专利名称：一种治疗类风湿性关节炎的清络通痹制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及中药技术领域，具体是涉及一种以植物中草药为原料而制成的治疗类风湿性关节炎的药物及其制备方法。
背景技术：
类风湿性关节炎(简称类风关)目前在国内外仍属病因不明的难治之症，对劳动力的影响极大。近几年来，西医学对类风关发病机理的研究，已深入至分子免疫水平，但对类风关的治疗，其近期、远期疗效皆难以令人满意，最终未能阻止骨质的破坏性病变{张乃峥，风湿病的诊断与治疗，实用内科杂志1992；12(12)631}，尚无特效疗法。临床应用最广泛的非甾体类抗炎药，并不能阻止其病情发展，长期应用可导致严重胃肠道副作用；皮质激素虽然能较好地控制临床症状，但最终不能阻止类风关的破坏性病变，且持续服用副作用超过其治疗作用；国际通用的改变病情药物如免疫抑制剂等，虽有一定的抑制病情作用，但用药后达到临床治愈标准的不超过10％，且都有一定毒性，可导致病人出现较严重的不良反应{蒋明，加强类风湿关节炎的临床研究，中华医学杂志1998；78(3)165}。中医药对类风关的研究有较大进展，综观各地报道，临床有效率约在80～90％左右，但尚难取得突破性进展，临床治愈显效率仍低，目前临床应用的中成药大多依据辨病组方，药性偏于温燥，如益肾蠲痹丸、尫痹冲剂等，不适用于辨证属热痹的患者；火把花根片、雷公藤片等制剂也有毒副作用和非适应症{黄李平，类风湿性关节炎的中西医药物治疗进展，广西中医学院学报1999；16(2)89；陈纪藩，中医药治疗类风湿性关节炎的优势及研究中存在的问题，新中医1998；30(4)63}。中药复方制剂的质量和科技含量也亟待提高。因此，本研究对提高类风关的中医药诊治水平及加快中药现代化与产业化进程，有着极其重要的意义。
发明内容
1、发明目的本发明的目的是提供一种疗效显著的治疗类风湿性关节炎的药物及其制备方法。
2、技术方案A、一种治疗类风湿性关节炎的清络通痹制剂，其特征在于主要有下列重量配比的组方所组成生 地10～25g 青风藤10～25g 桑寄生10～25g 豨莶草10～25g三七粉2～6g 炙僵蚕10～15g雷公藤5～15g 络石藤10～25g
当湿热偏重，苔黄腻者，可另加土茯苓10～25g，黄柏5～15g；当瘀热偏重，皮肤红斑，舌质暗紫者，可另加丹参10～25g，鬼箭羽10～25g，凌霄花10～25g；当关节肿胀，则可另加路路通10～25g，天仙藤10～25g。
B、清络通痹制剂的制备方法，其具体步骤如下(1)清络通痹制剂的八味，取三七粉碎成超细粉体；其余生地等7味加水煎煮2次，第一次11倍量水，煎煮1.5小时，第二次7倍量水，煎煮1.0小时；(2)合并煎煮液，微滤(滤材为无机陶瓷膜，孔径为0.2μm)；滤液减压薄膜浓缩(0.085Mpa，65-70℃)至相对密度1.08～1.10(60℃)；(3)喷雾干燥(进风温度170℃，出风温度70℃)；(4)干粉加入三七超细粉体后混匀；(5)加适量辅料，混匀，干法制粒(滚压法，20～60目)，分装，即得。
上述辅料为糊精和甜菊糖。
3、有益效果清络通痹制剂在研究思路和方法上遵循中医理论，达到辨证与辨病相结合，使临床疗效明显提高，临床治愈显效率为38.10％，总有效率为90.48％，明显优于雷公藤多甙片对照组的20％、83.64％，清络通痹制剂在治疗过程中患者未出现明显不良反应，而雷公藤多甙片的不良反应发生率高达49.09％。研究表明该制剂能提高患者的生活质量，降低致残率，保护社会劳动力，且药源丰富、价格低廉、服用方便、无明显毒副作用，在国内外有广阔的市场和良好的开发前景，推广应用后将会取得显著的社会效益和经济效益。
四、最佳实施方式(一)实施例一清络通痹制剂的基本组方生 地 15g 青风藤 15g桑寄生 15g 豨莶草 15g三七粉 3g 炙僵蚕 10g雷公藤 5g络石藤 15g当湿热偏重，苔黄腻者，可另加土茯苓15g，黄柏10g；当瘀热偏重，皮肤红斑，舌质暗紫者，可另加丹参15g，鬼箭羽15g，凌霄花15g；当关节肿胀，则可另加路路通15g，天仙藤15g。
(二)实施例二清络通痹制剂的制备方法清络通痹制剂的八味药物，取三七粉碎成超细粉体；其余生地等7味加水煎煮2次，第一次11倍量水，煎煮1.5小时，第二次7倍量水，煎煮1.0小时；合并煎煮液，微滤(滤材为无机陶瓷膜，孔径为0.2μm)；滤液减压薄膜浓缩(0.085Mpa，65-70℃)至相对密度1.08～1.10(60℃)，喷雾干燥(进风温度170℃，出风温度70℃)；干粉加入三七超细粉体、加适量糊精和甜菊糖，混匀，干法制粒(滚压法，20～60目)，分装，即得。
