专利名称：脉络宁注射剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种中药注射液“脉络宁”注射剂及其制备方法，属于中药制剂领域。
背景技术：
“脉络宁”是根据中医清热养阴、活血化淤的理论，采用名贵中药经提取精制而成的中药复方制剂，用于治疗脑血栓后遗症、心血管疾病、静脉血栓、大动脉血栓、脉管炎等周围血管疾病，在中成药中具有重要的地位。
脉络宁处方中四味中药为牛膝、玄参、石斛和金银花，其中牛膝主要化学成份三萜皂甙，水解后生成齐墩果酸，并含有脱皮甾酮和牛膝甾酮。此外，尚含有寡聚糖、多糖等。其中主要成分之一为蜕皮甾酮，蜕皮甾酮易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯。药理实验表明对动物有降低血糖和胆固醇的作用。
玄参主要化学成份为环烯醚萜、苯丙素苷、三萜皂苷和有机芳酸四种类型。其中主要有效成份为桂皮酸，溶于醇，易溶于乙酸乙酯。桂皮酸临床中发现有升高白细胞作用，近年动物实验证实确有升白作用，动物实验还发现能提高外周白细胞及血小板数等。
石斛为铁皮石斛、罗河石斛、广东石斛、细径石斛等的加工品。主要含石斛碱、石斛次碱、6-羟基石斛碱。据报道，尚分离得五种季铵生物碱。还分离得阿牙品、滨蒿内酯等。生物碱易溶于乙醇、甲醇；滨蒿内酯易溶于甲醇、乙醇、氯仿等。其中石斛碱有止痛作用，对血压和呼吸有抑制作用等；滨蒿内酯有降血压作用。0.4-10mg/kg静注或十二指肠给药，对全麻或局麻大鼠、猫与兔均有显著降压效果。此作用不被六烃季胺和阿托品阻断，不被苄胺唑啉所加强，也不能对抗肾上腺素的升压作用。以1/50-1/10静注射量作椎动脉注射时，降血压强度和全量静注大致相等，提示其降压作用可能为中枢性的。滨蒿内酯对在位兔心和猫心的收缩力有增强作用。滨蒿内酯还可使离体兔心冠脉流量增加。
金银花中主要含木犀草素、绿原酸、异绿原酸、木犀草素-7-葡萄糖甙(木犀草甙)、5-羟基-3′，4′，7-三甲氧基黄酮等。以上成份绿原酸，在热水中溶解度较大，易溶于乙醇，极微溶于乙酸乙酯，具有较广泛抗菌作用，有止血、增高白血球及抗病毒作用；木犀草素溶于乙醇和碱性溶液；木犀草甙微溶于水、甲醇、乙醇，可溶于热水、热甲醇及乙醇。对心血管的作用木犀草素、本犀草甙有降低兔实验型动物粥样硬化中胆甾醇的作用，皮下注射有增强毛细血管的作用，其中木犀草素可使动脉压增加而降低静脉压，增加冠状动脉血流量。
传统的“脉络宁”注射液制备工艺复杂，采用水煮醇沉的方法提取有效成分，然后使用乙酸乙酯萃取提纯；例如，中国专利CN92107848.X公开了一种“脉络宁静脉注射液的工艺方法”，该方法将金银花、牛膝、玄参、石斛按照一定的重量比配伍，充分混合后放置于反应釜内加水浸煮，两次水煎后合并煎液，使用乙醇沉淀，最终含醇量为70-75％，将醇液浓缩，去除余醇，用醋酸乙酯萃取7-10次，得到药物的有效成分。该方法制备的脉络宁注射液用于血栓闭塞性脉管炎157例，治愈率48.4％，显效率45.85％，总有效率97.5％；用于脑血栓形成及后遗症52例，基本治愈率20.5％，显效率38.5％，好转率30.8％，总有效率84.74％。
作为血栓性疾病的理想药品，上述制备方法得到的脉络宁产品，依然存在鞣质等杂质去除不彻底，以乙酸乙酯萃取，仍有鞣质可以被萃取到乙酸乙酯中，有效成分含量不均衡的问题，影响药物的总体质量，如果对药物有效成分的提取做进一步的改善，提高药物的纯度，对有效成分做更为具体的控制，则会明显的提高药品质量，增强药效。有待于做进一步的改进或研制新的工艺方法。
与此同时，传统的脉络宁为静脉注射液，本身不可避免的存在稳定性差，遇光易出现有效成分下降，不易长期储存的弊端，如果将其制备为粉针剂，则会有助于上述问题解决。粉针剂为注射用无菌粉末的简称，凡对热不稳定或在水溶液中易分解的药物，如某些抗生素、酶制剂及生化制品，由于不能制成一般的水溶性注射液或不适宜加热灭菌，长期储存，均需制成注射用无菌粉末，即粉针剂。由于注射液的稳定性较其他剂型相比不甚理想，近年来，为提高中药注射剂的稳定性，已有部分中药注射液研制成粉针剂使用。
粉针剂的生产必须在无菌室内进行，按药物的性质不同，可以将原料药精制成无菌粉末，在无菌条件下直接分装于洁净灭菌小瓶或安瓿中密封制成；或是将将药物制成无菌水溶液，以无菌操作灌装，经冷冻干燥后，在无菌条件下密封而成。习惯上，前者称无菌粉末直接分装法，制成品为无菌分装产品；后者称无菌水溶液冷冻干燥法，制成品为冷冻干燥制品。目前，中药粉针剂以冻干制品为多。
粉针剂质量要求与注射用水溶液一致，应符合《中国药典》中关于注射用药物的各项规定及注射用无菌粉末的各项检查标准。
冷冻干燥法是将药液先经无菌分装后冷冻成固体，然后在低温及高真空的条件下，使药液中的水分升华而除去，在无菌条件下，加盖橡皮塞、铝盖密封制成。应用此法能避免药品因高热而分解变质，所得制品质地舒松，加水后迅速溶解，含水量低，一般在1-3％范围内，有利于药品贮存。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中药“脉络宁”注射剂。
本发明的另一目的在于提供一种中药“脉络宁”注射剂的制备方法。
传统的中药制剂“脉络宁”注射液为中药复方，由牛膝、玄参、石斛和金银花4味中药组配；通过水煮醇沉提取其有效成分，后经乙酸乙酯萃取得到提纯产物，配制而成。其有效成分的提取中，去除鞣质等杂质不彻底，影响注射液的质量。
本发明所述的脉络宁注射剂，含有如下重量份的原料组分牛膝100-1000 玄参100-1000石斛100-1000 金银花100-1000上述牛膝、玄参、石斛与金银花经两级醇提得到药物有效成分，再经乙酸乙酯萃取分离，得到药物有效成分。
其中，一级醇沉使用的醇溶液为含醇量0％-99.5％的乙醇水溶液，二级醇沉时的上清液的含醇量为75-85％。
上述的乙酸乙酯萃取分离步骤也可以大孔树脂提纯步骤代替，同样实现本发明目的。
上述本发明方法也可以在一级醇提和一次醇沉之间增加一明胶沉淀步骤，更加有利于药物有效成分的提取，在此情况下，依然可以实现本发明的目的。
本发明方法还可以是将上述牛膝、玄参、石斛与金银花经醇提得到有效成分，再经明胶水溶液或ZTC澄清剂进行处理，最后使用大孔树脂提纯，得到药物有效成分。
本发明方法进一步可以是将上述牛膝、玄参、石斛与金银花经水提得到有效成分，再经ZTC澄清剂处理，上清液醇沉后使用大孔树脂提纯，得到药物有效成分。
上述脉络宁注射剂中，滨蒿内酯含量按照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈—水(1∶4)为流动相；检测波长343nm，理论板数按滨蒿内酯峰计算应不低于2000。
对照品溶液的制备精密称取滨蒿内酯对照品适量，加甲醇制成每1ml中含5μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本发明产品50ml，加氯化钠5g，用氯仿提取3次，每次30ml，合并氯仿液，置水浴上蒸干，残渣加60％甲醇使溶解，并转移至25ml量瓶中，加60％甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
测定法分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本发明产品每1ml含石斛以滨蒿内酯(C11H10O4)计，滨蒿内酯含量为2.0-5.5μg/mL。
上述脉络宁注射剂中，总黄酮含量测定如下对照品溶液的制备精密称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品10mg，置100ml量瓶中，加50％甲醇适量，振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含芦丁0.1mg)。
标准曲线的制备精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，分别置10ml量瓶中，各加50％甲醇至5ml，加5％亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液0.6ml，摇匀，放置6分钟，加8.6％氢氧化钠溶液3ml，再加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，以相应的试剂为空白。照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V B)，在510nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
