂、螯合剂和缓冲剂。装有所有或部分所述制剂的一或多个小瓶可以独立为无菌溶液或冷冻干燥的固体的形式。制备本发明制剂盒中所用的缓冲剂在此讨论，包括例如磷酸盐、柠檬酸盐、磺基水杨酸盐、乙酸盐和氨基酸(包括氨基酸盐)。磷酸氢二钾是本发明辛卡利特制剂中优选的缓冲剂。所述药剂盒还包括流体部分，例如水或盐水，其用于注射前重构制剂。制备冷冻干燥药剂盒中所用的冷冻干燥辅助剂或填充剂/张力调节剂包括以上讨论的那些，尤其是甘露糖醇、乳糖、氯化钠、麦芽糖、蔗糖、PEG’s、半乳糖醛酸、多聚半乳糖醛酸、环糊精(如羟丙基-γ-环糊精(HP-γ-CD)等)、右旋糖苷、氨基酸(包括氨基酸盐)、Ficoll和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。其中甘露糖醇、氯化钠、麦芽糖、蔗糖、PEG’s、HP-γ-CD和右旋糖苷是本发明使用的优选的填充剂/张力调节剂，最优选甘露糖醇。如上讨论，制剂盒中的组分还可具有一种以上的功能。例如，用作稳定剂的赋形剂也可用作鳌合剂，而用作填充剂的赋形剂也可用作张力调节剂。另外，在某些实施方案中，所有赋形剂均为干燥粉末形式或均为液体形式，而在其它实施方案中，某些赋形剂为干燥形式，其它则为包含固体的液体形式或在药剂盒中液体部分和固体部分分开的形式。本发明特别优选的药剂盒包含约0.005mg的辛卡利特、约170mg的D-甘露糖醇、不大于或等于0.01mg的TWEEN20、约2mg的DTPA、约0.04mg的焦亚硫酸钠、约9mg的磷酸氢二钾、约4mg的L-甲硫氨酸、约15mg的L-赖氨酸单盐酸盐和约30mg的L-精氨酸单盐酸盐。治疗/诊断用途辛卡利特是一种内源性产生的激素缩胆囊素(CCK-8)的合成类似物。CCK-8作用于胆囊壁内的受体，引起胆囊收缩，清除可能已聚集在胆囊内的任何遗留的残渣或胆汁。CCK-8能增加胆汁流量，小肠和大肠的运动引起幽门括约肌收缩，并增加胰腺酶的分泌。CCK-8还能引起胆汁输送至肠的延迟。与内源性激素(CCK-8)相比，在收缩和松弛方面，辛卡利特对胆囊具有更快的生理影响，当将辛卡利特制剂单独给药或与肝胆显像剂联合给药时，辛卡利特制剂可用作肝胆成像的诊断辅助剂。例如，辛卡利特制剂可在诊断成像(例如磁共振成像、闪烁照相成像(scintigraphicimaging)和超声成像等)之前和/或之后给予，以提高观看的清晰度和/或提高各种疾病的诊断。在一实施方案中，可采用例如一种用于诊断和评估肝胆疾病的仪器成像工具一肝胆闪烁照相机进行肝胆成像。诸如急性和慢性胆囊炎、胆汁郁积、胆汁渗漏以及其它形式的肝胆疾病的检测可帮助主治医师更好地确定治疗或处理患有可疑肝胆疾病的患者的适当疗程。如同以下说明，辛卡利特与肝胆显像剂联合使用的适应征包括(a)成像之前已未进食20-24小时以上的患者(目的是排空非放射性标记的胆汁的胆囊(GB))的预处理，和(b)用于分析胆囊运动功能，包括测定GBEF(胆囊排出物分数(ejectionfraction))。重要的是在肝胆成像之前使患者作好正确准备，以完成高质量的成像，降低假阳性和假阴性的结果的数量。患者优选在肝胆成像前4-12小时不吃任何食物。但是延长禁食可导致假阳性测试结果(即不能观察到胆囊)。如果患者未进食超过24小时，优选在成像前通过给予本文所述的辛卡利特制剂，对患者用辛卡利特预处理。一般地，注射辛卡利特后15分钟内胆囊收缩，30分钟后注射肝胆显像剂(如放射性示踪剂)。然后使胆囊排空，使之能更好地吸收和聚集显像剂(如放射性示踪剂)，其可帮助降低假阳性研究的数量。肝胆成像所用的优选的放射性药物包括但不限于Tc99mIDA(亚氨基二乙酸)类似物，如Tc-99m甲溴菲宁(CHOLETEC)、Tc-99m地索苯宁(DISIDA)和Tc-99m利多苯宁(也可参见美国专利4,418,208号)。Tc-99m甲溴菲宁是优选的肝胆显像剂。Tc99mIDA(亚氨基二乙酸)类似物与CCK和辛卡利特共同给药的方法在本领域是已知的，并在以下文献中说明，例如，ZiessmanHA.，缩胆囊素胆汁闪烁扫描法其本身成功的受害者？(Cholecystokinincholescintigraphyvictimofitsownsuccess？)J.Nucl.Med.1999，402038-2042；KrishnamurthyS.，等，胆囊排出物分数十年间的发展与未来展望(GallbladderejectionfractionAdecadeofprogressandfuturepromise.)J.Nucl.Med.1992，32542-544；KrishnamurthyGT.，等，胆汁动力学定量一种新的非侵入性闪烁扫描技术的介绍(Quantitativebiliarydynamicsintroductionofanewnoninvasivescintigraphictechnique.)J.Nucl.Med.1983，24217-223；MesgarzadehM.，等，正常胆囊缩胆囊素排空后的填充与再填充两种不同剂量CCK对再填充的影响简讯(Filling，post-cholecystokininemptyingandrefillingofnormalgallbladdereffectsoftwodifferentdosesofCCKonrefillingConciseComm.)J.Nucl.Med.1983，24666-671；KrishnamurthyGT.，等，胆囊排空对连续外源性缩胆囊素的响应(Thegallbladderemptyingresponsetosequentialexogenouscholecystokinin.)Nucl.Med.Com.，1984，5(1)pp27-33；KrishnamurthyGT.，等，闪烁扫描法对正常胆管阻塞度的检测、定位和定量(Detection，localizationandquantitationofdegreeofcommonbileductobstructionbyscintigraphy.)J.Nucl.Med.1985，26726-735；Fink-BennetD等，缩胆囊素胆汁闪烁扫描法在胆囊管输送症状中的发现(Cholecystokinincholescintigraphicfindingsinthecysticductsyndrome)J.Nucl.Med.1985，261123-1128；Fink-BennetD，胆囊照相在评估胆道疾病中的作用(Theroleofcholecystogoguesintheevaluationofbiliarytractdisorder.)Nucl.Med.Ann.1985，LennyFreemanandHeidiWeissman，eds.，NewYork，RavenPress，1985，pp107-132；NewmanP.等，一种缩胆囊素-HIDA扫描定量的简单技术(Asimpletechniqueforquantitationcholecystokinin-HIDAscanning.)BritishJ.ofRadiology，vol.56，pp.500-502，1983；PicklemanJ.等，辛卡利特胆囊闪烁扫描法在评估未知性胆囊疾病的患者中的作用(Theroleofsincalidecholescintigraphyintheevaluationofpatientswithacalculousgallbladderdisease.)ArchivesofSurgery，vol.120，693-697；ZiessmanHA.等，胆囊排出物分数的计算三分钟输注方法中持续辛卡利特输注的优点(CalculationofagallbladderejectionfractionAdvantageofcontinuoussincalideinfusionoverthethree-minuteinfusionmethod.)J.Nucl.Med.1992，33537-41；Sitzmann，JV.等，缩胆囊素抑制人体肠道外营养诱发的胆汁淤积(Cholecystokininpreventsparenteralnutritioninducedbiliarysludgeinhumans.)