(三)实施例三药理药效试验1 实验材料1.1 药物和试剂清络通痹颗粒每包5g，含生药2.5g/g，由南京中医药大学植物药深加工中心提供。实验中所用动物剂量以制剂量计算，用前用生理盐水配成所需浓度。
角叉菜胶、伊文思蓝(Evan’s blue)、雷公藤多甙片、消炎痛片、冰醋酸、卡介苗、胎生牛血清、MTT、ConA、LPS、3H-TdR、PGE2RIA试剂盒。
1.2 动物SD大鼠、ICR小鼠，均由南京中医药大学实验动物中心提供。
2 方法与结果2.1 清络通痹颗粒的抗炎镇痛作用研究2.1.1 清络通痹颗粒对大鼠角叉菜胶诱发足肿胀的影响取雄性大鼠50只，180-220g，随机分为五组，即(1)模型组生理盐水10ml/kg；(2)雷公藤多甙组7.5mg/Kg；(3)清络通痹小剂量组3.6g生药/kg；(4)清络通痹中剂量组7.2g生药/kg；(5)清络通痹大剂量组14.4g生药/kg。各组按10ml/kg灌胃给药，共给3日。末次给药30min后，在大鼠右后肢足跖皮下注射1％角叉菜胶0.05ml/只，用容积法测定致炎前与致炎后30，60，120，240min大鼠足跖容积。以致炎前后足跖容积之差值为肿胀程度，结果见表1。
表1清络通痹颗粒对角叉菜胶诱发大鼠足跖肿胀的影响(X±S，n＝10)
致炎前致炎后足肿胀度(ml)(min)组别 剂量足容积(ml)30 60 1202400.39± 0.73± 1.07± 0.90±模型组 10ml/kg1.37±0.150.11 0.28 0.18 0.11雷公藤多 0.21± 0.43± 0.75± 0.75±7.5mg/kg 1.37±0.12甙片组 0.07** 0.12**0.21**0.15*清络通痹 0.31± 0.66± 0.91± 0.88±3.6g生药/kg 1.37±0.11小剂量组 0.08 0.17 0.17 0.13清络通痹 0.31± 0.48± 0.82± 0.87±7.2g生药/kg 1.39±0.15中剂量组 0.12 0.10* 0.11**0.09清络通痹 14.4g生药 0.21± 0.44± 0.79±0.69±1.38±0.11大剂量组/kg 0.06** 0.07**0.11**0.12***P＜0.05 **P＜0.01与模型组比较表1结果说明清络通痹颗粒中剂量、大剂量两个剂量组对角叉菜胶诱发大鼠足跖肿胀有明显的抑制作用，以60min、120min抑制作用尤为明显。
2.1.2.清络通痹颗粒对大鼠棉球肉芽肿形成的影响取雄性大鼠50只，体重180-220g，将两个10mg灭菌消毒棉球分别植入大鼠左右腋下，缝合皮肤、消毒。次日将大鼠分为五组，即(1)模型组生理盐水10ml/kg；(2)雷公藤多甙组7.5mg/Kg；(3)清络通痹小剂量组3.6g生药/kg；(4)清络通痹中剂量组7.2g生药/kg；(5)清络通痹大剂量组14.4g生药/kg。各组按10ml/kg灌胃给药，共给8日。停药后次日脱椎处死大鼠，取出棉球，剔除脂肪组织。称取棉球的干重(60℃烘干)，计算肉芽组织干重及其抑制率，结果见表2。
表2清络通痹颗粒对大鼠棉球肉芽肿形成的影响(x±S，n＝10)组别 剂量(g/Kg)肉芽组织干重(mg)抑制率(％)模型组 -- 46.5±3.4 --雷公藤多甙组 7.5mg/kg 31.7±5.4**31.8清络通痹小剂量组 3.6g生药/kg 43.5±4.1 6.5清络通痹中剂量组 7.2g生药/kg 35.6±7.4**23.4清络通痹大剂量组 14.4g生药/kg 25.9±2.5**44.3与模型组比较 **P＜0.01
表2结果表明清络通痹中剂量、大剂量两个剂量组均能明显减少肉芽组织重量，与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)。
2.1.3 清络通痹颗粒对小鼠热刺激所致疼痛反应的影响(热板法)取18-22gICR雌性小鼠，恒温(55±0.5℃)热刺激致痛，预先测定痛阈值(以小鼠舔后足为疼痛反应信息，以痛反应的潜伏期为痛阈指标，若痛阈不超过30s为合格小鼠)。挑选合格小鼠50只，随机分为五组，即(1)模型组生理盐水10ml/kg；(2)消炎痛组12.5mg/Kg；(3)清络通痹小剂量组7.2g生药/kg；(4)清络通痹中剂量组14.4g生药/kg；(5)清络通痹大剂量组28.8g生药/kg。各组均灌胃给药三天，并于末次给药后30、60、90、120min各测其痛阈值。结果见表3。