测定法精密量取本品2ml，置25ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取3ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，作为空白对照；另精密量取3ml，置10ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加50％甲醇至5ml”起，依法立即测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中相当于芦丁的重量，计算，即得。
本发明产品每1ml含总黄酮以芦丁(C27H30O16)计，总黄酮含量为2.0-3.5mg/mL。
本发明所述的脉络宁注射剂，按照高效液相色谱法(中国药典2000版一部附录VID)测定，流动相为甲醇-水-冰醋酸(45∶55∶0.2)，检测波长243nm，理论板数按肉桂酸峰计算≥1000；流动相为甲醇-水-冰醋酸(15∶85∶1)，检测波长330nm，理论板数按绿原酸峰计算≥1000。具体如下(1)取本发明产品10ml，加氨试液调节pH值至中性，用氯仿提取2次，每次15ml，合并氯仿液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取滨蒿内酯对照品，加甲醇制成每1m中含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI B)试验，量取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷—氯仿—醋酸乙酯(10∶15∶15)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(2)取样品作为供试品溶液。另取肉桂酸对照品适量，加甲醇制成每1ml中含50μl的溶液，作为对照品溶液。照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定，流动相为甲醇-水-冰醋酸(45∶55∶0.2)，检测波长243nm，理论板数按肉桂酸峰计算应不低于1000。供试品色谱图中有与对照品的保留时间相一致的色谱峰。
(3)取绿原酸对照品适量，加甲醇制成每1ml中含50μg的溶液，作为对照品溶液。照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)，取对照品溶液和鉴别(2)项下的供试品溶液测定，流动相为甲醇-水-冰醋酸(15∶85∶1)，检测波长330nm，理论板数按绿原酸峰计算应不低于1000，供试品色谱图中有与对照品的保留时间相一致的色谱峰。
本发明所述的脉络宁注射剂中肉桂酸含量为40-51μg/mL，绿原酸含量为140-205μg/mL，蜕皮甾酮含量为45-50μg/mL。
根据权利要求2所述的脉络宁注射剂，其特征在于，所述的脉络宁注射剂中间体中，重金属含量≤10ppm，砷盐≤1ppm，炽灼残渣≤1.5％(g/mL)，总固体13.5-25.5mg/mL。
根据权利要求3所述的脉络宁注射剂，其特征在于，所述的脉络宁注射剂中间体的蛋白质、鞣质、树脂、草酸盐、钾离子符合中国药典2000版一部注射剂项下的有关规定。
在提取有效成分后，本发明制得的注射剂可以是注射液或粉针剂。
在制备粉针剂时，可以根据需要，加入各种支架剂，例如葡萄糖、甘露醇、氯化钠、右旋糖苷、蔗糖、乳糖、明胶等，剂量控制在溶液重量的1-50％。
本发明提供的制备方法中，采用醇提的方法得到药物有效成分，加入明胶水溶液或ZTC澄清剂处理后，进行醇沉过滤，提纯处理得到最终产物。该方法工艺简单，所用制剂易于得到，鞣质等杂质去除彻底，得到的产品产率和纯度较高。
本发明所述的“脉络宁”粉针剂含有如下重量份的原料组分
牛膝100-1000 玄参100-1000石斛100-1000 金银花100-1000所述的重量份可以是g、kg、两、斤等常用计量单位。
本发明方法可通过如下步骤实现1)将上述组分中的牛膝、玄参、石斛冲洗干净，切成片或段或粉，与金银花一并投入提取罐内，加1-10倍量的0％-99.5％乙醇水溶液浸泡1小时后，40-85℃下加热回流提取1-5次，每次提取1-2小时，滤过，滤液备用；合并滤液，浓缩至相对密度为1.10-1.20(80℃)；2)加入95％乙醇，搅拌，使上清液乙醇含量在75-85％，0-10℃静置12-24小时，滤取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10-1.20(80℃)；3)加入1-3倍浓缩液体积的乙酸乙酯，萃取3-7次，每次萃取30-60分钟，合并上清液，回收乙酸乙酯，并除去乙酸乙酯，浓缩至稠膏(80℃)，为药物有效成分。
如制备冻干粉针剂，则向稠膏加入1-10倍量注射用水，搅拌，冷藏12-24小时，过滤，滤液加入0.1-0.6％的泊洛沙姆，搅拌溶解，加入0.8-0.9％的氯化钠，搅拌溶解，用10-40％NaOH溶液调PH为7-9之间，补充注射用水，加入溶液重量1-50％的支架剂，使用0.22-0.45um微孔滤膜精滤，得到的滤液在无菌条件下灌装于西林瓶或安瓿中冷却至0℃，然后放入冻干箱内，使冻干箱温度迅速降至-40～-60℃，使药液冷却，维持1-5小时，使其完全冻结；药液完全冻结后，将冻干箱内压力降至1.33～13.33Pa，同时维持冻干箱内温度为-60～-40℃，满足水的升华条件，使药液中的水分变为水蒸气；连通冷凝器，使其冷凝管降温，最低可至-60℃以下，使水蒸气在冷凝管上结霜，保持1-10小时，其间冻干箱搁板缓慢加热到20-40℃；即得干燥制品，然后将制品取出封口。
如制备注射液，则加入附加剂，按照现有技术方法，进行制备。
上述步骤3)也可以是使用大孔树脂进行纯化。
上述方法也可以在步骤1)和2)之间增加一步骤为向浓缩液中加入1/10体积的浓度为0.5％-10％明胶水溶液，搅拌，0-10℃放置12-24小时，离心，得上清液。
本发明方法也可以是1)将上述组分中的牛膝、玄参、石斛冲洗干净，切成片或段或粉，与金银花一并投入提取罐内，加1-10倍量的0％-99.5％乙醇水溶液浸泡1小时后，40-85℃下加热回流提取1-5次，每次提取1-2小时，滤过，滤液备用；合并滤液，浓缩至相对密度为1.10-1.20(80℃)；2)向浓缩液中加入1/10体积的浓度为0.5％-10％明胶水溶液，搅拌，0-10℃放置12-24小时，离心，得上清液；3)将上清液通过大孔树脂进行纯化，得到药物有效成分，配以辅料制备粉针剂或注射液。
本发明方法也可以是1)将上述组分中的牛膝、玄参、石斛冲洗干净，切成片或段或粉，与金银花一并投入提取罐内，加1-10倍量的水浸泡1小时后，40-85℃下加热回流提取1-5次，每次提取1-2小时，滤过，滤液备用；合并滤液，浓缩至相对密度为1.10-1.20(80℃)；2)向浓缩液中加入ZTC预处理剂A组分，煮沸15-20分钟后，静置4-5小时，离心分离得上层清液；再加入ZTC预处理剂A组分，煮沸15-20分钟后，静置3小时，过滤，滤液中加入ZTC澄清剂B组分，加热至沸，放置4-6小时，离心后过滤，滤液经多层滤纸板框压滤后，浓缩至比重1.10-1.20(80℃)；3)加入95％乙醇，搅拌，使上清液乙醇含量在75-85％，0-10℃静置12-24小时，滤取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10-1.20(80℃)；4)通过大孔树脂进行纯化，得到药物有效成分，配以辅料制备粉针剂或注射液。
与中国专利CN92107848.X相比，本发明方法有助于有效成分的完全提取，采用的除杂方法利于水溶性杂质去除完全，使得脉络宁药效明显提升，使用本发明方法得到的中药制剂较传统方法得到的产品在纯度上有了很大的提高，有效的去除了鞣质；而且，采用粉针剂代替传统的液态针剂，有效的延长了药物的有效期，使其具有很好的稳定性，药效可达3年以上。