，Surg.Gynecol.Obstet.17025-31，1990；TeitelbaumDH.等，用缩胆囊素-八肽治疗与胃肠外营养相关的胆汁郁积(Treatmentofparenteralnutrition-associatedcholestasiswithcholecystokinin-octapeptide)，J.Pediatr.Surg.301082，1995。在给予肝胆显像剂后，可采用适当的检测装置成像患者的肝胆系统。当用Tc99mIDA(亚氨基二乙酸)类似物，如CHOLETEC作为显像剂时，可使用伽玛照相机扫描患者体内以检测放射性。所述胆囊成像允许进行各种胆汁运动功能的非侵入性测定和分析，包括胆囊排出物分数(GBEF)的测定。GBEF的测定在某些胆囊相关疾病(包括慢性未知性胆囊疾病(CAC))的诊断和处理上具有临床价值。特别是，发现低GBEF对CAC具有＞90％的阳性预测值。胆汁动力学的其它变化可用于诊断各种胆汁疾病。闪烁扫描法测定GBEF的方法在本领域是已知的，在如上描述的参考文献中已说明。辛卡利特通过其对胆囊生理功能的作用，如诱发胆囊收缩和排空，在胆汁功能分析中(包括GBEF的测定)起着辅助作用。一种测定GBEF的技术是以1-3分钟输注的速度慢慢给予辛卡利特，然后在约20分钟结束时计算GBEF。或者，可以以大剂量快速输注，或者以15-60分钟缓慢持续输注辛卡利特。通过在肝胆成像过程中诱发某些胆汁功能，辛卡利特帮助鉴定这些功能中的异常，这些异常可作为某些肝胆疾病的指征。辛卡利特制剂可通过IV或IM注射给药对于IV给药，可通过大剂量输注或在一定时间内慢慢注射(任选在输注泵帮助下)给予所述剂量。IV给药的剂量一般为0.005-0.04μg/kg(大剂量输注)或为0.005μg/kg以一系列4个三分钟注射进行。0.02-0.04μg/kgIV进行2-3分钟(但最长可至1小时)的剂量在本领域已有描述。使用输注泵，还可使用0.58μg/kg/小时的注射速率。从10ng/kg/hr开始并增加到160ng/kg/hr的其它注射方案在本领域也已熟知。各种情况下都不推荐大剂量注射，但可使用2-3分钟甚至长达15分钟的0.02-0.04μg/kg注射，以避免胆管或GB痉挛。IM给药剂量一般较高，范围为0.1-0.4μg/kg。在一实施方案中，一般优选可产生最大GB响应并具有最低副作用的0.4μg/kgIM的剂量。给药中的更详细的内容在诸如下列文献中提供，MesgarzadehM.，等，正常胆囊缩胆囊素排空后的填充与再填充两种不同剂量CCK对再填充的影响(Filling，postcholecystokininemptyingandrefillingofnormalgallbladdereffectsoftwodifferentdosesofCCKonrefilling.)J.Nucl.Med.1983，24666-671；ZiessmannHA.等，胆囊排出物分数的计算三分钟输注方法中持续辛卡利特输注的优点(CalculationofagallbladderejectionfractionAdvantageofcontinuoussincalideinfusionoverthethree-minuteinfusionmethod.)J.Nucl.Med.1992，33537-541；PicklemanJ.等，辛卡利特胆囊闪烁扫描法在评估未知性胆囊疾病的患者中的作用(Theroleofsincalidecholescintigraphyintheevaluationofpatientswithacalculousgallbladderdisease.)ArchivesofSurgery，vol.120，693-697；KrishnamurthyGT.，等，胆囊排空对连续外源性缩胆囊素的响应(Thegallbladderemptyingresponsetosequentialexogenouscholecystokinin.)Nucl.Med.Com.，1984，5(1)pp27-33；KrishnamurthyGT.，等，胆汁动力学定量一种新的非侵入性闪烁扫描技术的介绍(Quantitativebiliarydynamicsintroductionofanewnoninvasivescintigraphictechnique.)J.Nucl.Med.1983，24217-223；Fink-BennetD等，胆囊照相在评估胆道疾病中的作用(Theroleofcholecystogoguesintheevaluationofbiliarytractdisorder.)Nucl.Med.Ann.1985，LennyFreemanandHeidiWeissman，eds.，NewYork，RavenPress，1985，pp107-132；BalonH.R.等，肝胆闪烁扫描法的核医学方法指导原则协会(SocietyofNuclearMedicineProcedureGuidelineforhepatobiliaryscintigraphy.)。本发明的辛卡利特制剂还可用于治疗接受全肠外营养(TPN)的患者。TPN诱发胆汁凝集、诱导胆汁郁积的发展、胆结石的形成和其它胆囊相关综合征。的确，在某些情况下，TPN相关的胆汁郁积(TPN-AC)可以致命。TPN-AC临床综合征包括脓毒病、肝硬化、淋巴功能降低、梗阻性黄疸、肝衰竭的比率增加以及死亡率增加。虽然这些疾病发病的机理尚未完全确定，但伴随TPN产生的胆汁郁积、胆囊排空、胆汁流量和胆汁酸分泌的降低一直与TPN-AC和其它TPN相关综合征的发病机理有关。通过促进胆的收缩和排空，给予TPN患者辛卡利特可帮助治疗和预防与延长性TPN-相关的疾病及其它综合征。对于TPN患者，一般用10分钟IV给予0.05μg/kg为日输注剂量。治疗婴儿高胆红素水平时，剂量为0.02μg/kgIV或IM，每日2或3次，同时剂量可增加至0.32μg/kg。CCK不仅诱发GB收缩，还增加肝内胆汁流量。有关TPN患者的治疗方面的信息在诸如以下文献中提供，Sitzmann，JV.等，缩胆囊素抑制人体肠道外营养诱发的胆汁淤积(Cholecystokininpreventsparenteralnutritioninducedbiliarysludgeinhumans.)，Surg.Gynecol.Obstet.17025-31，1990；MossRL.等，清楚了解全肠外营养相关胆汁郁积的病因和治疗的新途径(Newapproachestounderstandingtheetiologyandtreatmentoftotalparenteralnutrition-associatedcholestasis)，Surg.Gynecol.Obstet.Vol.8140-147，1999；TeitelbaumDH.等，用缩胆囊素-八肽治疗与胃肠外营养相关的胆汁郁积(Treatmentofparenteralnutrition-associatedcholestasiswithcholecystokinin-octapeptide)，J.Pediatr.Surg.301082，1995；TeitelbaumDH.全肠外营养相关的胆汁郁积(Parenteralnutrition-associatedcholestasis)，CurrentOpinioninPediatrics1997，9270-275；TeitelbaumDH.等，全肠外营养相关的胆汁郁积(Parenteralnutrition-associatedcholestasis)，SeminarsinPediatricSurgeryVol.10pp.72-80。通过下列实施例说明本发明，这些实施例并不在任何方面构成对本发明的限定。实施例1缓冲剂和制剂pH对辛卡利特制剂的影响进行实验以测定pH对辛卡利特化学稳定性的影响。化学不稳定性或降解可能由例如氧化、还原、脱酰胺、水解、酰亚胺形成、外消旋化、异构化和/或β-消除引起。为考察磷酸盐缓冲液中pH对辛卡利特的影响，在35mM磷酸盐缓冲液中制备辛卡利特溶液(约1.7μg/mL)，用稀HCl或NaOH调节pH，使最终的各pH值在3.0-9.1范围内。