表3 清络通痹颗粒对小鼠的镇痛作用(热板法)(x±SD，n＝10)组别 剂量 痛 阈 值 (s)给药前30min 60min 90min 120min模型组 -- 20.7± 27.0± 22.9± 22.3± 21.5±6.3 13.6 10.6 8.64.8消炎痛12.5mg/kg20.6± 36.7± 37.3± 39.2± 29.9±片组 4.4 13.7**8.9**## 10.1**## 9.6*#清络通7.2g生药 20.0± 28.7± 31.0± 35.7± 25.7±痹小剂 /kg 5.4 7.9 7.8** 8.6**##8.3量组清络通14.4g生 18.9± 37.3± 35.2± 37.5± 30.9±痹中剂药/kg4.8 13.6**14.3**# 15.9**#9.0*#量组清络通28.8g生 18.5± 20.6± 24.0± 23.7± 32.8±痹大剂药/kg5.4 4.7 9.3 7.59.2*#量组与给药前比较*P＜0.05 **P＜0.01 与生理盐水组比较#P＜0.05 ##P＜0.01表3结果表明清络通痹颗粒的三个剂量组均能不同程度提高小鼠的痛阈值，与给药前及模型组比较差异显著。
此外，还观察了清络通痹颗粒对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响及清络通痹颗粒对小鼠化学刺激所致疼痛反应的影响(扭体法)。结果表明清络通痹中剂量组、大剂量两个剂量组均能明显对抗醋酸所致小鼠腹腔毛细血管的通透性的增加；清络通痹中剂量、大剂量两个剂量组能显著降低小鼠扭体反应次数。
2.1.4 讨论类风湿性关节炎是以滑膜炎为基础的关节病变，病理过程有炎症(渗出、浸润)、增生、肉芽组织形成诸阶段，临床主要表现为关节的疼痛、肿胀、活动障碍。因此，抗炎、镇痛是清络通痹颗粒治疗类风湿性关节炎的基本药理学效应。本实验结果表明清络通痹颗粒能抑制大鼠角叉菜胶性足肿胀及棉球肉芽肿的形成，降低小鼠腹腔毛细血管的通透性，提示对炎症渗出、水肿及胶原纤维的增生有明显的抑制作用；清络通痹颗粒能减轻热刺激、化学刺激所致的小鼠的疼痛性反应，表明一定剂量的清络通痹颗粒有较好的抗炎和镇痛作用。
2.2 清络通痹颗粒对佐剂性关节炎大鼠炎症改变的影响2.2.1 清络通痹颗粒对佐剂性关节炎的原发病变的影响取雄性大鼠60只，160-200g，随机分为六组，即①正常对照组生理盐水10ml/kg；②模型组生理盐水10ml/kg；③雷公藤多甙片组雷公藤多甙片7.5mg/kg；④清络通痹小剂量组3.6g生药/kg；⑤清络通痹中剂量组7.2g生药/kg；⑥清络通痹大剂量组14.4g生药/kg。各组按10ml/kg灌胃给药，共给5日。于第3日给药30min后，除生理盐水组外在各组大鼠右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂0.05ml/只(其中含卡介苗7.5mg/ml)，生理盐水组大鼠在其右后足跖皮内注射等量生理盐水，然后继续给药2天。用容积法测定致炎前与致炎后12、18、24、48h大鼠足跖容积，以致炎前后足跖容积之差为肿胀程度。结果见表4。
表4清络通痹颗粒对弗氏完全佐剂致大鼠原发病变足肿胀的影响(x±s，n＝10)致炎前致炎后足肿胀度(ml)(h)组别 剂量 足容积(ml)121824481.49± 0.08± 0.13± 0.13± 0.06±正常对照组10ml/kg0.12 0.06 0.06 0.08 0.041.58± 0.43± 0.76± 0.81± 0.73±模 型 组10ml/kg0.06 0.06**0.12**0.11**0.14**雷公藤多甙片 1.61± 0.25± 0.40± 0.51±0.59±7.5mg/kg组0.10 0.19Δ0.14ΔΔ0.25ΔΔ0.26清络通痹小剂 3.6g生药1.35± 0.51± 0.62± 0.78±0.62±量组/kg 0.14 0.210.15Δ0.15 0.25清络通痹中剂 7.2g生药1.57± 0.38± 0.47± 0.59± 0.42±量组/kg 0.08 0.17 0.19ΔΔ0.21ΔΔ0.15ΔΔ清络通痹大剂 14.4g生药 1.57± 0.37± 0.59± 0.59± 0.54±量组/kg 0.13 0.170.20Δ0.19ΔΔ0.26
*P＜0.05 P＜0.01与对照组比较ΔP＜0.05ΔΔP＜0.01与模型组比较表4结果表明清络通痹三个剂量组均能不同程度降低弗氏完全佐剂所致大鼠原发病变的足肿胀度，与模型组比较差异显著(P＜0.05、P＜0.01＝。