具体实施例方式实施例1-1将石斛、玄参、牛膝各500g洗净切片，与金银花500g一起投入提取罐，加6倍量的30％乙醇水溶液浸泡1小时后，50℃下加热回流提取3次，每次提取1小时，滤过，滤液备用；合并滤液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.15(80℃)；向浓缩液中加入1/10体积的浓度为5％明胶溶液，搅拌，4℃放置12小时，离心，得上清液；向上清液中加入95％乙醇，搅拌，使上清液乙醇含量在85％，4℃静置12小时，滤取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.15(80℃)；加入1倍浓缩液体积的乙酸乙酯，萃取3次，每次萃取15分钟，合并上清液，回收乙酸乙酯，并除去乙酸乙酯，浓缩至稠膏(80℃)。
加入3倍量注射用水，搅拌，冷藏12小时，过滤，滤液加入0.1％的泊洛沙姆，搅拌溶解，加入0.8％的氯化钠，搅拌溶解，用20％NaOH溶液调PH为8.5，补充注射用水，加入1％的甘露醇，混合均匀后，使用0.45um微孔滤膜精滤，滤液灭菌，灌装于西林瓶中；将西林瓶冷却至0℃，然后放入冻干箱内，使冻干箱温度迅速降至-40℃，使药液冷却，维持5小时，使药液完全冻结；然后将冻干箱内压力降至10Pa，同时维持冻干箱内温度为-40℃，使药液中的水分变为水蒸气；连通冷凝器，使其冷凝管降温至-60℃，使水蒸气在冷凝管上结霜，冻干箱搁板缓慢加热到21℃，保持10小时，即得干燥制品，然后将制品取出封口。
实施例1-2将石斛100g、玄参300g、牛膝700g洗净切片，与金银花1000g一并投入提取罐，加1倍量的0.5％乙醇水溶液浸泡1小时后，40℃下加热回流提取2次，每次提取2小时，滤过，滤液备用；合并滤液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10(50℃)；向浓缩液中加入1/10体积的浓度为0.5％明胶溶液，搅拌，4℃放置12小时，离心，得上清液；向上清液中加入95％乙醇，搅拌，使上清液乙醇含量在85％，4℃静置12小时，滤取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10(80℃)；加入1倍浓缩液体积的乙酸乙酯，萃取3次，每次萃取60分钟，合并上清液，回收乙酸乙酯，并除去乙酸乙酯，浓缩至稠膏(80℃)。
加入3倍量注射用水，搅拌，冷藏12小时，过滤，滤液加入0.3％的泊洛沙姆，搅拌溶解，加入0.8％的氯化钠，搅拌溶解，用30％NaOH溶液调PH为8.5，补充注射用水，加入20％的乳糖，混合均匀，使用0.22um微孔滤膜精滤，滤液灭菌，灌装于西林瓶中；将西林瓶冷却至0℃，然后放入冻干箱内，使冻干箱温度迅速降至-40℃，使药液冷却，维持4.5小时，使药液完全冻结；然后将冻干箱内压力降至7Pa，同时维持冻干箱内温度为-40℃，使药液中的水分变为水蒸气；连通冷凝器，使其冷凝管降温至-65℃，使水蒸气在冷凝管上结霜，冻干箱搁板缓慢加热到30℃，保持3小时，即得干燥制品，然后将制品取出封口。
实施例1-3将石斛1000g、玄参100g、牛膝300g洗净切片，与金银花700g一并投入提取罐，加10倍量的60％乙醇水溶液浸泡1小时后，85℃下加热回流提取3次，每次提取1小时，滤过，滤液备用；合并滤液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.20(50℃)；向浓缩液中加入1/10体积的浓度为2％明胶溶液，搅拌，4℃放置20小时，离心，得上清液；向上清液中加入95％乙醇，搅拌，使上清液乙醇含量在80％，0℃静置20小时，滤取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.20(80℃)；加入1倍浓缩液体积的乙酸乙酯，萃取5次，每次萃取10分钟，合并上清液，回收乙酸乙酯，并除去乙酸乙酯，浓缩至稠膏(80℃)。
加入10倍量注射用水，搅拌，4℃冷藏18小时，过滤，滤液加入0.4％的泊洛沙姆，搅拌溶解，加入0.8％的氯化钠，搅拌溶解，用40％NaOH溶液调PH为8.0，补充注射用水，加入10％明胶，使用0.45um微孔滤膜精滤，滤液灭菌，灌装于西林瓶中；将西林瓶冷却至0℃，然后放入冻干箱内，使冻干箱温度迅速降至-58℃，使药液冷却，维持1.5小时，使药液完全冻结；然后将冻干箱内压力降至2Pa，同时维持冻干箱内温度为-58℃，使药液中的水分变为水蒸气；连通冷凝器，使其冷凝管降温至-65℃，使水蒸气在冷凝管上结霜，冻干箱搁板缓慢加热到25℃，保持7小时，即得干燥制品，然后将制品取出封口。
实施例1-4将石斛300g、玄参700g、牛膝1000g洗净切片，与金银花100g一并投入提取罐，加3倍量的99.5％乙醇水溶液浸泡1小时后，70℃下加热回流提取3次，每次提取1小时，滤过，滤液备用；合并滤液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10(50℃)；向浓缩液中加入1/10体积的浓度为10％明胶溶液，搅拌，8℃放置12小时，离心，得上清液；向上清液中加入95％乙醇，搅拌，使上清液乙醇含量在75％，8℃静置12小时，滤取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10(80℃)；加入1倍浓缩液体积的乙酸乙酯，萃取7次，每次萃取5分钟，合并上清液，回收乙酸乙酯，并除去乙酸乙酯，浓缩至稠膏(80℃)。
加入6倍量注射用水，搅拌，冷藏24小时，过滤，滤液加入0.5％的泊洛沙姆，搅拌溶解，加入0.9％的氯化钠，搅拌溶解，用20％NaOH溶液调PH为8.5，补充注射用水，加入15％的葡萄糖，使用0.22um微孔滤膜精滤，滤液灭菌，灌装于西林瓶中；将西林瓶冷却至0℃，然后放入冻干箱内，使冻干箱温度迅速降至-40℃，使药液冷却，维持3.5小时，使药液完全冻结；然后将冻干箱内压力降至5Pa，同时维持冻干箱内温度为-40℃，使药液中的水分变为水蒸气；连通冷凝器，使其冷凝管降温至-50℃，使水蒸气在冷凝管上结霜，冻干箱搁板缓慢加热到30℃，保持5小时，即得干燥制品，然后将制品取出封口。
实施例2-1将石斛、玄参、牛膝各500g洗净切片，与金银花500g一并投入提取罐，加入12kg30％乙醇间接加热，提取3次，每次1小时，3次提取液过滤后合并，减压浓缩至1/5浓缩前体积，加入浓缩液重量1％的明胶水溶液，搅匀，4℃放置12小时，离心，滤过，滤液减压浓缩1/2体积；上D101大孔树脂柱以去离子水洗脱，至流出液呈无色，然后以85％乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，按常法配制得到注射液。
实施例2-2将石斛100g、玄参300g、牛膝700g洗净切片，与金银花1000g一并投入提取罐，加入18.9kg 50％乙醇间接加热，提取3小时，提取液过滤，滤液减压浓缩至1/4浓缩前体积，加入浓缩液重量5％的明胶水溶液，搅匀，10℃放置24小时，离心，滤过，滤液减压浓缩1/3体积；上D101大孔树脂柱以去离子水洗脱，至流出液呈无色，然后以85％乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，按常法配制得到注射液。
实施例2-3将石斛1000g、玄参100g、牛膝300g洗净切片，与金银花700g一并投入提取罐，加入6.3kg 40％乙醇间接加热，提取2次，第一次提取2小时，第二次提取1小时，提取液合并后过滤，滤液减压浓缩至1/5浓缩前体积，加入浓缩液重量3％的明胶水溶液，搅匀，8℃放置20小时，离心，滤过，滤液减压浓缩1/4体积；上D101大孔树脂柱以去离子水洗脱，至流出液呈无色，然后以85％乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，按常法配制得到注射液。
实施例2-4将石斛700g、玄参1000g、牛膝100g洗净切片，与金银花300g一并投入提取罐，加入10.5kg 40％乙醇间接加热，提取2次，每次提取2小时，提取液合并后过滤，滤液减压浓缩至无醇味，加入浓缩液重量1％的ZTC澄清剂，搅匀，5℃放置24小时，离心，滤过，滤液减压浓缩1/2体积；上D101大孔树脂柱以去离子水洗脱，至流出液呈无色，然后以85％乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，按常法配制得到注射液。