采用反相HPLC(RP-HPLC)梯度洗脱，在215nm下进行UV检测，通过测定在pH调整后0、6和24小时时辛卡利特回收率评定辛卡利特在溶液中的稳定性。表3中概括辛卡利特在pH3.0-9.1范围内的磷酸盐缓冲液中24小时稳定性的研究结果，并且还在图5中图标给出。通过测定辛卡利特回收率可知，辛卡利特在pH5.0-9.1范围内的35mM磷酸盐缓冲液中24小时内是稳定的。当pH值＜5.0时，甚至在开始时间点处即出现辛卡利特降解。表3.35mM磷酸盐缓冲液中辛卡利特的pH研究结果基于表3中显示的结果，选择磷酸盐作为选择的缓冲剂，原因是磷酸盐与辛卡利特不发生相互作用并且在生理pH范围内具有理想的缓冲能力。随后在以上确立的稳定的pH范围内，在表4中所示的制剂中应用磷酸盐进行实验。简言之，制备含有下列组分(表4中标明浓度)的辛卡利特溶液辛卡利特、D-甘露糖醇、L-精氨酸、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸、焦亚硫酸钠、多乙氧基醚20、喷替酸和磷酸氢二钾。表4.实施例1辛卡利特制剂的组分用稀HCl或NaOH调节溶液的pH至5.5-8.5，通过采用如上所述的RP-HPLC进行梯度洗脱，在215nm下进行UV检测，在pH调整后0、4和8小时测定辛卡利特回收率，对稳定性进行评估。表5中概括对以上制剂中辛卡利特在pH5.5-8.5范围内稳定性的8小时研究的结果，并在图6中图标说明。表5.本发明优选的辛卡利特制剂的pH研究结果在所研究的pH范围内，没有观察到初始辛卡利特回收中明显的pH依赖性相关趋势。辛卡利特回收率随时间的任何波动可能归因于正常的测定可变性，并不是降解。该制剂中辛卡利特的稳定性通过辛卡利特相关降解物的存在的色谱方面的分析进一步证实，在8小时的研究中，在pH5.5-8.5之间，辛卡利特相关降解物维持在1.2-1.6％(杂质指数)。制备一批含有25mM磷酸盐(作为缓冲剂)、最终pH值为6.8(范围6.7-6.9)的辛卡利特制剂的溶液。用5mL水重构的所述冷冻干燥物与所述药品中的10mM磷酸盐等同。该资料表明在生理学上可容许的pH范围内溶液的稳定性，并支持重构辛卡利特的优选pH为6.0-8.0。实施例2螯合剂对辛卡利特制剂的影响如图1中所示，辛卡利特的氨基酸组分包括两个甲硫氨酸(Met)残基，它们在结构序列中被称为Met3和Met6。进行试验测定是否这些残基易于受到游离金属的氧化作用。这些实验还考察了作为制剂赋形剂的DTPA螯合金属由此抑制辛卡利特氧化的作用。图2-4表明含有单或二亚砜的辛卡利特的三种氧化形式。如表6中所示，制备含有1mMDTPA(0.39mgDTPA/mL)和不含DTPA的pH6.5-7.0的试验制剂(无氨基酸)，以评估由于金属存在的潜在的氧化作用。表6.实施例2中使用的辛卡利特制剂(无氨基酸)加入9种金属离子分别对含有(+)或不含(-)DTPA的所述试验制剂(25mL)溶液进行测试(spiked)，结果在表7中概括。表7.金属离子对辛卡利特氧化作用的评估通过采用如上所述的RP-HPLC进行梯度洗脱，在215nm下进行UV检测，在8小时内分析所述含金属溶液中的辛卡利特及相关氧化的形式。图7给出在DTPA存在和不存在下9种金属对亚砜(Met3和Met6)形成的影响。这些资料显示除Cr3+外，在某些金属的存在下并在无DTPA存在下，辛卡利特Met3和Met6单亚砜的量增加，然而DTPA的存在具有抑制辛卡利特Met3和Met6单亚砜形成的作用。在无DTPA存在下，铜和锰对辛卡利特的各甲硫氨酸残基具有最大的氧化作用，使Met3和Met6单亚砜的合并重量百分比(与辛卡利特相比)分别为85.5和128.9。除存在辛卡利特的Met3和Met6单亚砜(tR≈14.8min.{双峰}和tR≈18min.)，在铜和锰情况下，还表明有辛卡利特的二亚砜形成(tR≈6.5min.)，但其它金属存在时未出现。用铜或锰并在有或无DTPA下实验得到的制剂的色谱图也支持这一结论。所述色谱图的分析表明1mM(0.39mgDTPA/mL)的DTPA水平保护辛卡利特不被金属催化氧化为亚砜。由于痕量金属经常以赋形剂杂质和/或在可带入的柱塞出现于制剂中，该研究结果支持使用喷替酸(DTPA)作为制剂赋形剂以螯合痕量水平的游离金属，从而降低辛卡利特甲硫氨酸单或二亚砜的形成，抑制溶液中辛卡利特的降解。制备含有2mgDTPA/小瓶的辛卡利特制剂，其与用5mL水重构下的1mM浓度等同。实施例3表面活性剂对辛卡利特制剂的影响在对由填充剂/张力调节剂、缓冲剂、盐、螯合剂和辛卡利特组成的新制剂的初步开发研究过程中，HPLC分析发现在本体溶液中活性药物成分辛卡利特的回收率对空气中敞开放置敏感。例如，当用反相梯度洗脱的HPLC在215nm下进行UV检测以监测辛卡利特含量时，在装有2mL本体溶液搅拌的无塞小瓶中或者开口空气中放置17小时，观察到辛卡利特的回收率基本有50-60％的降低。虽然在某种程度上，该辛卡利特的降低归因于辛卡利特单或二亚砜降解物的增加，但这些仅代表所示降低的极少量的百分比。因此，认为该回收率的降低归因于吸收/变性或空气/液体界面作用。为最大限度地降低与表面吸收有关的辛卡利特的降解，在辛卡利特的原料药或冷冻干燥制剂中加入作为制剂赋形剂的表面活性剂。应用不同浓度的非离子表面活性剂多乙氧基醚80(TWEEN80)，制备由填充剂/张力调节剂(D-甘露糖醇)、缓冲剂(磷酸二氢钾和磷酸氢二钾)、调节张力的盐(氯化钠/钾)、螯合剂(喷替酸)和活性成分(辛卡利特)组成的辛卡利特制剂。将本体溶液和重构冷冻干燥样品或者立即用塞封闭或者无塞放置17小时，通过反相梯度洗脱的HPLC在215nm下测定辛卡利特回收率。如表8中所示，TWEEN80在暴露于空气的制剂中的作用更加明显。对于本体溶液和重构冷冻干燥制剂，当与含有1mg/mL浓度的TWEEN80的对应制剂相比较时，资料显示辛卡利特回收率分别降低约50％和约20％。在无TWEEN80的密闭本体溶液和重构冷冻干燥制剂中的低辛卡利特回收率也是明显的，但与暴露制剂的基本约4-8％比较并不接近。这些TWEEN80浓度的影响的初筛研究表明＜1mg/mL本体溶液的最为适合。表8.有和无TWEEN80下制剂中辛卡利特回收率为比较两种非离子表面活性剂的作用，采用不同量的TWEEN20或TWEEN80制备辛卡利特制剂(75mg/mLD-甘露糖醇、6.0mg/mLKCl、3.25mg/mLKH2PO4、1.0mg/mLK2HPO4、1.0mg/mLDTPA、0.0025mg/mL辛卡利特(本体溶液制剂))。实验结果在表9中给出。表9.表面活性剂对辛卡利特回收率的影响如表9中所示，当与无表面活性剂的制剂比较时，资料表明痕量水平(2.5-7.5μg/mL)TWEEN80或TWEEN20的存在对辛卡利特回收率有益。但是，含有TWEEN20制剂的辛卡利特回收率(98-102％)比含有TWEEN80制剂的回收率(95-98％)相应较高，因此TWEEN20为优选的表面活性剂。依据暴露于空气和密闭的本体溶液制剂两者中辛卡利特回收率，另进行试验确证TWEEN20的浓度的影响。表10中给出采用反相梯度洗脱HPLC测定在开口或密封小瓶中储存的含有不同痕量水平的TWEEN20的本体溶液制剂(75.0mg/mLD-甘露糖醇、6.0mg/mLKCl、3.25mg/mLKH2PO4、1.0mg/mLDTPA、0.0025mg/mL辛卡利特)的辛卡利特回收率。表10.TWEEN20浓度对本体溶液制剂中辛卡利特回收率的影响如表10中所示，含有TWEEN20的本体溶液制剂比不含TWEEN20的制剂具有较高的辛卡利特回收率，并且辛卡利特回收率与所研究的TWEEN20浓度范围(2.5-7.5μg/mL)无关。另外，由于含有TWEEN20的开口和封闭制剂具有相等的辛卡利特回收率，可消除辛卡利特回收率相对于空气的敏感性。虽然这些资料支持使用TWEEN20，但注意到含有浓度为5μg/mLTWEEN20的2mL填充小瓶在剧烈搅拌下在重构产品中呈现轻微泡沫。为减少泡沫，评估采用较低的TWEEN20浓度。如表11中所示，对冷冻干燥产品进行实验，以比较含有TWEEN20(2.5ng/mL)和不含TWEEN20的制剂中辛卡利特的回收率。