2.2.2 清络通痹颗粒对多发性关节炎(继发性病变)的影响取雄性大鼠60只，160-200g，随机抽取10只用生理盐水0.05ml/只注射于右后足跖皮内，另50只用弗氏(Freund’s)完全佐剂0.05ml/只(其中含卡介苗7.5mg/ml)注射于右后足跖皮内，致炎一周后将大鼠随机分为五组，加上正常对照组共为6组。即①正常对照组生理盐水10ml/kg；②模型组生理盐水10ml/kg；③雷公藤多甙片组雷公藤多甙片7.5mg/kg；④清络通痹小剂量组3.6g生药/kg；⑤清络通痹中剂量组7.2g生药/kg；⑥清络通痹大剂量组14.4g生药/kg。各组每日灌胃给药1次，连续给药21日。并于注射佐剂前及注射佐剂后用容积法测定大鼠左右足跖容积(分别于第8、10、14、18、22、28天测定)。同侧足跖于给佐剂前后容积之差为肿胀度(ml)，同时观察大鼠前肢、耳部、尾部等部位的病变。然后处死各组大鼠，立即取肾上腺、胸腺、脾脏称重，并对大鼠踝关节进行关节病理学检查。结果见表5、6、7、8、9。
表5清络通痹颗粒对弗氏完全佐剂致大鼠继发病变足肿胀的影响(右足)(x±*P＜0.05 **P＜0.01与正常对照组比较ΔP＜0.05ΔΔP＜0.01与模型组比较致炎前致炎后足肿胀度(ml)(h)组别剂量足容积(ml)8d 10d 14d18d 22d 28d0.19± 0.19± 0.21± 0.23± 0.22± 0.24±正常对照组10ml/kg 1.54±0.080.10 0.100.10 0.08 0.11 0.090.83± 0.97± 1.14± 1.44± 1.26± 1.08±模 型 组10ml/kg 1.57±0.050.34** 0.18** 0.17** 0.41** 0.40**0.32**雷 公 藤 0.74± 0.78± 0.82± 0.90± 0.83± 0.77±7.5mg/kg 1.57±0.07多甙片组 0.20 0.21Δ0.34Δ0.31ΔΔ0.32Δ0.34Δ清络通痹 0.76± 0.81±0.91± 1.04± 0.93± 0.82±3.6g生药/kg 1.53±0.09小剂量组 0.21 0.17Δ0.20Δ0.36Δ0.330.23清络通痹 0.74± 0.77±0.78± 0.91± 0.83± 0.74±7.2g生药/kg 1.55±0.09中剂量组 0.27 0.22Δ0.29ΔΔ0.14ΔΔ0.27Δ0.38Δ清络通痹 14.4g生药 0.67± 0.70±0.75± 0.86± 0.76± 0.68±1.56±0.16大剂量组 /kg 0.17 0.19ΔΔ0.17ΔΔ0.21ΔΔ0.35ΔΔ0.30ΔΔ
*P＜0.05 **P＜0.01与正常对照组比较ΔP＜0.05ΔΔP＜0.01与模型组比较表6清络通痹颗粒对弗氏完全佐剂致大鼠继发病变足肿胀的影响(左足)(x±s，n＝10)致炎前致炎后足肿胀度(ml)(h)组别 剂量 足容积(ml) 8d10d 14d 18d 22d 28d正常对照 1.54± 0.08± 0.12± 0.16± 0.16± 0.16± 0.15±10ml/kg组 0.08 0.05 0.06 0.07 0.09 0.06 0.071.55± 0.16± 0.23± 0.49± 0.68± 0.61± 0.57±模型组 10ml/kg0.06 0.08* 0.08**0.16**0.21**0.18**0.12**雷公藤多 1.56± 0.22± 0.27± 0.31± 0.34± 0.27± 0.26±7.5mg/kg甙片组 0.06 0.06 0.08 0.08ΔΔ0.10ΔΔ0.10ΔΔ0.08ΔΔ清络通痹 3.6g生 1.53± 0.21± 0.26± 0.33± 0.37± 0.33±0.33±小剂量组 药/kg 0.14 0.07 0.10 0.16Δ0.25ΔΔ0.21ΔΔ0.20ΔΔ清络通痹 7.2g生 1.56± 0.20± 0.24± 0.28± 0.33± 0.29±0.27±中剂量组 药/kg 0.08 0.10 0.13 0.15ΔΔ0.18ΔΔ0.17ΔΔ0.11ΔΔ清络通痹 14.4g生 1.55± 0.18± 0.22± 0.26± 0.29± 0.27±0.25±大剂量组 药/kg 0.15 0.08 0.12 0.08ΔΔ0.20ΔΔ0.16ΔΔ0.14ΔΔ*P＜0.05 **P＜0.01与正常对照组比较ΔP＜0.05ΔΔP＜0.01与模型组比较表5，6结果表明，清络通痹颗粒三个剂量组能明显抑制弗氏完全佐剂引起的大鼠致炎侧和对侧后肢因迟发型超敏反应引起的足肿胀，与模型组比较具有显著性差异(P＜0.05、P＜0.01)。