实施例2-5将石斛300g、玄参700g、牛膝1000g洗净切片，与金银花100g一并投入提取罐，加入16.8kg 30％乙醇间接加热，提取3次，第一次提取2小时，第二次提取1小时，第三次提取1小时，三次提取液合并后过滤，滤液减压浓缩至无醇味，加入浓缩液重量1％的ZTC澄清剂，搅匀，10℃放置12小时，离心，滤过，滤液减压浓缩1/3体积；上D101大孔树脂柱以去离子水洗脱，至流出液呈无色，然后以85％乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，按常法配制得到注射液。
实施例2-6将石斛、玄参、牛膝各500g洗净切片，与金银花500g一并投入提取罐，加入12kg 50％乙醇间接加热，提取3次，每次1小时，3次提取液过滤后合并，减压浓缩至无醇味，加入浓缩液重量1％的ZTC澄清剂，搅匀，8℃放置22小时，离心，滤过，滤液减压浓缩1/4体积；上D101大孔树脂柱以去离子水洗脱，至流出液呈无色，然后以85％乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，按常法配制得到注射液。
实施例3-1将石斛、玄参、牛膝各500g洗净切片，与金银花500g投入煎煮锅，加入12kg水，加热至沸腾，煎煮3次，每次1小时，3次煎煮液过滤后合并，减压浓缩至1/2浓缩前体积，加入浓缩液体积5％的明胶水溶液，搅拌均匀，10℃下放置24小时，离心后滤纸过滤，滤液减压浓缩至1/4浓缩前体积，加入95％的乙醇至含醇量为80％，在5℃下放置12小时，滤纸过滤，滤液用浓度为20％的NaOH溶液调PH＝8.0，放置12小时，滤纸过滤，滤液减压浓缩至无醇味；以1倍体积的乙酸乙酯萃取3次，减压回收至无味，按常法配制得到注射液。
实施例3-2将石斛100g、玄参300g、牛膝700g洗净切片，与金银花1000g投入煎煮锅，加入18.9kg水，加热至沸腾，煎煮3小时，煎煮液过滤，滤液减压浓缩至1/3浓缩前体积，加入浓缩液体积1％的明胶水溶液，搅拌均匀，5℃下放置12小时，离心后滤纸过滤，滤液减压浓缩至1/3浓缩前体积，加入95％的乙醇至含醇量为80％，在10℃下放置24小时，滤纸过滤，滤液用浓度为10％的NaOH溶液调PH＝8.5，放置24小时，滤纸过滤，滤液减压浓缩至无醇味；以3倍体积的乙酸乙酯萃取1次，减压回收至无味，按常法配制得到注射液。
实施例3-3将石斛1000g、玄参100g、牛膝300g洗净切片，与金银花700g投入煎煮锅，加入6.3kg水，加热至沸腾，煎煮2次，第一次煎煮2小时，第二次煎煮1小时，煎煮液合并后过滤，滤液减压浓缩至1/2浓缩前体积，加入浓缩液体积5％的明胶水溶液，搅拌均匀，8℃下放置15小时，离心后滤纸过滤，滤液减压浓缩至1/4浓缩前体积，加入95％的乙醇至含醇量为80％，在8℃下放置20小时，滤纸过滤，滤液用浓度为30％的NaOH溶液调PH＝7.5，放置18小时，滤纸过滤，滤液减压浓缩至无醇味；以2倍体积的乙酸乙酯萃取3次，减压回收至无味，按常法配制得到注射液。
实施例3-4将石斛700g、玄参1000g、牛膝100g洗净切片，与金银花300g投入煎煮锅，加入10.5kg水，加热至沸腾，煎煮2次，每次煎煮2小时，煎煮液合并后过滤，滤液减压浓缩至1/3浓缩前体积，加入浓缩液体积1％的明胶水溶液，搅拌均匀，7℃下放置20小时，离心后滤纸过滤，滤液减压浓缩至1/3浓缩前体积，加入95％的乙醇至含醇量为80％，在10℃下放置24小时，滤纸过滤，滤液用浓度为20％的NaOH溶液调PH＝8.5，放置12小时，滤纸过滤，滤液减压浓缩至无醇味；以2倍体积的乙酸乙酯萃取2次，减压回收至无味，按常法配制得到注射液。
实施例3-5将石斛300g、玄参700g、牛膝1000g洗净切片，与金银花100g投入煎煮锅，加入16.8kg水，加热至沸腾，煎煮3次，第一次煎煮2小时，第二次煎煮1小时，第三次煎煮1小时，三次煎煮液合并后过滤，滤液减压浓缩至1/2浓缩前体积，加入浓缩液体积3％的明胶水溶液，搅拌均匀，5℃下放置12小时，离心后滤纸过滤，滤液减压浓缩至1/4浓缩前体积，加入95％的乙醇至含醇量为80％，在5℃下放置12小时，滤纸过滤，滤液用浓度为20％的NaOH溶液调PH＝8.0，放置24小时，滤纸过滤，滤液减压浓缩至无醇味；以3倍体积的乙酸乙酯萃取3次，减压回收至无味，按常法配制得到注射液。
实施例3-6将石斛、玄参、牛膝各500g洗净切片，与金银花500g投入煎煮锅，加入12kg水，加热至沸腾，煎煮3次，每次1小时，3次煎煮液过滤后合并，减压浓缩至1/2浓缩前体积，加入浓缩液体积5％的明胶水溶液，搅拌均匀，10℃下放置24小时，离心后滤纸过滤，滤液减压浓缩至1/4浓缩前体积，加入95％的乙醇至含醇量为80％，在5℃下放置12小时，滤纸过滤，滤液用浓度为20％的NaOH溶液调PH＝8.0，放置12小时，滤纸过滤，滤液减压浓缩至无醇味；以3倍体积的乙酸乙酯萃取2次，减压回收至无味，按常法配制得到注射液。
实施例4-1将石斛、玄参、牛膝各500g洗净切片，与金银花500g投入煎煮锅，加入12kg水，加热至沸腾，煎煮3次，每次1小时，3次煎煮液过滤后合并，减压浓缩至1/2浓缩前体积，在60℃下，加入浓缩液重量1％的ZTC澄清剂，在5℃下放置12小时，离心，过滤，滤液减压浓缩至1/4浓缩前体积，然后加入95％的乙醇至含醇量为80％，10℃放置24小时，过滤，滤液减压浓缩至无醇味；上D101大孔树脂柱以去离子水洗脱，至流出液呈无色，然后以85％乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，按常法配制得到注射液。
实施例4-2将石斛100g、玄参300g、牛膝700g洗净切片，与金银花1000g投入煎煮锅，加入18.9kg水，加热至沸腾，煎煮3小时，煎煮液过滤，滤液减压浓缩至1/3浓缩前体积，在55℃下，加入浓缩液重量5％的ZTC澄清剂，在10℃下放置、24小时，离心，过滤，滤液减压浓缩至1/3浓缩前体积，然后加入95％的乙醇至含醇量为80％，5℃放置12小时，过滤，滤液减压浓缩至无醇味；上D101大孔树脂柱以去离子水洗脱，至流出液呈无色，然后以85％乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，按常法配制得到注射液。
实施例4-3将石斛1000g、玄参100g、牛膝300g洗净切片，与金银花700g投入煎煮锅，加入6.3kg水，加热至沸腾，煎煮2次，第一次煎煮2小时，第二次煎煮1小时，煎煮液合并后过滤，滤液减压浓缩至1/2浓缩前体积，在65℃下，加入浓缩液重量3％的ZTC澄清剂，在8℃下放置20小时，离心，过滤，滤液减压浓缩至1/3浓缩前体积，然后加入95％的乙醇至含醇量为80％，10℃放置18小时，过滤，滤液减压浓缩至无醇味；上D101大孔树脂柱以去离子水洗脱，至流出液呈无色，然后以85％乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，按常法配制得到注射液。
实施例5-1将石斛700g、玄参1000g、牛膝100g洗净切片，与金银花300g投入煎煮锅，加入10.5kg水，加热至沸腾，煎煮2次，每次煎煮2小时，煎煮液合并后过滤，滤液减压浓缩至1/3浓缩前体积，加入浓缩液重量5％的明胶水溶液，搅拌均匀，在5℃下放置15小时，离心，过滤，滤液减压浓缩至1/4浓缩前体积，然后加入95％的乙醇至含醇量为80％，8℃放置24小时，过滤，滤液以20％的NaOH溶液调PH值为8.0后，减压浓缩至无醇味；上D101大孔树脂柱以去离子水洗脱，至流出液呈无色，然后以85％乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，按常法配制得到注射液。
实施例5-2将石斛300g、玄参700g、牛膝1000g洗净切片，与金银花100g投入煎煮锅，加入16.8kg水，加热至沸腾，煎煮3次，第一次煎煮2小时，第二次煎煮1小时，第三次煎煮1小时，三次煎煮液合并后过滤，滤液减压浓缩至1/2浓缩前体积，加入浓缩液重量1％的明胶水溶液，搅拌均匀，在10℃下放置12小时，离心，过滤，滤液减压浓缩至1/3浓缩前体积，然后加入95％的乙醇至含醇量为80％，10℃放置12小时，过滤，滤液以20％的NaOH溶液调PH值为8.5后放置12小时，过滤，滤液减压浓缩至无醇味；上D101大孔树脂柱以去离子水洗脱，至流出液呈无色，然后以85％乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，按常法配制得到注射液。