在该实施例以及后续实施例中，甘露糖醇指D-甘露糖醇，甲硫氨酸指L-甲硫氨酸，精氨酸指L-精氨酸单盐酸盐，赖氨酸指L-赖氨酸单盐酸盐。表11.有和无TWEEN20下重构制剂中辛卡利特回收率将TWEEN20的量降低至最小的痕量浓度(2.5ng/mL)还能对空气/液体界面产生明显的作用，并能消除制剂中的泡沫。对结果进行的统计双尾t-试验表明在制剂的2.5ng/mL和无TWEEN20之间存在明显著差异(P＜0.05)。基于这些资料，通过增加辛卡利特回收率从而维持制剂中辛卡利特含量，确立了TWEEN20(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯)作为表面活性剂的作用。优选的辛卡利特制剂包括作为痕量赋形剂的非离子表面活性剂TWEEN20，其浓度为2.5ng/mL本体溶液制剂，相当于重构为5mL时终产物中的1ng/mL。实施例4抗氧化剂对辛卡利特制剂的影响进行试验以评估加入用以阻止辛卡利特制剂(实施例4的制剂含有85mg/mL甘露糖醇、0.005mg/mLTWEEN20、2.75mg/mLKH2PO4、1.0mg/mLDTPA、2.0mg/mL甲硫氨酸、7.5mg/mL赖氨酸、15mg/mL精氨酸、0.0025mg/mL辛卡利特(本体溶液制剂)，除安慰剂组不含辛卡利特外)中的辛卡利特氧化作用的作为稳定剂的抗氧化剂。研究辛卡利特甲硫氨酸(Met3或Met6)单亚砜、脱硫化辛卡利特和未知降解物的形成。根据焦亚硫酸钠、抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、硫酸钠、苯扎氯铵和苄索氯铵对辛卡利特回收率和辛卡利特相关杂质的影响，通过HPLC评估它们在抑制辛卡利特的降解中的功效。对开口和密封辛卡利特制剂进行15小时试验，以评估各种抗氧化剂对辛卡利特的稳定作用的影响。将各抗氧化剂以10μg/mL的浓度分别加入到除抗氧化剂外含有所有制剂成分的水重构冷冻干燥的辛卡利特制剂中。将加入抗氧化剂或未加入抗氧化剂的溶液混合，再分离，然后暴露于空气或密闭15小时。通过反相HPLC进行梯度洗脱，在215nm下进行UV检测，监测辛卡利特和总辛卡利特相关杂质，以比较所述抗氧化剂的功效。如表12中所示，这些浓度的资料表明苯扎氯铵和苄索氯铵对辛卡利特具有明显的使之不稳定作用，而抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽和硫酸钠与对照制剂(无抗氧化剂)基本等同。在所有考察的辛卡利特制剂/抗氧化剂组合中，具有10μg焦亚硫酸钠的制剂在8小时中呈现最高的辛卡利特含量(98.3％)，15小时中呈现最低的总辛卡利特相关杂质(1.79％)。因此，焦亚硫酸钠是本发明制剂的优选抗的氧化剂。表12.各种抗氧化剂(10μg/mL)对辛卡利特制剂稳定性的影响如表13中概括，为最优化制剂中焦亚硫酸钠的水平，制备含有四个水平的焦亚硫酸钠(0、10、30和60μg/小瓶)的冷冻干燥辛卡利特制剂。在无热应力和热应力(65℃，64h)储存条件下，保持各浓度的样本，然后通过HPLC测定含量。测定“％辛卡利特”，并监测作为辛卡利特氧化作用指征的“％(Met6)单亚砜”(tR≈19.7min)。资料在表14中给出。表13.辛卡利特冷冻干燥制剂表14.焦亚硫酸钠浓度对辛卡利特氧化的影响加入最高达60μg/小瓶的焦亚硫酸钠能改善辛卡利特回收率，并能在热应力条件下抑制辛卡利特氧化为其(Met6)单亚砜衍生物。基于以上资料，由于不存在明显的浓度关系，选择40μg/小瓶焦亚硫酸钠作为所述终制剂的优选浓度，分别采用30μg/小瓶和60μg/小瓶作为下限和上限。在长期加速存储条件下，利用含有最适浓度(40μg/小瓶)焦亚硫酸钠的辛卡利特制剂进行另一项实验，以确证对辛卡利特降解的保护作用。将同一批次中的含和不含所述抗氧化剂的辛卡利特冷冻干燥制剂在40℃和60℃下施加热应力6周。也将同一批次中的不含辛卡利特的制剂在40℃下施加热应力8个月。HPLC分析％辛卡利特和％总杂质的结果在表15中给出。表15.焦亚硫酸钠对热应力力相关杂质的影响该长期加速存储实验的结果进一步强调需要存在赋形剂焦亚硫酸钠。与呈现出数种辛卡利特热应力相关杂质升高的不含抗氧化剂的辛卡利特制剂(6.56％)相比，含有焦亚硫酸钠(40μg/小瓶)的辛卡利特制剂能阻止辛卡利特热应力相关降解物的形成(3.30％)。由于这些杂质在无辛卡利特的制剂的色谱图中未出现，所以确证这些杂质为辛卡利特热应力相关杂质(tR＝35-44min)。由于焦亚硫酸钠在抑制辛卡利特的氧化以及热应力相关的降解中提供超级的保护作用，所以与抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、硫酸钠、苯扎氯铵和苄索氯铵相比，选择焦亚硫酸钠作为优选的抗氧化剂和稳定剂。所述冷冻干燥制剂中焦亚硫酸钠的优选浓度为40μg/小瓶或者在所述重构产品中为8μg/mL。实施例5填充剂/张力调节剂的选择由于本发明制剂中所述活性药物成分(API)辛卡利特的量很小(5μg/小瓶)，所以考虑使用填充剂特别益于提供张力以及提供对所述API的构造和支持。进行实验以选择和最优化本发明的辛卡利特制剂中的填充剂。评估标准如下增强冷冻干燥循环的效率、能得到药学上优质的终产品、增强产品溶解度并能用作重构产品的等渗调节的赋形剂。可以考虑各种浓度的乳糖、乳糖/氯化钠和甘露糖醇，根据产品饼块的外观、同渗质量摩尔浓度、溶解率、热分析(包括冷冻干燥显微镜的使用以及测定相对于温度的电阻)，评估含有这些赋形剂的实验批次。实验制剂批次A成分乳糖375mg/小瓶、Na2HPO412.0mg/小瓶、DTPA2.0mg/小瓶、NaH2PO419.5mg/小瓶和0.005mg/小瓶辛卡利特。批次C1-3成分甘露糖醇170mg/小瓶、K2HPO49.0mg/小瓶、TWEEN20＜0.01mg/小瓶、甲硫氨酸4.0mg/小瓶、赖氨酸15.0mg/小瓶、精氨酸30.0mg/小瓶、焦亚硫酸钠0.04mg/小瓶、辛卡利特0.005mg/小瓶和DTPA2.0mg/小瓶。批次D1成分乳糖150mg/小瓶、K2HPO49.1mg/小瓶、DTPA2.0mg/小瓶、NaH2PO49.8mg/小瓶和NaCl21.0mg/小瓶。批次E1成分乳糖200mg/小瓶、Na2HPO47.5mg/小瓶、DTPA2.0mg/小瓶和NaCl17mg/小瓶。批次F1-2F1成分甘露糖醇250mg/小瓶、Na2HPO47.5mg/小瓶、DTPA2.0mg/小瓶和辛卡利特0mg/小瓶；和F2成分甘露糖醇206mg/小瓶、Na2HPO47.5mg/小瓶、DTPA2.0mg/小瓶和辛卡利特0.005mg/小瓶。批次H1-2H1成分甘露糖醇180mg/小瓶、Na2HPO46.0mg/小瓶、辛卡利特0mg/小瓶、NaCl5mg/小瓶和DTPA2.0mg/小瓶；和H2成分甘露糖醇l50mg/小瓶、K2HPO44.5mg/小瓶、辛卡利特0.005mg/小瓶、NaCl10mg/小瓶和DTPA2.0mg/小瓶。批次I1-2I1成分甘露糖醇140mg/小瓶、K2HPO45.5mg/小瓶、TWEEN200.01mg/小瓶、甲硫氨酸4.0mg/小瓶、赖氨酸60.0mg/小瓶、辛卡利特0.005mg/小瓶和DTPA2.0mg/小瓶；和I2成分甘露糖醇170mg/小瓶、K2HPO45.5mg/小瓶、TWEEN200.01mg/小瓶、甲硫氨酸4.0mg/小瓶、赖氨酸30.0mg/小瓶、辛卡利特0.005mg/小瓶和DTPA2.0mg/小瓶。批次J成分甘露糖醇170mg/小瓶、K2HPO48.5mg/小瓶、TWEEN200.01mg/小瓶、甲硫氨酸4.0mg/小瓶、赖氨酸15.0mg/小瓶、精氨酸30.0mg/小瓶、焦亚硫酸钠0.04mg/小瓶、辛卡利特和DTPA2.0mg/小瓶。方法1.外观目测所述冷冻干燥的块状物(plug)。2.同渗质量摩尔浓度通过蒸气压同渗质量摩尔浓度计测定。3.溶解性通过在检测灯下观察用5mL水重构时的溶解时间测定。4.热分析a.测定相对于温度的电阻采用专利电阻测定仪测定电阻，采用32-标准规格T型热电偶测定温度。