专利名称：鳗弧菌减毒活疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及水产养殖鱼用减毒活疫苗，具体的说是鳗弧菌(Vibiro anguillarum)的减毒活疫苗。
背景技术：
随着海水养殖业的逐步发展，接踵而来的是各种病害的大规模爆发，病害问题日益突出，制约着海水养殖业的进一步发展。病害的防治和控制已经成为海水养殖应该解决的首要问题。
鳗弧菌是严重危害我国及世界水产养殖鱼类的一类细菌性重要病原体，主要导致养殖鱼类的出血性败血病等弧菌病，其主要致病毒力因子为鳗弧菌含有的pJM1类质粒编码的铁摄取系统(Crosa，J.H.，Walsh，C.T.Genetics andassembly line enzymology of siderophore biosynthesis in bacteria.Microbiol MolBiol Rev，2002，66(2)223-49)。
目前，对于该病原体引发的弧菌病的主要防治手段为使用抗生素和鳗弧菌灭活疫苗。鉴于抗生素的环境危害、大量抗药性病原体的出现，抗生素防治手段已经在世界范围内逐渐禁用。作为符合环境友好和可持续发展战略的病害防治措施，疫苗防治正成为国际现代海洋农业的先进手段和主要前沿研究与开发领域。疫苗具有针对性强、抗病周期长、可终身免疫、效果显著和防治主动的特点。减毒活菌疫苗更是具有给药方便、免疫效价高、成本低廉的新技术优势，同时具有开发广谱疫苗的潜力优势。
目前，国外已开发成功并商业化用于防治鳗弧菌弧菌病的鳗弧菌灭活疫苗(http//ag.ansc.purdue.edu/aquanic/index.htm)。我国未见任何形式的鳗弧菌商品化疫苗。美国专利有利用转座子插入突变技术构建鳗弧菌减毒活疫苗的报道(United State Patent 5，284，653)。国内外未见其它任何形式的鳗弧菌减毒活疫苗开发文献报道。
灭活疫苗往往具有以下缺陷保护性抗原不完全，免疫应答反应不稳定和水平低下，甚至不能激发正确免疫反应及引发副作用，给药不方便等。
使用转座子等基因重组构建技术开发的减毒活疫苗含有抗生素抗性标记和外源基因片段，可能在使用时传播到其它病原体内，具有先天性的潜在环境危害风险。毒力易回复和不可控的环境传播风险是该种疫苗应用所必须重视和解决的。鉴于此，该类减毒疫苗被包括中国在内的各国生物制品安全检查管理机构审批法规认定为具有较高环境安全风险的生物制品而难以进入商业化开发进程。
无标记缺失减毒疫苗构建技术是目前国际上新兴起的活疫苗开发领域，是疫苗构建与开发的国际前沿领域与主要发展方向之一，所开发的疫苗具有公认的产品和环境安全性。并且构建的减毒株具有表达异源抗原以开发多效价疫苗(特别是针对病毒病害)的潜在价值，也已成为疫苗开发的国际前沿和热点领域。
该技术构建的减毒活疫苗与以往传统技术路线构建的减毒活疫苗相比具有如下优点a.开发的减毒活疫苗不带任何抗生素抗性标记，对环境不存在传播抗生素抗性的潜在危害；b.采用基因缺失突变(特别是双缺失)的手段，在理论上认为减毒活疫苗毒力不可回复，极大地消除了向环境传播大量毒性病原体的可能性；c.突变的遗传背景清楚，减毒的机理明确，易于区分疫苗株与野生菌株，便于对环境进行监控，提高疫苗的环境安全性和可控性；所有这些技术安全特征都为无标记缺失减毒活疫苗的商业化进程提供了现实的发展前景。
发明内容
技术问题本发明的目的在于提供一种无抗生素抗性标记的鳗弧菌减毒活疫苗。
技术方案及其说明为了实现上述发明目的，本发明提供了一种鳗弧菌减毒活疫苗，它是鳗弧菌毒株MVM425的angE基因缺失突变株，其中不含抗生素抗性标记。
本发明实施方式之一中所得的减毒活疫苗是鳗弧菌突变株MVAV6202，已经于2003年11月7日保存于武汉的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC-M203076。
本发明的另一实施方式是一种鳗弧菌减毒活疫苗制剂，包含106-108个/ml的减毒株MVAV6202和生理盐水。
本发明的鳗弧菌毒株MVM425从我国黄海海域养殖渔场内爆发鳗弧菌弧菌病的病鱼体内分离得到，是一种强致病力野生株(Vibrio anguillarum MVM425，马悦等，“海洋鱼类弧菌病疫苗的制备——新型简易鳗弧菌培养基优化”，《高技术通讯》Vol.11(7)，2001)。已证实，该毒株携带有pEIB1毒性质粒，并已完成了其全序列测定工作(Genbank登录号AY255699)，该质粒属于pJM1类野生的游离质粒，编码铁摄取系统。angE基因(Genbank登录号AY255699)是pEIB1介导编码的鳗弧菌铁摄取系统合成的重要基因，该基因缺失突变株表现为铁营养缺陷型表征。