实施例5-3将石斛、玄参、牛膝各500g洗净切片，与金银花500g投入煎煮锅，加入12kg水，加热至沸腾，煎煮3次，每次1小时，3次煎煮液过滤后合并，减压浓缩至1/2浓缩前体积，加入浓缩液重量3％的明胶水溶液，搅拌均匀，在8℃下放置12小时，离心，过滤，滤液减压浓缩至1/4浓缩前体积，然后加入95％的乙醇至含醇量为80％，10℃放置22小时，过滤，滤液以20％的NaOH溶液调PH值为8.5后，放置12小时，过滤，滤液减压浓缩至无醇味；上D101大孔树脂柱以去离子水洗脱，至流出液呈无色，然后以85％乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，按常法配制得到注射液。
实施例6-1——6-3除煎煮液减压浓缩后，不加入明胶水溶液，直接进行加入95％的乙醇至含醇量为80％的步骤以外，其余步骤同实施例5-1、5-2、5-3。
实施例7-1将石斛、玄参、牛膝各500g洗净切片，与金银花500g投入煎煮锅，加入12kg的30％乙醇，加热至沸腾，煎煮3次，每次1小时，3次煎煮液过滤后合并，减压浓缩至1/2浓缩前体积，加入95％的乙醇至含醇量为80％，在5℃下放置12小时，滤纸过滤，滤液用浓度为20％的NaOH溶液调PH＝8.0，放置12小时，滤纸过滤，滤液减压浓缩至无醇味；上D101大孔树脂柱以去离子水洗脱，至流出液呈无色，然后以85％乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，按常法配制得到注射液。
实施例7-2将石斛100g、玄参300g、牛膝700g洗净切片，与金银花1000g投入煎煮锅，加入18.9kg的40％乙醇，加热至沸腾，煎煮3小时，煎煮液过滤，滤液减压浓缩至1/3浓缩前体积，加入95％的乙醇至含醇量为80％，在10℃下放置24小时，滤纸过滤，滤液用浓度为10％的NaOH溶液调PH＝8.5，放置24小时，滤纸过滤，滤液减压浓缩至无醇味；上D101大孔树脂柱以去离子水洗脱，至流出液呈无色，然后以85％乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，按常法配制得到注射液。
实施例7-3将石斛1000g、玄参100g、牛膝300g洗净切片，与金银花700g投入煎煮锅，加入6.3kg的50％乙醇，加热至沸腾，煎煮2次，第一次煎煮2小时，第二次煎煮1小时，煎煮液合并后过滤，滤液减压浓缩至1/4浓缩前体积，加入95％的乙醇至含醇量为80％，在8℃下放置20小时，滤纸过滤，滤液用浓度为30％的NaOH溶液调PH＝7.5，放置18小时，滤纸过滤，滤液减压浓缩至无醇味；上D101大孔树脂柱以去离子水洗脱，至流出液呈无色，然后以85％乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，按常法配制得到注射液。
实施例7-4将石斛700g、玄参1000g、牛膝100g洗净切片，与金银花300g投入提取罐，加入10.5kg 30％乙醇，间接加热至沸腾，提取2次，每次提取2小时，提取液合并后过滤，滤液减压浓缩至1/3浓缩前体积，加入95％的乙醇至含醇量为80％，在10℃下放置24小时，滤纸过滤，滤液用浓度为20％的NaOH溶液调PH＝8.5，放置12小时，滤纸过滤，滤液减压浓缩至无醇味；上D101大孔树脂柱以去离子水洗脱，至流出液呈无色，然后以85％乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，按常法配制得到注射液。
实施例7-5将石斛300g、玄参700g、牛膝1000g洗净切片，与金银花100g投入提取罐，加入16.8kg 40％乙醇，间接加热至沸腾，提取3次，第一次提取2小时，第二次提取1小时，第三次提取1小时，三次提取液合并后过滤，滤液减压浓缩至1/2浓缩前体积，加入95％的乙醇至含醇量为80％，在5℃下放置12小时，滤纸过滤，滤液用浓度为20％的NaOH溶液调PH＝8.0，放置24小时，滤纸过滤，滤液减压浓缩至无醇味；上D101大孔树脂柱以去离子水洗脱，至流出液呈无色，然后以85％乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，按常法配制得到注射液。
实施例7-6将石斛、玄参、牛膝各500g洗净切片，与金银花500g投入煎煮锅，加入12kg 50％乙醇，间接加热至沸腾，提取3次，每次1小时，3次提取液过滤后合并，减压浓缩至1/2浓缩前体积，加入95％的乙醇至含醇量为80％，在5℃下放置12小时，滤纸过滤，滤液用浓度为20％的NaOH溶液调PH＝8.0，放置12小时，滤纸过滤，滤液减压浓缩至无醇味；上D101大孔树脂柱以去离子水洗脱，至流出液呈无色，然后以85％乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，按常法配制得到注射液。
比较例1本例为脉络宁注射液中石斛的含量测定1.仪器及试剂Waters 2695高效液相色谱仪；Waters 2996二极管阵列检测器；Empower数据处理软件；试剂乙腈(色谱纯)Fisher Scientific公司，批号020109水重蒸馏水；滨蒿内酯对照品中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，批号1511-200001。
2.色谱条件色谱柱Kromasil C18(Φ4.6×200mm，5μm)柱温30℃流动相乙腈-水(1∶4)，流速0.8ml/min进样量10μl波长343nm3.样品制备对照品溶液的制备精密称取滨蒿内酯对照品适量，加甲醇制成每1ml中含5μg的溶液，即得。
供试品溶液取本发明产品，加注射用水，制成50ml脉络宁注射液，加氯化钠5g，用氯仿提取3次，每次30ml，合并氯仿液，置水浴上蒸干，残渣加60％甲醇使溶解，并转移至25ml量瓶中，加60％甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。
缺石斛的阴性对照样品称取玄参、牛膝、金银花各50g，按照实施例1-1的操作，制得缺石斛的脉络宁注射液，按照上述供试品溶液的制备方法制成缺石斛的阴性对照溶液。
4.阴性对照试验在前述色谱条件下，精密吸取上述对照品溶液及缺石斛的阴性对照溶液10μl，注入液相色谱仪，记录HPLC图，结果表明阴性样品在滨蒿内酯峰保留时间处(约21.4分钟)无色谱峰出现，说明阴性样品对样品中滨蒿内酯的测定无干扰。
5.色谱分离效果取供试品溶液10μl在上述色谱条件下进样测定，所得色谱图中，滨蒿内酯峰的理论板数为5922，且与相邻色谱峰分离良好，分离度为3.5。
6.成品含量测定与结果按前述方法对五批成品进行了测定，测定结果见下表
按照中国专利CN92107848.X描述的工艺生产的脉络宁注射液样品的滨蒿内酯测定结果见下表
7.结论五批按新工艺生产的样品滨蒿内酯含量平均值为3.86μg/ml。
按照中国专利CN92107848.X描述的工艺生产的脉络宁注射液样品的滨蒿内酯含量平均值为2.44μg/ml。
因此本发明方法生产的产品与中国专利CN92107848.X描述的工艺相比，所生产产品的滨蒿内酯含量显著提高。
比较例3
本例为本发明方法与中国专利CN92107848.X工艺制得的产品的质量对比。
两工艺产品质量对比表
结论本发明工艺方法能够将中国专利CN92107848.X提取到的成分全部提取出来，所生产的产品的各项指标优于中国专利CN92107848.X生产的样品。
比较例4本例为本发明产品的动物实验数据比较。
试验材料1受试物名称脉络宁提取物注射液规格每瓶100mL(每mL含脉络宁提取物相当原药材量20g)提供单位哈尔滨天工科学院批号0302112试验动物2.1小白鼠昆明种，雄性，体重18-22g，28-32g.
2.2大白鼠SD，雄性，体重300-350g.
2.3家兔新西兰种白兔雄性，体重2.0-3.0kg.以上动物均由沈阳药科大学实验动物中心提供，合格证号SYXK(辽)2003-0083对照药3.1脉络宁注射液金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂，批号20030305.
3.2二磷酸腺苷二钠盐中国医药集团上海化学试剂公司，批号200304073.3凝血酶上海第一生化药业公司上海生物化学制药厂，批号021015.
3.4胶原按文献方法自制.
3.5高分子右旋糖苷(Dextron 400)分子量为40万，沈阳第一制药厂生产.
3.6泊洛沙姆188型号(F68)聚合物，BASF有限公司上海分公司精细化工品部.