b.冷冻干燥显微镜采用冷冻干燥显微镜，一种Infinivar显微镜和彩色照相机进行。在初步研究中，采用乳糖作为填充剂/张力调节剂。表16中所列的制剂是基于3mL充填体积的制剂，其带有高浓度的能使重构产品达到等渗的乳糖。该制剂用5mL水重构时的同渗质量摩尔浓度大约为300mOsm/kg。表16.含乳糖的辛卡利特制剂(A批)冷冻干燥循环为130小时(约5.4日)的批次A的试验制剂显示冷冻干燥饼块中熔回的现象，其重构溶解的时间为≥9分钟。具有较差饼块形成的小瓶的大量出现和所需的较长的冷冻干燥循环归因于该本体溶液制剂中相对其溶解度的高浓度的乳糖(125mg/mL)以及小瓶中较大的填充体积(3mL)。进行研究通过使用其它赋形剂氯化钠修饰所述最初的乳糖制剂，降低乳糖浓度，并将填充体积从3mL降至2mL，从而减少循环时间并改善产品外观/溶解性。表17.含乳糖/NaCl的辛卡利特制剂(D1和E1-2批)使用NaCl使同渗质量摩尔浓度值在240-270mOsm/kg范围内的产品等渗，同时允许降低乳糖的浓度。改变乳糖、氯化钠和磷酸钠的量能使冷冻干燥循环从130小时降低至96小时，但却不能持续改善该冷冻干燥饼块的外观。对具有不同乳糖/氯化钠比率的两种实验制剂的热分析(表18)确证这些制剂的相对长的冷冻干燥循环归因于低的初始干燥温度-38℃至-42℃范围，从而导致这些温度下较慢的升华率。除冷冻循环长外，低的初始干燥温度导致瓶-瓶变化的增加以及与溶解度方面有关的块状物外观变差风险的增加。表18.实验性乳糖/NaCl制剂的热分析然后选择一种冷冻干燥药物常用的赋形剂-甘露糖醇对其作为填充剂进行评估，原因是甘露糖醇/冰低共熔混合物的高熔点温度(约-1.5℃)以及其易于从冷冻的水溶液中结晶。理想上这些特性能使初始干燥时间和第二步的干燥时间缩短，从而促进冷冻干燥循环的效率并提供物理性能上稳定的、药学上可接受的优质的冷冻干燥固体。制备一些批次的实验规模的2mL填充体积的制剂，其中用D-甘露糖醇代替乳糖，同时保持等渗度，以评估循环时间和初始干燥温度的参数以及该固体饼块的溶解度。冷冻干燥循环参数以及5mL重构体积的冷冻干燥产品重构的时间见表19中所示。表19.制剂填充剂/张力调节剂对冷冻干燥循环最佳化条件及重构/溶解时间的影响将低温干燥循环时间从乳糖制剂的＞130小时降低至所述甘露糖醇制剂(F2批)的约69小时。两批制剂的饼块(F1和F2)溶解于5mL水中的时间范围都大约相同，为＜1分钟。初始干燥温度从批次F1的-34℃增加至批次F2的-25℃，产生了将整体循环时间从85小时降低至69小时的理想效果。另进行实验以最优化2mL填充体积制剂的甘露糖醇的浓度和低温干燥时间。将这些研究与重构后调节同渗质量摩尔浓度至约250mOsm/kg的制剂开发研究同步进行，以通过向所述制剂中加入其它赋形剂稳定所述肽(表20)。表20.甘露糖醇浓度对辛卡利特制剂的外观、溶解度和冷冻干燥循环的影响ND＝未测定这些结果表明最初干燥温度从约-25℃至-8至-12℃范围内的增加明显使循环时间从69小时降低至30小时，并能产生在1分钟内重构的固体干燥饼块。设计增强辛卡利特长期稳定性的其它最优化研究得出含有以下其它赋形剂(单位mg/小瓶)的具有170mg小瓶D-甘露糖醇/小瓶的优选的辛卡利特制剂TWEEN20(0.01)、K2HPO4(8.5)、甲硫氨酸(4.0)、赖氨酸(15.0)、精氨酸(30.0)、DTPA(2.0)和焦亚硫酸钠(0.04)。当用5mL水重构时，该最优化制剂的同渗质量摩尔浓度大约为300mOsm/kg。采用冷冻干燥显微镜和测定相对于温度的电阻对该制剂进行的热分析表明为达到可接受的产品质量，产品最初干燥温度的上限为-13℃至-15℃。为证实所有的发现，制备2mL/小瓶填充体积的三批(C1-3)实验规模的优选的辛卡利特制剂，在扩大规模生产的干燥器中冷冻干燥，以证明可将生产过程从研制设备转移至生产性设备。这些批次的干燥循环采用的初始干燥温度为-12℃±3℃，整个循环时间为53-61小时(表21)。表21.用甘露糖醇作为填充剂制备实验规模批次的操作参数和终产品性能这些研究资料支持选择甘露糖醇作为特别优选的填充剂，优选的用量约为170mg/小瓶。采用该浓度，当填充2-mL填充体积时，所述冷冻干燥循环为53-61小时。终产品为药学上优质的、白色固体饼块，其可用5mL水在1分钟内进行重构成，得到的溶液的同渗质量摩尔浓度大约为300mOsm/kg。实施例6氨基酸对辛卡利特制剂的影响在制剂研究中发现大规模生产中制剂中辛卡利特含量(potency)降低所涉及的主要方面是暴露于空气和冷冻干燥。含量降低是表面吸收/变性的结果，其由辛卡利特暴露于空气中所致，通过氧化导致降解。冷冻干燥过程中辛卡利特制剂暴露于热应力力下也导致降解，并降低辛卡利特的回收率。进行实验以评估数种氨基酸作为辛卡利特潜在稳定剂的效能，其包括非极性(疏水性)甲硫氨酸残基、天门冬氨酸和谷氨酸、极性甘氨酸和半胱氨酸残基以及碱性赖氨酸和精氨酸。除另有指明外，试验各种氨基酸效能的本实施例中所用的制剂包含下列组分(本体溶液)75.0mg/mL的甘露糖醇；3.25mg/mL的KH2PO4；1.0mg/mL的K2HPO4；1.0mg/mL的喷替酸(DTPA)；5.0mg/mL的NaCl；和所述活性肽辛卡利特(0.0025mg/mL)。首先，对重构制剂评估非极性氨基酸L-甲硫氨酸，原因是甲硫氨酸残基可用作内源性抗氧化剂，或者通过与羟基游离基和其它活性氧种类反应作为清除剂。因此，甲硫氨酸通过为辛卡利特提供保护或抗氧化作用并优选被氧化，可改善辛卡利特制剂的处理过程的稳定性。下表22概括当将不同量的L-甲硫氨酸加入到含有甘露糖醇、氯化钠、磷酸钾和喷替酸的制剂中，实验制剂暴露于空气中得到的结果。在这些实验中，使用开口或封闭小瓶中的液体制剂模拟产品的处理。对于开口小瓶中的制剂，辛卡利特的回收率改善约60％，该本体溶液中辛卡利特相关杂质的浓度随甲硫氨酸水平的降低从0.0增加至2.0mg/mL。表22.甲硫氨酸作为本体溶液制剂加工稳定剂的评估-开口小瓶与闭口小瓶的比较为比较非极性氨基酸甲硫氨酸作为潜在的处理过程稳定剂的功能，也对极性氨基酸如甘氨酸和半胱氨酸进行评估。使含有这些氨基酸的制剂在开口小瓶中暴露于空气，并与封闭小瓶中的产品相比较。根据辛卡利特回收率和辛卡利特相关杂质，将这些氨基酸的效能与以上在甲硫氨酸存在下所述液体制剂中观察到的改善情况相比较。表23中给出含有不同浓度甲硫氨酸、半胱氨酸或甘氨酸的试验制剂的辛卡利特回收率。表23.甲硫氨酸、甘氨酸和半胱氨酸作为本体溶液制剂加工稳定剂的比较-开口小瓶与闭口小瓶比较结果表明当将各制剂在开口瓶中暴露于空气时，无论向含有甘露糖醇、磷酸钾、氯化钠和喷替酸的本体溶液制剂中加入半胱氨酸或甘氨酸都不能对辛卡利特杂质水平的降低或辛卡利特回收率的提高显示明显的作用。碱性氨基酸赖氨酸是下一个评估其在本发明辛卡利特制剂中的用途的氢基酸。如表24中所示，制备含有各种浓度赖氨酸的试验制剂(70-85mg/mL的甘露糖醇、0.005mg/mL的TWEEN20、2.75mg/mL的KH2PO4、1.0mg/mL的DTPA、2.0mg/mL的甲硫氨酸、0.0025mg/mL的辛卡利特)，然后评估辛卡利特回收率。表24赖氨酸在辛卡利特重构制剂中作为稳定剂的评估NA＝不适用加速储存后，与不含有赖氨酸的冷冻干燥对照制剂相比，含有赖氨酸的冷冻干燥制剂明显能改善辛卡利特的回收率。在40℃下储存3和5周后，含有赖氨酸的制剂分别能使辛卡利特的回收率改善50％和75％，由此表明赖氨酸能增强冷冻干燥制剂经受热应力力下的稳定性。甲硫氨酸和赖氨酸存在下观察到的改善的辛卡利特回收率提示其它氨基酸也可能适于用作所述重配制制剂中的填充添加剂。因此，继续对两种酸性氨基酸，天冬氨酸和谷氨酸，进行评估来研究制剂。表25中给出含有以下量赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸的试验制剂(85.0mg/mL的甘露糖醇、0.005mg/mL的TWEEN20、2.75mg/mL的KH2PO4、1.0mg/mL的DTPA、2.0mg/mL的甲硫氨酸、0.0025mg/mL的辛卡利特)的辛卡利特回收率。