表7 清络通痹颗粒对弗氏完全佐剂性关节炎大鼠结节的影响结节出现动物数(n) 结节出现动物数结节发生组别 剂量动物总数(n)耳部前肢尾部 率(％)(n)10ml/k正常对照组 10 00 0 0 0g10ml/k模型组 10 00 7 770**g雷公藤多甙 7.5mg/10 01 4 440片组 kg清络通痹小 3.6g生10 00 5 550剂量组 药/kg清络通痹中 7.2g生10 00 4 440剂量组 药/kg14.4g清络通痹大生药 10 00 2 220Δ剂量组/kg**P＜0.01与正常对照组比较ΔP＜0.05ΔΔP＜0.01与模型组比较表7结果表明，模型组大鼠于12天后尾部关节有结节状突起，呈串珠状。前肢与耳部无结节，但耳部有红色斑点出现。清络通痹颗粒能降低上述结节的发生率，其中大剂量组与模型组相比差别有显著性(P＜0.05)。
表8 清络通痹颗粒对佐剂性关节炎大鼠胸腺、脾脏、肾上腺重量的影响(x±s)动物数胸腺脾脏 肾上腺组别 剂量(只) (g/100g)(g/100g) (g/100g)正 常 对 照 组 10ml/kg 10 0.53±0.03 1.29±0.30 0.40±0.03模型组 10ml/kg 10 0.56±0.05 1.30±0.33 0.41±0.03雷公藤多甙片组 7.5mg/kg 10 0.55±0.07 1.70±0.43* 0.41±0.03清络通痹小剂量组 3.6g生药/kg10 0.61±0.13 1.48±0.43 0.45±0.07清络通痹中剂量组 7.2g生药/kg10 0.55±0.05 1.51±0.37 0.39±0.02清络通痹大剂量组 14.4g生药/kg 10 0.56±0.08 1.21±0.20 0.41±0.05
*P＜0.05与模型组比较。
表8结果表明，清络通痹颗粒对佐剂性关节炎大鼠胸腺、脾脏、肾上腺重量无明显影响，与模型组相比差别无显著性(P＞0.05)。
2.2.3 清络通痹颗粒对佐剂性关节炎大鼠关节病理组织学的影响表9清络通痹颗粒对佐剂性关节炎大鼠关节病理组织学的影响(右足)关节 关节软骨 滑膜炎 肉芽组织 关节外软组织组别数破坏 症 形成 炎症正常对照组5 0/5 0/5 0/5 0/5模 型 组5 5/5 5/5 4/5 5/5雷公藤多甙5 1/5 5/5 0/5 5/5片组清络通痹小剂量组5 0/5 5/5 1/5 5/5清络通痹中5 3/5 4/5 4/5 3/5剂 量 组清络通痹大剂量组5 3/5 2/5 2/5 3/5由实验结果可以看出，佐剂性关节炎大鼠出现明显的关节软骨破坏，纤维化，滑膜有不同程度充血、水肿及大量炎细胞浸润，肉芽组织增生，证实本组动物模型具有类风湿性关节炎的病理特征，类风湿性滑膜炎、类血管翳改变及增殖性、破坏性病变同时存在[67]，并与国内报道实验性类风湿性关节炎模型大鼠病理形态学改变基本一致[68]，说明模型制作是成功可靠的，清络通痹三个剂量组可不同程度改善上述病变，能够减少大鼠关节软骨破坏、滑膜炎症、肉芽组织形成、关节外软组织炎症的关节数，并能减轻其病理变化程度。
2.2.4 清络通痹颗粒对佐剂性关节炎大鼠关节超微结构的影响每组选取1只大鼠作关节的超微结构观察。标本用5％戊二醛固定2h，再用1％锇酸固定1h，常规脱水，用环氧树脂618包埋，超薄切片后用醋酸铀——柠檬酸铅双重染色，在透射电镜下观察超微结构。
模型组成纤维细胞功能活跃，胶原纤维多而密集，滑膜下肥大细胞较多见，毛细血管壁明显增厚，管腔窄小，内皮细胞胞质中细胞器丰富，常见线粒体肿胀和较多的小泡，血管周围常见一些含有较多溶酶体的细胞。
清络通痹颗粒大剂量组滑膜细胞及成纤维细胞无明显增生，胶原纤维成束排列，见有少量淋巴细胞和巨噬细胞分布于结缔组织中，毛细血管基本正常。
2.2.5 讨论本实验结果显示，三个剂量组均能不同程度降低弗氏完全佐剂所致大鼠佐剂性关节炎原发病变的足肿胀度；能明显抑制弗氏完全佐剂引起的大鼠佐剂性关节炎的继发病变包括抑制致炎侧和对侧后肢因迟发型超敏反应引起的足肿胀，降低尾部关节有串珠状结节状突起的发生率，以大剂量组效果犹为明显；清络通痹三个剂量组可不同程度改善佐剂性关节炎大鼠关节软骨破坏，滑膜炎症及肉芽组织形成，关节外软组织炎症及超微结构的改变。上述结果提示，一定剂量的清络通痹颗粒可防止佐剂性关节炎大鼠关节及关节外组织的炎症及组织破坏，对佐剂性关节炎大鼠的原发病变及继发病变均有明显抑制作用。