4.主要仪器4.1 LG-KOALA血小板聚集测试仪北京世帝科学仪器公司4.2自动平衡微型离心机LDZ4-0.8北京医用离心机厂4.3 N5A-型普利生血液粘度计4.4 S501-A型恒温水浴辽阳博大科学仪器有限公司4.5微量血液离心机SH-120，上海手术器械厂4.6离心沉淀器80-2，上海手术器械厂试验方法与结果1.脉络宁提取物注射液对大鼠血小板聚集性的影响1.1对二磷酸腺苷诱导的大鼠血小板聚集性的影响将受试动物按体重均衡分为6组，分别为溶剂对照组、脉络宁静脉给药3个剂量组，剂量分别为40g/kg、20g/kg、10g/kg，另设脉络宁灌胃给药组，剂量为20g/kg及市售脉络宁静脉给药组，剂量为20g/kg。对照组静脉给予1％泊洛沙姆生理盐水，给药容积为5mL/kg，每天给药1次，连续7天，于末次给药后30min眶静脉取血2mL，用3.8％枸橼酸钠(1∶9)抗凝，常规制备PRP和PPP，加10uL 1.06uM二磷酸腺苷，在LG-KOALA血小板聚集测试仪上测定各组血小板聚集率，并求出聚集抑制率。
聚集抑制率％＝(对照组聚集％-给药组聚集％)/对照组聚集％×100％以聚集率为指标进行组间比较，显著性检验。
试验结果如下表所示，脉络宁注射液10、20、40g/kg对ADP诱导的大鼠血小板聚集有非常显著的抑制作用，且其作用明显强于口服给药组，好于等剂量市售脉络宁组。
脉络宁静脉注射给药对ADP诱导的大鼠血小板聚集性的影响(n＝10，x±s)见下表
与对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01，与口服脉络宁组比较++p＜0.011.2对胶原诱导的大鼠血小板聚集性的影响受试大鼠分组、给药及取血测量方法同“1.1”，聚集剂改为20uL胶原(按徐叔云药理实验方法学第2版方法自制)，聚集时间改为10min，数据统计同“1.1”，试验结果见下表所示，脉络宁注射液10、20、40g/kg对胶原诱导的大鼠血小板聚集有非常显著的抑制作用，且其作用明显强于口服给药组，好于等剂量市售脉络宁组。
脉络宁静脉注射给药对胶原诱导的大鼠血小板聚集性的影响(n＝10，x±s)见下表
与对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01，与口服脉络宁组比较++p＜0.011.3对凝血酶诱导的大鼠血小板聚集性的影响受试大鼠分组、给药及取血测量方法同“1.1”，聚集剂改为10uL 2u/mL的凝血酶，数据统计同“1.1”，试验结果见下表所示，脉络宁注射液10、20、40g/kg对凝血酶诱导的大鼠血小板聚集有非常显著的抑制作用，且其作用明显强于口服给药组。
表3.脉络宁静脉注射给药对凝血酶诱导的大鼠血小板聚集性的影响(n＝10，x±s)
与对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01，与口服脉络宁组比较++p＜0.012.脉络宁提取物注射液对血小板依赖性血栓形成的影响2.1对家兔颈总动脉血栓形成的影响受试动物分6组，分别为对照组、脉络宁静脉给药3个剂量组分别为20g/kg、10g/kg、5g/kg，另设脉络宁灌胃给药组，剂量为10g/kg及市售脉络宁静脉给药组，剂量为10g/kg。对照组静脉给与1％泊洛沙姆生理盐水，给药容积为5mL/kg，每天给药一次，连续7天，于末次给药后用戊巴比妥钠(约30mg/kg)静脉麻醉，背位固定，游离一侧颈总动脉，在相距4cm处将动脉两端用动脉夹夹住，用12号细缝衣针将长约3cm 4号缝合丝线缝入颈总动脉内，打开动脉夹，恢复血流(上述工作于末次给药后0.5h完成)，2h后将颈总动脉剪下，剪开血管，用滤纸吸去余血并抽出丝线，称每组每只兔血栓湿重，并计算血栓形成抑制率(血栓形成抑制率＝(对照组血栓湿重-给药组血栓湿重)/对照组血栓湿重×100％试验结果如下表所示，在此选择剂量范围内，脉络宁注射液对血小板血栓形成有非常显著抑制作用，脉络宁注射液优于等剂量市售对照药和灌胃给药组。脉络宁静脉注射给药对家兔颈总动脉血栓形成的影响(X±SD)见下表
各给药组与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01.
2.2对小鼠肺栓塞的保护作用取小鼠(雄性)120只，按2.1分组，每组20只，给药组剂量分别为15g/kg、30g/kg、60g/kg(iv)另设ig给药组，剂量为30g/kg及市售脉络宁注射液30g/kg组，给药容积为0.2mL/10g，给药速度为0.05mL/s，连续给药7天，于末次给药后0.5小时小鼠尾静脉注入胶原(Sigma公司生产，c-8886，lot108e8015)和肾上腺素强复合诱导剂5.0mL/kg(胶原2.5mg/kg+肾上腺素2mg/kg)，注射速度为0.1mL/5s，观察3min内小鼠死亡情况，以每组死亡动物数及保护率为观察指标，试验结果如下表所示，经x2检验，表明在所选择剂量范围内脉络宁注射液高剂量组对胶原和肾上腺素诱导小鼠肺血栓致死有显著保护作用。受试物效果好于市售脉络宁，好于相同剂量灌胃给药组。脉络宁注射液对胶原+肾上腺素复合物诱发小鼠肺血栓保护作用见下表
2.3对阻断大脑中动脉致局灶性脑缺血的影响将70只雄性大鼠随机分成7组，每组10只，分别为伪手术组、模型对照组、脉络宁注射液3个剂量组剂量分别为10g/kg、20g/kg、40g/kg；脉络宁注射液灌胃给药组剂量为20g/kg，市售脉络宁20g/kg静脉注射给药组，伪手术组和模型对照组静脉注射1％泊洛沙姆生理盐水，每天给药1次，连续给药7天，给药容积为0.5mL/100g，给药速度为2mL/min，临用前配制，各组给药容积相同。于末次给药后30min用10％水合氯醛以350mg/kg腹腔注射麻醉，受试大鼠背位固定，颈前部手术，分离右侧颈总动脉至翼腭动脉并结扎之，将直径为0.24mm进口鱼线于颈总动脉与颈内动脉分支处切口穿入，穿入长度约18mm，然后逐层缝合，术后24小时观察按脑功能障碍指标评分标准(见附表)逐一检查评分，做为脑功能障碍评价指标，试验结果如下表，与模型对照组比较，脉络宁注射液各组对脑功能障碍有显著改善作用。
评分结束后，断头处死大鼠，取大脑用冷生理盐水冲洗，放入-20℃冰箱冷冻5min后取出，去嗅球、小脑及低位脑干，沿冠状面切成5片，将脑片放入5mLTTC中染色(4％TTC1.5mL、1mol/LK2HPO40.1mL和3.4mL蒸馏水)，37℃避光30min，正常脑组织呈红色，梗死区因未着色呈白色，分别称量梗死区及前脑重量，以梗死区占前脑重量的百分比为观察指标进行组间比较，显著性测定结果如下表，在所选择剂量范围内脉络宁注射液显著减少堵塞大脑中动脉所致大鼠脑梗死部位的重量及梗死部位重量占前脑重量的百分比。试验结果表明受试物优于市售脉络宁，优于相同剂量灌胃给药组。
脉络宁注射液对MCAO大鼠神经症状的改善作用(X±SD)见下表
各给药组与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01.
脉络宁注射液对MCAO大鼠脑梗死的保护作用(X±SD)见下表
给药组与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01.
附表脑功能障碍指标
2.4对大鼠下腔静脉血栓形成的影响将60只大鼠按体重均衡分组，每组10只，分组及给药方式、剂量同“2.3”试验，以戊巴比妥钠350mg/kg腹腔注射麻醉后背位固定，做腹正中切口，深入腹腔，分离下腔静脉，于左肾静脉下方用4号丝线结扎下腔静脉后关腹，2小时后重新开腹，在结扎线下2cm处夹闭血管并剖开管腔，取出血栓，沾除附上表面血液称湿重，计算血栓湿重及血栓形成抑制率。试验结果如表8所示，在选择剂量范围内，脉络宁注射液对静脉血栓形成有显著抑制作用，静脉给药组好于灌胃组和市售相同剂量组。
脉络宁注射液对大鼠下腔静脉血栓形成的影响(X±SD)见下表
给药组与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01.