表25赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸在辛卡利特重构制剂中作为稳定剂的比较NA＝不适用结果表明随着在40℃下储存时间的增加，赖氨酸比天冬氨酸和谷氨酸能持续提供更好的保护作用。赖氨酸得到的结果还提示另一种碱性氨基酸-精氨酸本身或赖氨酸与精氨酸潜在的某些组合可能进一步增强冷冻干燥和热应力力期间的保护作用。制备含有不同浓度赖氨酸、精氨酸或赖氨酸与精氨酸组合的辛卡利特制剂(85.0mg/mL的甘露糖醇、0.005mg/mL的TWEEN20、2.75mg/mL的KH2PO4、1.0mg/mL的DTPA、2.0mg/mL的甲硫氨酸、0.0025mg/mL的辛卡利特)，评估辛卡利特回收率(表26)。表26.赖氨酸和精氨酸在辛卡利特重构制剂中作为稳定剂的评估NA＝不适用，ND＝未测定结果证实在冷冻干燥及65℃下热应力64小时后，观察到含有赖氨酸、精氨酸或两者组合的辛卡利特制剂的辛卡利特回收率大约有50-70％的提高。含赖氨酸和精氨酸两者的制剂呈现出最高的辛卡利特回收值，其表明在热应力储存条件下，这两种氨基酸的组合能提供特别稳定化的作用。7.5mg/mL赖氨酸和15.0mg/mL精氨酸的中点组合适合于保护所述冷冻干燥和热应力力产品，其辛卡利特回收率＞95％。与极性氨基酸(如甘氨酸和半胱氨酸)和酸性氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)相比，甲硫氨酸、赖氨酸和精氨酸优选用作本发明辛卡利特制剂的稳定剂。甲硫氨酸能改善所述制剂的加工稳定性，从而提高辛卡利特的回收率，赖氨酸和精氨酸的组合能增强冷冻干燥和热应力力期间产品的稳定性，从而提高辛卡利特的回收率。本发明冷冻干燥制剂中优选的浓度为甲硫氨酸(4.0mg/瓶)、赖氨酸(15.0mg/瓶)和精氨酸(30.0mg/瓶)。实施例7重构贮存期的研究A.小瓶内重构后的稳定性根据室温下8小时内辛卡利特外观、溶解度、颗粒物质、颜色、pH、辛卡利特测定、脱硫化的辛卡利特测定以及其它辛卡利特相关杂质，进行试验测定辛卡利特重构后的稳定性。用5.0mL纯化水重构源自辛卡利特制剂的三个批次的105-L实验规模的冷冻干燥的小瓶。在重构后0、2、4、6和8小时，测试外观、溶解度、颗粒物质、颜色和pH。在重构后0、4和8小时，采用反相HPLC方法，应用梯度洗脱，在215nm下UV检测，一式两份进行小瓶中辛卡利特含量测定、脱硫化的辛卡利特测定以及其它辛卡利特相关杂质。三批辛卡利特制剂在重构后0、2、4、6和8小时时进行的外观、溶解度、颗粒物质、颜色和pH的实验结果在表27中给出。表27.重构后试验结果从所测定的这三批制剂(在此称为制剂A、B和C)来看，在所测试的参数中未发现变化，在8小时的测试期间内，所有结果均符合规定(85mg/mL的甘露糖醇；2.5×10-6mg/mL的TWEEN20；4.5mg/mL的KH2PO4；1.0mg/mL的DTPA；0.02mg/mL的焦亚硫酸钠；2.0mg/mL的甲硫氨酸；7.5mg/mL的赖氨酸；15.0mg/mL的精氨酸；0.0025mg/mL的辛卡利特(本体溶液制剂))。在重构后0、4和8小时，对这三批制剂测定的辛卡利特含量、脱硫化的辛卡利特含量以及其它辛卡利特相关杂质的HPLC试验结果在表28中所示。表28.重构后HPLC试验结果所有结果均符合规定。辛卡利特效能未随时间变化。脱硫化的辛卡利特以及其它辛卡利特相关杂质仅显示出无明显意义的相对较小的增加，其各自的规定分别为2％和5％。该研究显示重构辛卡利特制剂的最初试验值可代表重构产品的8小时贮存期中得到的结果。所提供的数据表明该制剂的重构后的稳定性，并支持在环境条件下8小时的重构后的贮存期。B.重构后稀释度的研究进行试验测定已重构和稀释的本发明辛卡利特制剂的稳定性。用5mL水重构源自本发明辛卡利特制剂的三个105-L批次的小瓶，每批2份。将小瓶内容物定量转移(用USP氯化钠注射液漂洗)至100mL容量瓶中，用USP氯化钠注射液将最高至8.4mL的所述制剂稀释至体积(100mL)。配制后1小时测定辛卡利特含量、pH和可见的外观。测定结果在表29中给出。表29.用0.9％盐水重构辛卡利特制剂至100mL1小时后的结果重构后1小时测定的稀释样本(将重构小瓶内容物进一步稀释至100mL)的所有辛卡利特含量、pH和外观均符合重构产品(用5mL水配制小瓶内容物)的产品要求。实施例8HPLC法测定辛卡利特含量建立一种HPLC方法，依此验证KINEVAC中辛卡利特含量的测定、脱硫化的辛卡利特杂质的定量以及辛卡利特有关杂质指数的测定。该方法适合于测定当插入每批产包装以重构时KINEVAC的重构的稳定性。该反相方法应用C18(5μm，300)柱，用由0.15％三氟乙酸水溶液(溶剂A)和0.125％三氟乙酸的乙腈溶液(溶剂B)组成的的流动相成分梯度洗脱，在215mUV检测。图12显示用5mL水重构的冷冻干燥的重配制的KINEVAC的全范围和放大范围的色谱图，结果得出辛卡利特浓度为1μg/mL。其它实施方案虽然通过优选的实施方案已对本发明进行了说明，但本领域技术人员能很容易地清楚其基本的特征，在不背离本发明的精神和范围下可以对本发明进行各种改变和修饰，以使其适合各种用途和条件。本领域技术人员将能识别或能清楚除采用仅仅的常规试验外，很多实施方案等同于在此说明的本发明的各具体实施方案。本发明的范围涵盖这些等同方案。本说明书中提及的所有出版物、专利和申请均通过引用结合到本发明中。权利要求1.一种辛卡利特的稳定的、生理学上可接受的制剂，它包括(a)有效量的辛卡利特，(b)至少一种稳定剂，(c)表面活性剂/加溶剂，(d)螯合剂，(e)填充剂/张力调节剂，以及(f)缓冲剂。2.权利要求1的制剂，其pH范围为6.0-8.0。3.权利要求1的制剂，其中所述缓冲剂选自磷酸、磷酸盐、柠檬酸、柠檬酸盐、磺基水杨酸盐、乙酸、乙酸盐、甲基硼酸、硼酸盐、六水合琥珀酸二钠、一或多种氨基酸、乳酸、乳酸盐、马来酸、马来酸盐、氯化钾、苯甲酸、苯甲酸钠、碳酸、碳酸盐、碳酸氢盐、硼酸、硼酸盐、氯化钠、琥珀酸、琥珀酸盐、酒石酸、酒石酸盐、三-(羟甲基)氨基甲烷和生理缓冲液。4.权利要求1的制剂，其中所述缓冲剂为磷酸盐缓冲剂。5.权利要求4的制剂，其中所述缓冲剂为磷酸氢二钾。6.权利要求1的制剂，其中所述表面活性剂/加溶剂选自阴离子表面活性剂、普朗尼克类、泊洛沙姆、SDS、Triton-100、多乙氧基醚、丙二醇、PEG和类似的化合物、Brij589聚(氧乙烯基)20十六烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)、二甲基乙酰胺(DMA)、NP40(NonidetP-40)，及N-甲基-2-吡咯烷酮(Pharmasolve)和氨基酸。7.权利要求1的制剂，其中所述表面活性剂为非离子表面活性剂。8.权利要求7的制剂，其中所述非离子表面活性剂为多乙氧基醚。9.权利要求7的制剂，其中所述非离子表面活性剂为多乙氧基醚20或多乙氧基醚80。10.权利要求1的制剂，其中所述稳定剂选自抗氧化剂和氨基酸。11.权利要求10的制剂，其中所述稳定剂为抗氧化剂。12.权利要求11的制剂，其中所述稳定剂为焦亚硫酸钠。13.权利要求1的制剂，其中所述制剂包含多种稳定剂。14.权利要求13的制剂，其中所述稳定剂包括L-精氨酸单盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸单盐酸盐和焦亚硫酸钠。15.权利要求1的制剂，其中所述填充剂/张力调节剂选自甘露糖醇、氨基酸、乳糖、氯化钾、氯化钠、麦芽糖、蔗糖、PEG’s、海藻糖、棉子糖、葡萄糖、环糊精、葡聚糖、半乳糖醛酸、Ficoll和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。16.权利要求15的制剂，其中所述填充剂/张力调节剂为D-甘露糖醇。17.权利要求1的制剂，其中所述螯合剂为喷替酸(DTPA)。18.权利要求17的制剂，其中所述螯合剂为喷替酸，所述表面活性剂为多乙氧基醚20，所述缓冲剂为磷酸氢二钾，及所述填充剂/张力调节剂为D-甘露糖醇。