本发明方法中，培养减毒疫苗株的培养基可选用LB培养基，其中的蛋白胨可以是酪蛋白胨、胰蛋白胨或大豆蛋白胨，补加NaCl至3％。本发明选用大豆蛋白胨。培养基必须包含0.2-0.5mM的Fe3+。所述的Fe3+的形式可以是例如柠檬酸铁铵或FeCl3，本发明优选柠檬酸铁铵。
有益效果本发明的鳗弧菌减毒活疫苗与野生毒株MVM425相比具有明显的低毒性和免疫保护率，可有效地防护试验用鱼免受强弧菌病致病力鳗弧菌野生株的侵染。后文对比试验表明，该活疫苗免疫效果优于相应的灭活疫苗，具有非常好的水产养殖鱼类弧菌病爆发性传染病的防治效果。同时，该减毒疫苗株不含有任何外源基因片段和抗生素抗性标记，毒力基因框内大片段缺失，毒力不可回复，具有技术上的环境安全性，有实际的商业开发价值。
具体实施例方式
实施例1鳗弧菌减毒活疫苗和灭活疫苗的制备减毒活疫苗制剂的制备取1接种环保存于LB斜面培养基(大豆蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl 30g/L，琼脂18g/L，pH 7.5)上的MVAV6202种子，接种于装有100ml液体LB种子培养基(大豆蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl 30g/L，pH 7.5)的500ml摇瓶，在28℃下振荡培养(转速200转/分钟)。12小时后，取5ml生长旺盛的菌液(O.D＝4.0左右)接种于100ml新鲜富铁LB培养基(大豆蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl 30g/L，柠檬酸铁铵0.2-0.5mmol，pH6.8)，28℃培养12小时。用无菌生理盐水(0.85％NaCl)洗涤并稀释成一定浓度悬液(106-108个/ml)备用。
灭活疫苗制剂的制备取1接种环保存于LB斜面培养基(大豆蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl 30g/L，琼脂18g/L，pH 7.5)上的MVM425种子，接种于装有100ml液体LB种子培养基(大豆蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl 30g/L，pH 7.5)的500ml摇瓶，在28℃下振荡培养(转速200转/分钟)。12小时后，取5ml生长旺盛的菌液(O.D＝4.0左右)接种于100ml新鲜LB培养基(大豆蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl30g/L，pH7.5)，28℃培养12小时。用甲醛生理盐水洗涤制成悬液，60℃水浴灭活，经无菌检查合格后稀释成108个/ml备用。
实施例2以石斑鱼为对象的感染试验和半数致死量LD50测定致病力试验试验用鱼为广东湛江863养殖基地提供的石斑鱼，平均体重13g，在水族箱中暂养一周以上无异常者作为实验鱼。将试验用鱼随机分组，每组15尾，每天换去1/3饲养水体并充分供氧，养殖水温28℃。在整个过程中不喂食。临实验前剔除不正常个体。
每尾实验鱼用医用注射枪腹部注射0.3ml实施例1制备的减毒活疫苗制剂和野生鳗弧菌毒性株MVM425制剂，对照组注射0.85％的无菌生理盐水，在10天内记录累计死亡数和死亡率，取三组平行试验的平均值，见表1。
表1鳗弧菌毒性株MVM425和减毒株MVAV6202对石斑鱼的致病力试验组 别 菌液浓度 剂 量实验数(尾)死亡数(尾)死亡率(％)MVM425 1×108/ml0.3ml15 1493.3MVAV6202 1×108/ml0.3ml15 2 13.3对照 / 0.3ml15 0 0回归感染试验收集发病鱼，无菌操作从组织、器官分离细菌，初步鉴定为感染菌。然后用从发病鱼分离的菌再感染健康石斑鱼，同样可以引起发病。
上述结果表明，减毒株MVAV6202具有明显的减毒效应。半数致死量的测定将健康石斑鱼分组，15尾/组，将一定浓度的野生株MVM425和减毒株MVAV6202菌液，9×108个/ml，倍比梯度稀释，分别腹腔注射菌液，0.3ml/尾。对照组注射无菌生理盐水，0.3ml/尾。然后分别计算各自对实验鱼的LD50，取三组平行试验的平均值。结果见表2。