3.脉络宁提取物注射液对小鼠耳廓微循环的影响将60只受试小鼠按体重、性别均衡分为6组分别为溶剂对照组(1％泊洛沙姆生理盐水)、脉络宁提取物注射液低、中、高剂量组(15、30、60g/kg)、脉络宁中剂量口服给药组(30g/kg)、市售脉络宁组(30g/kg)，除第5组外均静脉注射，给药容积为0.2mL/10g，连续给药7天，每天1次。末次给药后用20％乌拉坦0.7mL/100g给小鼠肌注麻醉，用橡皮膏轻轻拉去小鼠耳廓毛，腹位固定在观察台上，耳廓平展，用10×10倍镜观察小鼠微循环，上述操作在30min内完成。记数耳廓毛细血管开放量，用显微测微尺侧耳廓动脉(A)、静脉(V)口径。脉络宁提取物注射液30、60g/kg对小鼠耳廓微循环有非常显著地改善作用，且其作用优于口服给药组和市售脉络宁组。
脉络宁提取物注射液对小鼠耳廓微循环的影响(X±SD)见下表
给药组与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.014.脉络宁提取物注射液对血淤症大鼠血液流变学的影响将70只雄性大鼠按体重均衡分组，每组10只。分别为正常对照组、血淤模型组、脉络宁提取物注射液10、20、40g/kg三个剂量组、脉络宁灌胃给药组，剂量为20g/kg及市售脉络宁注射液20g/kg组。每天给药1次，连续给药7天，正常对照组和模型对照组给相当容积的1％泊洛沙姆生理盐水，给药容积为0.5mL/100g，给药速度为2.0mL/min，第6天给药后禁食不禁水，末次给药后水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，尾静脉快速推注10％高分子右旋糖酐1.0mL/100g。1hr后开胸，心脏取血4mL，肝素0.1mL抗凝。测血液流变学各项指标。结论脉络宁提取物注射液能显著改善血淤症大鼠不同切变率下的全血粘度和全血还原粘度。
脉络宁提取物注射液对血淤症血液流变学的影响(X±SD，n＝10)见下表
给药组与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01脉络宁提取物注射液对血淤症血液流变学的影响(X±SD)见下表
给药组与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01试验结论1、脉络宁提取物注射液(10、20、40g/kg)连续7天静脉注射给药能显著抑制ADP、胶原、凝血酶诱导的大鼠血小板聚集。
2、脉络宁提取物注射液(10、20、40g/kg)连续7天静脉注射给药能显著改善MCAO大鼠的神经症状，对其脑梗死有显著保护作用。
3、脉络宁提取物注射液(10、20、40g/kg)连续7天静脉注射给药能显著抑制大鼠下腔静脉血栓形成。
4、脉络宁提取物注射液(10、20、40g/kg)连续7天静脉注射给药能高分子右旋糖酐致大鼠血淤症的血液流变学各项指标。
5、脉络宁提取物注射液(5、10、20g/kg)连续7天静脉注射给药显著抑制家兔颈总动脉血栓形成。
6、脉络宁提取物注射液(15、30、60g/kg)连续7天静脉注射给药对胶原-肾上腺素诱发的小鼠肺血栓死亡有显著保护作用。
7、脉络宁提取物注射液(15、30、60g/kg)连续7天静脉注射给药显著改善小鼠耳廓微循环。
脉络宁提取物注射液(10、20、40g/kg)连续7天静脉注射给药能显著抑制ADP、胶原、凝血酶诱导的大鼠血小板聚集；显著改善MCAO大鼠的神经症状，对其脑梗死有显著保护作用；显著抑制大鼠下腔静脉血栓形成；显著改善肾上腺素致大鼠肠系膜微循环障碍及高分子右旋糖酐致大鼠血淤症的血液流变学各项指标；5、10、20g/kg连续7天给药显著抑制家兔颈总动脉血栓形成；15、30、60g/kg连续7天给药对胶原-肾上腺素诱发的小鼠肺血栓死亡有显著保护作用，显著改善小鼠耳廓微循环。综上所述，脉络宁提取物注射液在所选剂量范围内，能显著抑制血小板聚集和动、静脉血栓形成，对MCAO大鼠脑梗死有显著保护作用，对微循环障碍有显著改善作用和改善血淤模型大鼠全血粘度等各项指标。
实验例1本实验例说明了本发明脉络宁粉针剂治疗血瘀症临床试验的效果。
一、观察指标1)主要疗效指标(1)脉络瘀血；(2)皮下瘀斑；(3)脉涩、无脉或沉弦、弦迟。
2)次要疗效指标(1)肢体麻木或偏瘫；(2)中医证候3)安全性指标(1)血、尿、便常规、心、肝、肾功能；(2)血压。
二、试验总设计本实验例是考察脉络宁注射液治疗心力衰竭的临床疗效和安全性，按照《技术要求》，将受试例数定为240例，治疗组120例，对照组120例。疗程设定为28天。
三、受试者的选择和退出1、闭塞性脉管炎、静脉血栓形成及动脉硬化闭塞症西医诊断标准(1)肢端发凉，怕冷，麻木，足及小腿胀痛和抽搐；(2)营养障碍，包括皮肤干燥、脱屑、皱裂、汗毛脱落、趾甲增厚、变形、停止生长、肌肉松驰或萎缩；(3)游走性血栓性静脉炎；(4)动脉搏动减弱或消失；(5)皮色改变；(6)坏疽和溃疡。
2、血栓及后遗症西医诊断标准A、下列一项以上神经症状或体征，且至少持续24小时。
(1)意识障碍。
(2)视力、视野障碍。
(3)轻瘫或偏瘫，或两侧瘫痪(尤其于脑干损害时)。
(4)偏侧感觉障碍。
(5)言语障碍。
(6)吞咽困难。
(7)运动失调。
B、脑脊液无色、透明C、可见以下一项以上辅助检查的阳性改变(1)CT扫描可见提示脑水肿、脑缺血病变的低密度区域，而无出血性改变。
(2)脑血管造影发现一支或一支以上主干动脉高度狭窄或闭塞改变。
(3)脑扫描提示脑梗塞而除外脑肿瘤。
D、诊断判断(1)确定诊断完全具备A和B。
(2)高度可能具备A至B、及C中(3)项。
四、脉络血瘀证中医辨证相当于第一、二期合并血栓性浅静脉炎者或第三期轻度坏疽、溃疡继发感染者。表现为刺痛、痛有定处，拒按；脉络瘀血；皮下瘀斑；舌质紫暗，舌体瘀斑、瘀点；涩脉或无脉；肌肤甲错；肢体麻木或偏瘫；善忘。
五、疗效判定与结果1.临床近期痊愈血瘀的临床症状、体征消失或基本消失，为95％。
2.显效血瘀的临床症状、体征明显改善，为70％。
3.有效血瘀的临床症状、体征均有好转，为30％。
4.无效血瘀的临床症状、体征均无明显变化，甚至加重，为30％。注计算公式(尼莫地平法)[(治疗前积分-治疗后积分)/治疗前积分]×100％。
六、结论本发明产品具有清热养阴，活血化瘀的功效。用于血栓闭塞性脉管炎，静脉血栓形成，动脉硬化性闭塞症，脑血栓形成及后遗症等。主要药效学试验表明，本发明产品具有清热养阴，活血化瘀，改善血液循环和血液流变性作用。
实验例2本实验例说明本发明粉针剂长期毒性试验结果1.剂量按照最大剂量100g生药/Kg/天给药。相当于人用药量的30倍。
2.给药时间2个月。
3.动物数根据新药审评要求，犬的实验动物数为4只或6只，选用4只犬。
4.结果表1犬长毒各组给药前后血清尿素氮(BUN)值(mmol/L) √犬的正常值1.78～8.53mmol/L(5～25mg/dl)(药理实验方法学1221页)√人的正常值2.9～6.4mmol/L(中国百科全书简介11页)表2犬长毒各组给药前后血清肌酐(Cr)值(μmol/L) √Cr升高表示Cr清除减少是肾功能损伤指标√犬正常值70～180μmol/L√人正常值53～159μmol/L5.结论从所进行过的4只犬和大鼠长毒实验结果都可以看出所有血液生化指标(给药前后)均在正常范围内，说明动物健康。
实验例3
下表3说明本发明粉针剂及其制备方法与现有市售产品在工艺稳定性及产品质量上的对比效果。
将本发明产品粉针剂和市售品同时按临床用法加入到葡萄糖或氯化钠溶液中进行比较。
表3 以上各项主要技术指标说明本发明的制备方法工艺稳定，产品达到“中药新药制备工艺研究的技术要求”的有关规定，与现有方法制备的产品在质量上无差别。
实验例4本实验例说明本发明粉针剂的稳定性。
根据《药品注册管理办法》及《中药注射剂研究的技术要求》，采取室温留样观察法，在临床用用包装条件下(玻瓶)按质量标准要求进行六个月的初步观察，分别于样品生产后的0，1，2，3，6月各检测一次，共检测了五次，结果表明本发明粉针剂稳定性很好。整个稳定性考察还在继续进行当中。初步稳定性考察结果如下；结果见表4、5、6。
表4室温考察样品实施例1制备日期2003年3月13日 表5室温考察样品实施例2制备日期2003年3月14日 表6室温考察样品实施例3制备日期2003年3月15日
实验例5本例为脉络宁注射液中总黄酮的含量测定(一)方法的确定金银花中含木犀草素等黄酮类成分，玄参也含有少量黄酮类成分。且根据工艺黄酮类成分在制备中能较完全地被提取。据文献报道，木犀草素等黄酮类成分具有使动脉压增加而降低静脉压的作用，可增加冠状动脉血流量，与成品的功能主治相符，是成品中的有效成分，因此以总黄酮为含量测定的指标。
关于总黄酮的含量测定，文献报道有TLCS、紫外分光光度法、比色法等，其中以比色法居多，且多为以芦丁为对照品。原申报资料中已经进行了总黄酮的含量测定方法的研究，现针对按新工艺生产的产品重新进行方法学研究如下1.方法(1)样品制备对照品溶液精密称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品10mg，置100ml量瓶中，加50％甲醇适量，振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含芦丁0.10mg)。
供试品溶液精密量取本品2ml，置25ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
缺金银花的阴性对照溶液称取牛膝、石斛、玄参各100g，照实施例1-1方法，制成缺金银花的脉络宁注射液阴性样品，照前述供试品溶液的制备方法制成缺金银花的阴性对照溶液。
缺金银花、玄参的双阴性对照溶液称取牛膝、石斛各100g，照工艺制成缺金银花、玄参的脉络宁注射液，照前述供试品溶液的制备方法制成缺金银花、玄参的双阴性对照溶液(2)测定标准曲线的制备精密量取上述对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，分别置10ml量瓶中，精密加入5％的亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液0.6ml，摇匀，放置6分钟，加8.6％氢氧化钠溶液3ml，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，以相应的试剂为空白。照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V B)，在510nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