19.权利要求1的制剂，其中所述制剂适合于非肠道给药。20.一种辛卡利特的稳定的、生理学上可接受的制剂，它包括(a)约0.0008-0.0012mg/mL的辛卡利特，(b)约20-50mg/mL的甘露糖醇，(c)约2-7mg/mL的精氨酸，(d)约0.2-1mg/mL的甲硫氨酸，(e)约2-30mg/mL的赖氨酸，(f)约0.002-0.012mg/mL的焦亚硫酸钠，(g)约0.000001-0.03mg/mL的多乙氧基醚20，(h)约0.1-3mg/mL的喷替酸(DTPA)，和(i)约1.1-1.8mg/mL的磷酸氢二钾。21.一种制备辛卡利特的稳定制剂的方法，所述方法包括将以下成份混合的步骤(a)至少一种稳定剂，(b)表面活性剂/加溶剂，(c)螯合剂，(d)填充剂/张力调节剂，(e)缓冲剂(f)含水溶液，以及(g)辛卡利特。22.权利要求21的方法，其中所述制剂的pH范围为6.0-8.0。23.权利要求21的方法，其中所述缓冲剂选自磷酸、磷酸盐、柠檬酸、柠檬酸盐、磺基水杨酸盐、乙酸、乙酸盐、甲基硼酸、硼酸盐、六水合琥珀酸二钠、一或多种氨基酸、乳酸、乳酸盐、马来酸、马来酸盐、氯化钾、苯甲酸、苯甲酸钠、碳酸、碳酸盐、碳酸氢盐、硼酸、硼酸盐、氯化钠、琥珀酸、琥珀酸盐、酒石酸、酒石酸盐、三-(羟甲基)氨基甲烷和生理缓冲液。24.权利要求21的方法，其中所述缓冲剂为磷酸盐缓冲剂。25.权利要求24的方法，其中所述缓冲剂为磷酸氢二钾。26.权利要求21的方法，其中所述表面活性剂/加溶剂选自阴离子表面活性剂、普朗尼克类、泊洛沙姆、SDS、Triton-100、多乙氧基醚、丙二醇、PEG和类似的化合物、Brij589聚(氧乙烯基)20十六烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)、二甲基乙酰胺(DMA)、NP40(NonidetP-40)，及N-甲基-2-吡咯烷酮(Pharmasolve)和氨基酸。27.权利要求21的方法，其中所述表面活性剂为非离子表面活性剂。28.权利要求27的方法，其中所述非离子表面活性剂为多乙氧基醚。29.权利要求28的方法，其中所述非离子表面活性剂为多乙氧基醚20或多乙氧基醚80。30.权利要求21的方法，其中所述稳定剂选自抗氧化剂和氨基酸。31.权利要求30的方法，其中所述稳定剂为抗氧化剂。32.权利要求30的方法，其中所述稳定剂为焦亚硫酸钠。33.权利要求21的方法，其中所述方法还包括混合多种稳定剂。34.权利要求33的方法，其中所述稳定剂包括L-精氨酸单盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸单盐酸盐和焦亚硫酸钠。35.权利要求21的方法，其中所述填充剂/张力调节剂选自甘露糖醇、氨基酸、乳糖、氯化钾、氯化钠、麦芽糖、蔗糖、PEG’s、海藻糖、棉子糖、葡萄糖、环糊精、葡聚糖、半乳糖醛酸、Ficoll和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。36.权利要求35的方法，其中所述填充剂/张力调节剂为D-甘露糖醇。37.权利要求21的方法，其中所述螯合剂为喷替酸(DTPA)。38.权利要求37的方法，其中所述螯合剂为喷替酸，所述表面活性剂为多乙氧基醚20，所述缓冲剂为磷酸氢二钾，及所述填充剂/张力调节剂为D-甘露糖醇。39.权利要求21的方法，其中所述制剂包含约0.0008-0.0012mg/mL的辛卡利特；约20-50mg/mL的甘露糖醇；约2-7mg/mL的精氨酸；约0.2-1mg/mL的甲硫氨酸；约2-30mg/mL的赖氨酸；约0.002-0.012mg/mL的焦亚硫酸钠；约0.000001-0.03mg/mL的多乙氧基醚20；约0.1-3.0mg/mL的喷替酸(DTPA)；和约1.1-1.8mg/mL的磷酸氢二钾。40.一种药剂盒，它包括(i)一种粉末混合物，其包含(a)辛卡利特，(b)至少一种稳定剂，(c)表面活性剂，(d)螯合剂，(e)填充剂/张力调节剂，以及(f)缓冲剂。(ii)一种盛装所述粉末混合物的容器；以及(iii)任选生理学上可接受的流体。41.权利要求40的药剂盒，其中所述缓冲剂选自磷酸、磷酸盐、柠檬酸、柠檬酸盐、磺基水杨酸盐、乙酸、乙酸盐、甲基硼酸、硼酸盐、六水合琥珀酸二钠、一或多种氨基酸、乳酸、乳酸盐、马来酸、马来酸盐、氯化钾、苯甲酸、苯甲酸钠、碳酸、碳酸盐、碳酸氢盐、硼酸、硼酸盐、氯化钠、琥珀酸、琥珀酸盐、酒石酸、酒石酸盐、三-(羟甲基)氨基甲烷和生理缓冲液。42.权利要求40的药剂盒，其中所述缓冲剂为磷酸盐缓冲剂。43.权利要求40的药剂盒，其中所述缓冲剂为磷酸氢二钾。44.权利要求40的药剂盒，其中所述表面活性剂选自阴离子表面活性剂、普朗尼克类、泊洛沙姆、SDS、Triton-100、多乙氧基醚、丙二醇、PEG和类似的化合物、Brij589聚(氧乙烯基)20十六烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)、二甲基乙酰胺(DMA)、NP40(NonidetP-40)，及N-甲基-2-吡咯烷酮(Pharmasolve)和氨基酸。45.权利要求40的药剂盒，其中所述表面活性剂为非离子表面活性剂。46.权利要求45的药剂盒，其中所述非离子表面活性剂为多乙氧基醚。47.权利要求46的药剂盒，其中所述非离子表面活性剂为多乙氧基醚20或多乙氧基醚80。48.权利要求40的药剂盒，其中所述稳定剂选自抗氧化剂和氨基酸。49.权利要求48的药剂盒，其中所述稳定剂为抗氧化剂。50.权利要求49的药剂盒，其中所述稳定剂为焦亚硫酸钠。51.权利要求40的药剂盒，其中所述粉末混合物包含多种稳定剂。52.权利要求51的药剂盒，其中所述稳定剂包括L-精氨酸单盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸单盐酸盐和焦亚硫酸钠。53.权利要求40的药剂盒，其中所述填充剂/张力调节剂选自甘露糖醇、氨基酸、乳糖、氯化钾、氯化钠、麦芽糖、蔗糖、PEG’s、海藻糖、棉子糖、葡萄糖、环糊精、葡聚糖、半乳糖醛酸、Ficoll和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。54.权利要求40的药剂盒，其中所述螯合剂为喷替酸(DTPA)。55.权利要求40的药剂盒，其中所述容器为小瓶。56.一种治疗或预防与全肠外营养(TPN)有关的医学病症的方法，所述方法包括给予接受TPN的患者有效量的辛卡利特制剂，所述制剂包含(a)辛卡利特，(b)至少一种稳定剂，(c)表面活性剂，(d)螯合剂，(e)填充剂/张力调节剂，和(f)缓冲剂。57.权利要求56的方法，其中所述医学病症为TPN-相关的胆汁郁积。58.权利要求56的方法，其中所述制剂通过注射给药。59.权利要求56的方法，其中所述制剂的pH范围为6.0-8.0。60.权利要求56的方法，其中所述缓冲剂选自磷酸、磷酸盐、柠檬酸、柠檬酸盐、磺基水杨酸盐、乙酸、乙酸盐、甲基硼酸、硼酸盐、六水合琥珀酸二钠、一或多种氨基酸、乳酸、乳酸盐、马来酸、马来酸盐、氯化钾、苯甲酸、苯甲酸钠、碳酸、碳酸盐、碳酸氢盐、硼酸、硼酸盐、氯化钠、琥珀酸、琥珀酸盐、酒石酸、酒石酸盐、三-(羟甲基)氨基甲烷和生理缓冲液。61.权利要求56的方法，其中所述缓冲剂为磷酸盐缓冲剂。62.权利要求61的方法，其中所述缓冲剂为磷酸氢二钾。63.权利要求56的方法，其中所述表面活性剂选自阴离子表面活性剂、普朗尼克类、泊洛沙姆、SDS、Triton-100、多乙氧基醚、丙二醇、PEG和类似的化合物、Brij589聚(氧乙烯基)20十六烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)、二甲基乙酰胺(DMA)、NP40(NonidetP-40)，及N-甲基-2-吡咯烷酮(Pharmasolve)和氨基酸。64.权利要求56的方法，其中所述表面活性剂为非离子表面活性剂。65.权利要求64的方法，其中所述非离子表面活性剂为多乙氧基醚。66.