2.3 清络通痹颗粒对佐剂性关节炎大鼠T淋巴细胞增殖反应和B淋巴细胞增殖反应的影响2.3.1 模型的制作、分组及处理取雄性大鼠60只，160-200g，随机抽取10只用生理盐水0.05ml/只注射于右后足跖皮内，另50只用弗氏(Freund’s)完全佐剂0.05ml/只(其中含卡介苗7.5mg/ml)注射于右后足跖皮内，致炎一周后将大鼠随机分为五组，加上正常对照组共为6组。即①正常对照组生理盐水10ml/kg；②模型组生理盐水10ml/kg；③雷公藤多甙片组雷公藤多甙片7.5mg/kg；④清络通痹小剂量组3.6g生药/kg；⑤清络通痹中剂量组7.2g生药/kg；⑥清络通痹大剂量组14.4g生药/kg。各组每日灌胃给药1次，连续给药21日。
2.3.2 标本采集及处理将每组随机抽取4只大鼠颈动脉放血处死，放入1∶1000新洁尔灭浸泡，开腹取脾，将脾脏尼龙网包裹放入培养皿中，用针芯研磨，然后将脾细胞悬液放入离心管中，离心后去上清液，加0.83％NH4Cl溶液(去除红细胞)后离心，弃上清液，加入D-Hank’s液冲洗2次，离心后进行细胞计数[细胞总数＝(四大方格细胞数÷4)×104×稀释倍数]，用RPMI-1640培养液配制成1×1010/L的脾细胞悬液加入96孔培养板，每孔100μl，再加入含ConA或LPS的RPMI-1640液100μl(ConA的终浓度为3mg/L，LPS的终浓度为12mg/L)置5％CO2培养箱37℃培养48h，轻轻吸弃上清100μl，加入MTT(5mg/ml)10μl，于振荡器振荡1min，放置5％CO2培养箱37℃反应4h，取出反应物，离心(1800rpm，10min)吸弃上清，每孔加入酸化异丙醇120μl，于振荡器上振荡30s，酶标仪570nm处读取A值。
2.3.3 统计方法数据以X±S表示，各组间比较采用两样本均数比较的t检验。
2.3.4 实验结果表10 清络通痹颗粒对佐剂性关节炎大鼠T淋巴细胞增殖反应的影响(X±S)组别剂量 动物数(n)A值正常对照组 10ml/kg40.185±0.038模型组 10ml/kg40.507±0.147**雷公藤多甙片7.5mg/kg 40.218±0.059Δ组清络通痹小剂3.6g生药/kg40.295±0.065Δ量组清络通痹中剂7.2g生药/kg40.299±0.084Δ量组清络通痹大剂 14.4g生药40.276±0.047Δ量组 /kg**P＜0.01与正常对照组比较，ΔP＜0.05与模型组比较。
表11 清络通痹颗粒对佐剂性关节炎大鼠B淋巴细胞增殖反应的影响(X±S)组别 剂量动物数(n)A值正常对照10ml/kg 4 0.228±0.030组模型10ml/kg 4 0.575±0.172**组雷公藤多甙片7.5mg/kg 4 0.348±0.047Δ组清络通痹小剂3.6g生药/kg 4 0.364±0.091量组清络通痹中剂7.2g生药/kg 4 0.324±0.048Δ量组清络通痹大剂14.4g生药/kg 4 0.318±0.403Δ量组
**P＜0.01与正常对照组比较，ΔP＜0.05与模型组比较。
由表10，11结果可知，模型组与正常对照组比较ConA、LPS分别诱导的淋巴细胞增殖能力明显增高，清络通痹颗粒三个剂量组T、B淋巴细胞增殖能力明显降低，与模型组比较有显著差异。
2.3.5 讨论本实验结果显示，清络通痹颗粒三个剂量组对ConA诱导的淋巴细胞增殖有明显的抑制作用，与模型组比较，差别有显著性。此外，清络通痹颗粒大、中剂量组对LPS诱导的B淋巴细胞增殖亦有明显的抑制作用，反映了清络通痹颗粒对佐剂关节炎大鼠过强的免疫反应有较强的调节作用，这可能是清络通痹颗粒治疗类风湿性关节炎的作用原理之一，可能是本品在体内通过对繁殖增生较快的免疫活性细胞如B细胞、TH细胞的直接抑制，从而抑制亢进的体液免疫反应，包括抑制自身抗体的产生、缓解或阻断由免疫反应所致组织(如关节滑膜)的炎症过程。
2.4 清络通痹颗粒对佐剂性关节炎大鼠IL-1及PGE2的影响2.4.1 模型的制作、分组及处理取雄性大鼠40只，160-200g，随机抽取10只用生理盐水0.05ml/只注射于右后足跖皮内，另30只用弗氏(Freund’s)完全佐剂0.05ml/只(其中含卡介苗7.5mg/ml)注射于右后足跖皮内，致炎一周后将大鼠随机分为三组，加上正常对照组共为4组。即①正常对照组生理盐水10ml/kg；②模型组生理盐水10ml/kg；③清络通痹I组7.2g生药/kg；④清络通痹II组14.4g生药/kg。各组每日灌胃给药1次，连续给药21日。