表2鳗弧菌毒性株MVM425和减毒株MVAV6202对石斑鱼的LD50感染菌株 LD50备注MVM4251×105/ml 7天达到半数致死MVAV6202 ＞108/ml试验浓度(103～108/ml)均未达到半数致死。
鳗弧菌减毒株MVAV6202在108/ml浓度仅能引起20％左右的石斑鱼死亡。
实施例3对石斑鱼的免疫性保护试验试验石斑鱼随机分组，30尾/组。采用腹腔注射和浸泡两种方式用实施例1制备的减毒活疫苗制剂免疫石斑鱼。注射免疫中，将制备疫苗制剂的浓度调定为108个/ml，0.3ml/尾，腹腔注射。浸泡免疫中，将疫苗制剂浸泡液的浓度调定为106个/ml，浸泡时间控制在1分钟左右。对照组注射无菌生理盐水，0.3ml/尾。15天后，通过重复上述给药剂量进行加强免疫。又15天后，用鳗弧菌野生株MVM425活菌对各组进行攻击9×108/ml的生理盐水制剂，0.3ml/尾，腹腔注射。然后观察对照组和免疫组，记录死亡数，按下列公式计算每组的免疫保护力，取三组平行试验的平均值，结果见表3和表4免疫保护力％＝(对照组死亡率-免疫组死亡率)/对照组死亡率×100％，表3鳗弧菌减毒株MVAV6202活菌疫苗注射免疫石斑鱼的免疫保护性试验组别试验尾数 死亡率(％) 免疫保护率(％)MVAV6202免疫组 30 13.385.7生理盐水对照 30 93.3/生理盐水免疫且无攻 30 0 /击对照表4鳗弧菌减毒株MVAV6202活菌疫苗浸泡免疫石斑鱼的免疫保护性试验组别 试验尾数死亡率(％) 免疫保护率(％)MVAV6202免疫 30 20 80.0生理盐水对照 30 100 /生理盐水免疫且无 30 0 /攻击对照从上可以看出，减毒株MVAV6202腹腔注射免疫石斑鱼的免疫保护率要略高于浸泡免疫石斑鱼的免疫保护率，但两者反映的免疫保护力均高于80％，表明减毒菌株MVAV6202具有较高的免疫原性，对实验石斑鱼具有较好的免疫保护性。
实施例4减毒疫苗MVAV6202和灭活疫苗MVM425对石斑鱼的免疫对比试验试验石斑鱼随机分组，30尾/组。取实施例1制备减毒活疫苗制剂和灭活疫苗制剂分别采用腹腔注射和浸泡两种方式免疫石斑鱼。注射免疫是将制备的疫苗制剂浓度调整为108个/ml，0.3ml/尾，腹腔注射。浸泡免疫是将制备的疫苗制剂稀释成106个/ml，浸泡时间控制在1分钟左右。对照组注射无菌生理盐水。15天后，重复上述剂量进行加强免疫。又15天后，用鳗弧菌野生株MVM425对各组进行攻击9×108/ml的生理盐水制剂，0.3ml/尾腹腔注射。然后观察并记录各组死亡数，按实施例3中所述公式计算每组的免疫保护力，取三组平行试验的平均值，结果见表5和表6。
表4鳗弧菌减毒株活菌疫与灭活疫苗苗注射免疫石斑鱼的免疫保护性对比组别 试验尾数死亡率(％)免疫保护率(％)灭活疫苗免疫30 38.5 58.7MVAV6202免疫30 13.3 85.7生理盐水免疫对照30 93.3 /生理盐水免疫且无攻 30 0/击对照表5鳗弧菌减毒株活菌疫与灭活疫苗苗浸泡免疫石斑鱼的免疫保护性对比组别 试验尾数 死亡率(％) 免疫保护率(％)灭活疫苗免疫30 35.7 63.1MVAV6202免疫30 19.3 80.0生理盐水免疫对照30 96.7 /生理盐水免疫且无攻击30 0 /对照两种给药方式中，减毒活疫苗的免疫保护性均高于灭活疫苗。可见本发明供的减毒活疫苗与灭活疫苗相比，可激发更高的免疫效价，具有更高的免疫保护力。
权利要求
1.一种鳗弧菌减毒活疫苗，它是鳗弧菌毒株MVM425的angE基因缺失突变株，其中不含抗生素抗性标记。
2.如权利要求1所述的鳗弧菌减毒活疫苗，它是鳗弧菌突变株MVAV6202，其保藏号为CCTCC-M203076。
3.一种鳗弧菌减毒活疫苗制剂，包含106-108个/ml的减毒株MVAV6202和生理盐水。
全文摘要
本发明提供了一种鳗弧菌减毒活疫苗。该疫苗相对于野生毒株MVM425具有明显的低毒性和免疫保护率，且不含任何抗生素抗性标记。经试验证明，该减毒活疫苗可有效地防护易感鱼类免受强弧菌病致病力鳗弧菌野生株的侵染。
文档编号A61P31/00GK1623601SQ20031010902
公开日2005年6月8日 申请日期2003年12月3日 优先权日2003年12月3日
发明者马悦, 张元兴, 赵东玲, 刘琴, 邵明非, 何建国, 黄志坚 申请人:华东理工大学