权利要求65的方法，其中所述非离子表面活性剂为多乙氧基醚20或多乙氧基醚80。67.权利要求56的方法，其中所述稳定剂选自抗氧化剂和氨基酸。68.权利要求67的方法，其中所述稳定剂为抗氧化剂。69.权利要求68的方法，其中所述稳定剂为焦亚硫酸钠。70.权利要求56的方法，其中所述方法包含混合多种稳定剂。71.权利要求69的方法，其中所述稳定剂包括L-精氨酸单盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸单盐酸盐和焦亚硫酸钠。72.权利要求56的方法，其中所述填充剂/张力调节剂选自甘露糖醇、氨基酸、乳糖、氯化钾、氯化钠、麦芽糖、蔗糖、PEG’s、海藻糖、棉子糖、葡萄糖、环糊精、葡聚糖、半乳糖醛酸、Ficoll和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。73.权利要求72的方法，其中所述填充剂/张力调节剂为D-甘露糖醇。74.权利要求56的方法，其中所述螯合剂为喷替酸(DTPA)。75.权利要求74的方法，其中所述螯合剂为喷替酸，所述表面活性剂为多乙氧基醚20，所述缓冲剂为磷酸氢二钾，及所述填充剂/张力调节剂为D-甘露糖醇。76.权利要求56的方法，其中所述制剂包含约0.0008-0.0012mg/mL的辛卡利特；约20-50mg/mL的D-甘露糖醇；约2-7mg/mL的L-精氨酸；约0.2-1mg/mL的L-甲硫氨酸；约2-30mg/mL的L-赖氨酸；约0.002-0.012mg/mL的焦亚硫酸钠；约0.000001-0.03mg/mL的多乙氧基醚20；约0.1-3mg/mL的喷替酸(DTPA)；和约1.1-1.8mg/mL的磷酸氢二钾。77.一种用于使患者的肝胆系统成像的方法，所述方法包括(a)给予所述患者肝胆显像剂；(b)在步骤(a)之前或之后，给予患者一种包含下列成分的辛卡利特制剂(i)辛卡利特，(ii)至少一种稳定剂，(iii)表面活性剂，(iv)螯合剂，(v)填充剂/张力调节剂，和(vi)缓冲剂；和(c)采用一种测定装置测定所述患者中的所述显像剂。78.权利要求77的方法，其中所述辛卡利特制剂通过注射给予。79.权利要求77的方法，其中所述辛卡利特制剂在给予所述肝胆显像剂之前给予所述患者。80.权利要求77的方法，其中所述辛卡利特制剂在给予所述肝胆显像剂之后给予所述患者。81.权利要求77的方法，其中所述肝胆显像剂为99mTc-IDA(亚氨基二乙酸)类似物。82.权利要求77的方法，其中所述肝胆显像剂为99mTc-甲溴菲宁。83.权利要求77的方法，其中所述方法还包括在给予所述辛卡利特制剂之后，测定所述患者的胆囊排出物分数(GBEF)。84.权利要求77的方法，其中所述测定装置扫描所述患者身体，以检测放射性。85.权利要求84的方法，其中所述测定装置为伽玛照相机。86.权利要求77的方法，其中所述制剂的pH范围为6.0-8.0。87.权利要求77的方法，其中所述缓冲剂选自磷酸、磷酸盐、柠檬酸、柠檬酸盐、磺基水杨酸盐、乙酸、乙酸盐、甲基硼酸、硼酸盐、六水合琥珀酸二钠、一或多种氨基酸、乳酸、乳酸盐、马来酸、马来酸盐、氯化钾、苯甲酸、苯甲酸钠、碳酸、碳酸盐、碳酸氢盐、硼酸、硼酸盐、氯化钠、琥珀酸、琥珀酸盐、酒石酸、酒石酸盐、三-(羟甲基)氨基甲烷和生理缓冲液。88.权利要求77的方法，其中所述缓冲剂为磷酸盐缓冲剂。89.权利要求88的方法，其中所述缓冲剂为磷酸氢二钾。90.权利要求77的方法，其中所述表面活性剂选自阴离子表面活性剂、普朗尼克类、泊洛沙姆、SDS、Triton-100、多乙氧基醚、丙二醇、PEG和类似的化合物、Brij589聚(氧乙烯基)20十六烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)、二甲基乙酰胺(DMA)、NP40(NonidetP-40)，及N-甲基-2-吡咯烷酮(Pharmasolve)和氨基酸。91.权利要求77的方法，其中所述表面活性剂为非离子表面活性剂。92.权利要求91的方法，其中所述非离子表面活性剂为多乙氧基醚。93.权利要求92的方法，其中所述非离子表面活性剂为多乙氧基醚20或多乙氧基醚80。94.权利要求77的方法，其中所述稳定剂选自抗氧化剂和氨基酸。95.权利要求94的方法，其中所述稳定剂为抗氧化剂。96.权利要求95的方法，其中所述稳定剂为焦亚硫酸钠。97.权利要求77的方法，其中所述方法包含混合多种稳定剂。98.权利要求97的方法，其中所述稳定剂包括L-精氨酸单盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸单盐酸盐和焦亚硫酸钠。99.权利要求77的方法，其中所述填充剂/张力调节剂选自甘露糖醇、氨基酸、乳糖、氯化钾、氯化钠、麦芽糖、蔗糖、PEG’s、海藻糖、棉子糖、葡萄糖、环糊精、葡聚糖、半乳糖醛酸、Ficoll和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。100.权利要求77的方法，其中所述填充剂/张力调节剂为D-甘露糖醇。101.权利要求77的方法，其中所述螯合剂为喷替酸(DTPA)。102.权利要求101的方法，其中所述螯合剂为喷替酸，所述表面活性剂为多乙氧基醚20，所述缓冲剂为磷酸氢二钾，及所述填充剂/张力调节剂为D-甘露糖醇。103.权利要求77的方法，其中所述制剂包含约0.0008-0.0012mg/mL的辛卡利特；约20-50mg/mL的D-甘露糖醇；约2-7mg/mL的L-精氨酸；约0.2-1mg/mL的L-甲硫氨酸；约2-30mg/mL的L-赖氨酸；约0.002-0.012mg/mL的焦亚硫酸钠；约0.000001-0.03mg/mL的多乙氧基醚20；约0.1-3mg/mL的喷替酸(DTPA)；和约1.1-1.8mg/mL的磷酸氢二钾。104.一种使患者的肝胆系统成像的方法，所述方法包括(a)给予患者包含下列成分的辛卡利特制剂(i)辛卡利特，(ii)至少一种稳定剂，(iii)表面活性剂，(iv)螯合剂，(v)填充剂/张力调节剂，和(vi)缓冲剂；和(b)采用诊断成像模式扫描所述患者。105.权利要求104的方法，其中所述成像模式选自磁共振成像、闪烁照相成像和超声成像。106.一种辛卡利特的稳定的、生理学上可接受的制剂，它包括(a)约0.001mg/mL的辛卡利特；(b)约34mg/mL的D-甘露糖醇；(c)约6mg/mL的L-精氨酸；(d)约0.8mg/mL的L-甲硫氨酸；(e)约3mg/mL的L-赖氨酸；(f)约0.008mg/mL的焦亚硫酸钠；(g)约0.01mg/mL的多乙氧基醚20；(h)约0.4mg/mL的喷替酸；和(i)约1.8mg/mL的磷酸氢二钾。107.权利要求40的药剂盒，它包括(a)约0.005mg的辛卡利特；(b)约100-250mg的甘露糖醇；(c)约0.000005-0.015mg的多乙氧基醚20；(d)约2mg的喷替酸(DTPA)；(e)约0.01-0.06mg的焦亚硫酸钠；(f)约5.4-12mg的磷酸氢二钾；(g)约1-5mg的甲硫氨酸；(h)约10-60mg的赖氨酸；和(i)约10-35mg的精氨酸。108.一种药剂盒，它包括(a)约0.005mg的辛卡利特；(b)约170mg的D-甘露糖醇；(c)不大于0.01mg的多乙氧基醚20；(d)约2mg的DTPA；(e)约0.04mg的焦亚硫酸钠；(f)约9mg的磷酸氢二钾；(g)约4mg的L-甲硫氨酸；(h)约15mg的L-赖氨酸单盐酸盐；和(i)约30mg的L-精氨酸单盐酸盐。全文摘要本发明特征在于辛卡利特制剂，所述制剂包括有效量的辛卡利特、填充剂/张力调节剂、稳定剂、表面活性剂、螯合剂和缓冲剂。本发明的特征还在于药剂盒和制备改良辛卡利特制剂的方法，以及采用辛卡利特制剂治疗、预防和诊断胆囊相关疾病的方法。文档编号A61K47/00GK1756557SQ03824137公开日2006年4月5日申请日期2003年8月15日优先权日2002年8月16日发明者E·C·梅特卡尔夫,J·A·蒙特菲兰特,M·纽博恩,I·罗皮亚克,E·施拉姆,G·怀特,J·佐达申请人:布拉科国际有限公司