2.4.2 清络通痹颗粒对佐剂关节炎大鼠腹腔巨噬细胞产生白细胞介素I(IL-1)的影响①IL-1诱生大鼠颈动脉放血，给SD大鼠腹腔内注入冷的含10％小牛血清的1640 10ml，轻揉腹部后取腹腔液，离心洗涤用24孔培养板制备细胞单层(巨噬细胞单层)，每孔再加1ml培养液，继续置5％CO2、37℃中培养24小时，-30℃保存待测。②IL-1活性测定用小鼠胸腺细胞增殖法，取C57BL/6小鼠胸腺制备单个细胞悬液，用含10％小牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为2×107个/ml，加入3μg/ml的ConA，迅速混匀，尽快加入96孔培养板中，每孔0.1ml，含细胞2×106个。在加入ConA-胸腺细胞前，先将待测样品每孔加0.1ml，置5％CO2、37℃中培养60小时，每孔加0.2μci3H-TdR，继续培养12小时，收集细胞，测定3H-TdR掺入cpm值，结果见表12。
表12清络通痹颗粒对佐剂关节炎大鼠腹腔巨噬细胞产生白细胞介素I(IL-1)的影响(x±S)组 别 剂量 动物数(n) IL-1(cpm)正常对照组 -- 8 685.2±67.4模型组 -- 8 2563.5±318.8**清络通痹I组7.2g生药/kg 8 1895.7±363.1ΔΔ清络通痹II组 14.4g生药 8 1443.6±288.2ΔΔ/kg*P＜0.05**P＜0.01与正常对照组比较ΔΔP＜0.01与模型组比较表12结果表明清络通痹各剂量组均能明显降低佐剂关节炎大鼠腹腔细胞产生白细胞介素I的水平，与模型组比较差异显著。
2.4.3 清络通痹颗粒对佐剂关节炎大鼠前列腺素E2(PGE2)的影响大鼠颈动脉放血，以2％EDTA-Na2抗凝，分离血浆，用FMJ-182放射免疫γ计数器测定前列腺素E2(PGE2)，结果见表13。
表13清络通痹颗粒对佐剂关节炎大鼠血浆前列腺素E2(PGE2)的影响(x±S)组别 剂量 动物数(n) PGE2(cpm)正常对照组 -- 8 365.5±62.1模型组 -- 8 713.7±87.3ΔΔ清络通痹中剂量 7.2g生药/kg8 597.3±86.0*组清络通痹大剂量 14.4g生药 8 533.6±77.8**组 /kg*P＜0.05**P＜0.01与正常对照组比较ΔΔP＜0.01与模型组比较表13结果表明清络通痹颗粒各剂量组均能明显降低佐剂关节炎大鼠血浆PGE2值，与模型组比较差异显著。
2.4.4 讨论细胞因子白细胞介素-1(IL-1)与类风湿性关节炎密切相关。在类风湿性关节炎患者全血中IL-1明显增加，炎性滑液中可检出高活性的IL-1。其主要由单核巨噬细胞产生，在免疫与炎症反应中有复杂的放大效应，能活化淋巴细胞，刺激B细胞产生抗体增加，还能促进纤维母细胞增生，诱导前列腺素E2和胶原酶的产生，引起关节炎，软骨组织的破坏，同时能增强破骨细胞的活性，促进骨脱钙，导致骨质疏松，骨质破坏，刺激血管内皮细胞增殖，增加凝血酶元活性及中性粒细胞对血管壁的粘附，使血管壁损伤、增厚，血栓形成，加重关节损伤。本实验结果表明清络通痹中剂量及大剂量组能显著降低佐剂性关节炎大鼠的腹腔巨噬细胞产生的IL-1水平，说明其具有抑制细胞因子异常产生的作用。
前列腺素E2是一种重要的炎症介质，主要由巨噬细胞产生。它不仅与炎症反应如局部充血、水肿及疼痛等症状密切相关，且已知与骨质的破坏和修复有关，高浓度的PGE2能使骨组织吸收破坏增加，是促进骨及关节破坏的又一因素。本实验结果提示清络通痹中剂量及大剂量组能明显降低佐剂性关节炎大鼠血浆PGE2值，表明其与抑制IL-1异常产生、减少IL-1诱导关节和肌肉PGE2的合成有关。
由此推测，降低IL-1和PGE2水平是养阴清热、宣痹通络法治疗类风湿性关节炎的主要药理学基础，从而起到减轻关节病变，阻止骨质破坏发生、发展的作用。
其它的实验结果还提示清络通痹颗粒大、中剂量组可降低血瘀大鼠全血粘度、血浆粘度及红细胞压积；清络通痹颗粒能明显降低佐剂性关节炎大鼠血浆血栓烷B2(TXB2)、肿瘤坏死因子(TNF)水平；抑制滑膜细胞分泌TNF；明显提高机体内源性抗氧化酶SOD的活性，降低血清一氧化氮(NO)的含量。
综上所述，清络通痹颗粒具有抗炎镇痛、调节免疫紊乱、抗氧化、抗高凝、抑制肉芽组织增生等多种药理学作用，为养阴清热、宣痹通络法及方药的临床应用提供了客观依据。
(四)实施例四临床试验采用随机数字表法将118例类风湿性关节炎患者随机分为清络通痹颗粒组(简称治疗组)和雷公藤多甙片组(简称对照组)，其中治疗组63例，对照组55例。临床观察了两组治疗前后主要症状体征及类风湿因子、血沉、C反应蛋白、免疫球蛋白、T淋巴细胞亚群等实验室指标的变化。
1、治疗方法(1)治疗组用清络通痹颗粒(每包5g，含生药29g)，每次1包，1日3次，温开水冲服。
(2)对照组用雷公藤多甙片，每次20mg，1日2~3次，口服。
(3)疗程两组均以3个月为1疗程。
2、纳入标准确诊为类风关、中医辨证属阴虚络热证的住院和门诊病人，可纳入试验病例。
3、治疗结果疗效比较见下表治疗组与对照组疗效比较例 临床临床治愈 总有 Ridit组别显效 有效 无效数 治愈 显效率效率90.48％治疗 63 9.52％ 28.57％ 52.38％ 9.52％ 38.10％(57组 (6例)(18例) (33例) (6例)(24例)例)83.64％对照 55 0.00％ 20.00％ 63.64％ 16.36％ 20.00％(46组 (0例)(11例) (35例) (9例)(11例)例)P值 ＜0.05 ＞0.05＜0.05如表所示，治疗组临床治愈率为9.52％，临床治愈显效率为38.10％，总有效率为90.48％；对照组分别为0.00％、20.00％、83.64％。两组经Ridit检验，差异有显著性(P＜0.05)，治疗组的疗效优于对照组；其中治疗组的临床治愈显效率明显高于对照组(P＜0.05)。
临床观察结果表明治疗组在改善关节功能障碍、关节压痛、晨僵及双手握力、15米步行时间等主要症状体征方面，治疗组的作用优于对照组(P＜0.05或P＜0.01)；在降低类风湿因子(RF)滴度、血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)及异常增高的免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)，调整辅助性T细胞(CD4+)与抑制性T细胞(CD8+)的比值等方面也优于对照组(P＜0.05或P＜0.01)。药物安全性观察，患者服药后未见明显副作用，治疗前后检查肝、肾功能未见异常变化。雷公藤多甙片对照组出现胃肠道、肝、血液、生殖系统等方面的不良反应。证实清络通痹颗粒对类风湿性关节炎阴虚络热证有良好疗效，且无明显毒副反应。
权利要求
1.一种治疗类风湿性关节炎的清络通痹制剂，其特征在于主要有下列重量配比的组方所组成生 地10～25g 青风藤10～25g桑寄生10～25g 豨莶草10～25g三七粉2～6g炙僵蚕10～15g雷公藤5～15g 络石藤10～25g
2.根据权利要求1所述的治疗类风湿性关节炎的清络通痹制剂，其特征在于在上述组方中还可加土茯苓10～25g，黄柏5～15g；或可另加丹参10～25g，鬼箭羽10～25g，凌霄花10～25g；或加路路通10～25g，天仙藤10～25g。
3.根据权利要求1或2所述的治疗类风湿性关节炎的清络通痹制剂，其特征在于所述的制剂是颗粒剂、胶囊剂、片剂和水剂。
4.一种制备权利要求1所述清络通痹制剂的方法，具体步骤为(1)称取清络通痹制剂的八味，取三七粉碎成超细粉体，备用，其余生地等7味加水煎煮；(2)合并煎煮液后，微滤，滤液减压薄膜浓缩；(3)将浓缩液喷雾干燥成干粉；(4)把干粉加入三七超细粉体后混匀；(5)加适量辅料，混匀，干法制粒，分装，即得。
5.根据权利要求4所述的制备清络通痹制剂的方法，其特征是在步骤(1)中水煎两次，第一次11倍量水，煎煮1.5小时，第二次7倍量水，煎煮1小时。
6.根据权利要求4所述的制备清络通痹制剂的方法，其特征是在步骤(2)中的微滤是用孔径为0.2μm的无机陶瓷膜，滤液浓缩至相对密度1.08～1.10。
7.根据权利要求4所述的制备清络通痹制剂的方法，其特征是在步骤(3)中喷雾干燥的进风温度170℃，出风温度70℃。
8.根据权利要求4所述的制备清络通痹制剂的方法，其特征是在步骤(5)中所述的辅料是糊精和甜菊糖。
全文摘要
本发明公开了一种治疗类风湿性关节炎的清络通痹制剂，该制剂主要由生地、青风藤、桑寄生、豨莶草、三七粉、炙僵蚕、雷公藤、络石藤等原料药组成。其制备方法是用水煎煮、煎液微滤、减压浓缩、喷雾干燥、加辅料、干法制粒而成。经药理药效试验和临床应用，该制剂具有疗效显著、临床治愈显效率为38.10％，总有效率为90.48％，且药源丰富、价格低廉、服用方便、无明显毒副作用，在国内外有广阔的市场和良好的开发前景，推广应用后将会取得显著的社会效益和经济效益。
文档编号A61K9/16GK1557395SQ20041001396
公开日2004年12月29日 申请日期2004年1月19日 优先权日2004年1月19日
发明者周学平, 周仲瑛, 郭立玮, 方泰慧 申请人:南京中医药大学