供试品溶液的测定精密量取供试品溶液3ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，作为空白对照；另精密量取供试品溶液3ml，置10ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加50％甲醇至5ml”起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中相当于芦丁的重量，计算，即得。
(二)总黄酮的含量测定方法学考察1.试剂与仪器试剂硝酸铝分析纯，天津市化学试剂三厂，批号20011127；亚硝酸钠分析纯，天津市化学试剂一厂，批号900815氢氧化钠分析纯，北京化工厂，批号931016芦丁对照品中国药品生物制品检定所提供，0080-9705仪器日本岛津UV-2210紫外-可见分光光度仪2.显色条件的选择原来的方法学研究中已对①5％的亚硝酸钠溶液；②10％的硝酸铝溶液；③8.6％的氢氧化钠试液三种试液的用量采用L(9)(34)正交试验法对三种试液的加入量进行了优选，证明分别加入5％的亚硝酸钠溶液0.3ml、10％的硝酸铝溶液0.6ml、8.6％的氢氧化钠试液3ml时显色效果最为理想，故仍采用此条件显色。
3显色稳定性考察取供试品溶液(批号030212)2ml，照前面的显色方法操作，在加入氢氧化钠试液6ml以后立刻在510nm处以时间扫描方式在0～25分钟内测定吸收度。测定结果表明，在显色后15分钟内吸收度最大且较稳定，之后吸收度开始下降。与原申报资料中的研究结果一致。参照《中国药典》2000年版一部排石颗粒质量标准中的含量测定方法及其它有关总黄酮含量测定的参考文献，选择在显色后立即测定吸收度4测定波长的选择精密吸取0.1141mg/ml的芦丁对照品溶液3ml，成品030315批样品溶液，照前述显色方法操作，在400～600nm的波长范围内扫描，测得芦丁对照品溶液在506nm处有最大吸收，峰形较平，为一馒头峰，在±5nm波长范围内吸收度变化小于1.3％；样品溶液显色后最大吸收在515nm，吸收峰同样为一馒头峰，±5nm波长范围内吸收度变化小于1.0％。另据文献报道，总黄酮的比色法含量测定多选择在510nm处测定吸收度，故本品总黄酮的含量测定亦选择510nm为测定波长。
5标准曲线的制备精密称取于120℃干燥至恒重的芦丁对照品11.41mg于100ml量瓶中，加50％的甲醇溶解并稀释至刻度(0.1141mg/ml)。精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于10ml量瓶中，精密加入5％的亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，精密加入10％的硝酸铝溶液0.6ml，摇匀，放置6分钟，加8.6％的氢氧化钠溶液3ml，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，以相应的试剂为空白。照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V B)，在510nm的波长处测定吸收度，以吸收度(A)为纵坐标，浓度(B)为横坐标，绘制标准曲线。结果见下表
由上述测定结果算得标准曲线为A＝12.006B+0.028，r＝0.9999。详见
图1。
6稳定性试验精密吸取样品溶液(批号030314)2ml置25ml量瓶中，加入50％的甲醇至刻度，摇匀。分别在0、4、8、22、25、30小时精密吸取2ml，照前述方法显色，以相应浓度的供试品溶液(2ml→10ml，50％的甲醇溶液稀释至刻度)为空白对照，在510nm波长处测定吸收度，代入标准曲线，计算，测定结果见下表
结论六个时间点的总黄酮含量的平均值为1.541mg/ml，RSD＝0.72％。结果表明，供试品溶液在30小时内总黄酮的含量稳定。
7精密度试验精密吸取样品溶液(批号030313)2ml置25ml量瓶中，加入50％的甲醇至刻度，摇匀。精密吸取3ml共5份，照前述方法显色，在510nm的波长处测定吸收度，代入标准曲线，计算，测定结果见下表
结论6次测定的平均值为1.511mg/ml，RSD＝2.51％。结果表明，本方法精密度良好。
8重复性试验取实施例2-1至2-6产品溶液2ml，共6份，分别置25ml量瓶中，加50％的甲醇至刻度，摇匀。精密量取2ml于10ml量瓶中，加50％的甲醇至5ml，加入5％的亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，精密加入10％的硝酸铝溶液0.6ml，摇匀，放置6分钟，加8.6％的氢氧化钠溶液3ml，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V B)，在510nm的波长处测定吸收度，代入标准曲线，计算，测定结果见下表
结论该批样品的总黄酮含量6次重复测定的平均值为1.522mg/ml，RSD＝1.30％。结果表明，本方法的重复性良好。
9回收率试验芦丁对照品溶液的制备精密称取经120℃干燥至恒重的芦丁对照品17.35mg于25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(0.694mg/ml)。
供试品溶液的制备精密量取样品溶液(批号030312)1.0、1.5、2.0ml各2份，置25ml量瓶中，各精密加入上述芦丁对照品溶液2.0、2.0、3.0、3.0、3.5、3.5ml，各加50％的甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
测定精密量取上述供试品溶液2ml，照前述拟定的方法显色，在510nm的波长处测定吸收度，代入标准曲线，以下式计算回收率，结果列于表20，结果表明本方法回收率好。
表20.总黄酮回收率测定结果
10样品中总黄酮的含量测定测定实施例2-1至2-5中总黄酮的含量，结果列于下表总黄酮含量测定结果
五批样品总黄酮含量平均值为2.81mg/ml。
实验例6本例为脉络宁注射液中金银花的含量测定采用HPLC法，以绿原酸为指标，测定金银花的含量。现对实施例1-1至实施例1-4、实施例2-1五批产品中绿原酸的含量进行了测定。
1、仪器与试剂Waters 2695高效液相色谱仪；Waters 2996二极管阵列检测器；Empower数据处理软件；甲醇(色谱纯)Fisher Scientific公司，批号020215水重蒸馏水；冰醋酸(AR级)，苏州市第二化工研究所，批号000201绿原酸对照品中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，批号0753-200111。
2、色谱条件色谱柱Kromasil C18(Φ4.6×250mm，5μm)柱温25℃流动相甲醇-水-冰醋酸(15∶85∶1)，流速0.8ml/min进样量10μl波长330nm3、样品制备对照品溶液取绿原酸对照品适量，加甲醇制成每1ml中含50μg的溶液。
供试品溶液精密量取样品溶液5ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
缺金银花的阴性对照溶液称取牛膝、石斛、玄参各10g，照工艺制成缺金银花的脉络宁注射液，照前述供试品溶液的制备方法制成缺金银花的阴性对照溶液。
4、阴性对照试验在前述色谱条件下，精密吸取上述对照品溶液和缺金银花的阴性对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录HPLC图，结果表明阴性样品在绿原酸峰保留时间处(约16.6分钟)有一小而宽的色谱峰，但因峰面积太小而难以将其峰面积积分出来。据《中药新药研究指南》，空白试验对样品的干扰允许在5％以下，因此可认为阴性样品对样品中绿原酸的测定基本无干扰，与原研究结果一致。
5、样品测定与结果按前述方法对五批样品进行了测定，测定结果见下表
按照中国专利CN92107848.X制得的样品，绿原酸含量平均值为102.2μg/ml，远远低于本发明方法制得的产品。
实验例7本例为脉络宁注射液中玄参的含量测定1.仪器及试剂Waters 2695高效液相色谱仪；Waters 2996二极管阵列检测器；Empower数据处理软件；试剂甲醇(色谱纯)Fisher Scientific公司，批号020215水重蒸馏水；冰醋酸(AR级)，苏州市第二化工研究所，批号000201肉桂酸对照品中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，批号0786-9802.
2.色谱条件色谱柱Kromasil C18(Φ4.6×250mm，5μm)柱温25℃流动相甲醇-水-冰醋酸(45∶55∶0.2)，流速0.8ml/min进样量10μl波长273nm3.样品制备对照品溶液取肉桂酸对照品适量，加甲醇制成每1ml中含50μg的溶液。
供试品溶液取样品原液直接进样。
缺玄参的阴性对照溶液称取牛膝、石斛、金银花各10g，照工艺制成缺玄参的脉络宁注射液，即得缺玄参的阴性对照溶液。
4.阴性对照试验在前述色谱条件下，精密吸取上述对照品溶液和缺玄参的阴性对照溶液各10μl，注入HPLC仪，记录HPLC图，结果表明阴性样品在肉桂酸峰保留时间处(约18.6分钟)无色谱峰出现，说明阴性样品对样品中肉桂酸的测定无干扰。
5.样品测定与结果
三批按照中国专利CN92107848.X制得的样品测定结果
6.结论阴性样品对肉桂酸的测定无干扰。本品五批新工艺生产的样品肉桂酸含量平均值为44.4μg/ml，高于中国专利CN92107848.X工艺生产产品的肉桂酸含量平均值为39.1μg/ml。
实验例8本例为脉络宁注射液中牛膝的含量测定1.仪器及试剂Waters 2695高效液相色谱仪；Waters 2996二极管阵列检测器；Empower数据处理软件；试剂乙腈(色谱纯)Fisher Scientific公司，批号020109。
水重蒸馏水；蜕皮甾酮对照品由北京大学药学院天然药物学系提供。
2.色谱条件色谱柱Kromasil C18(Φ4.6×250mm，5μm)，柱温30℃，流动相乙腈-水(1∶5.4)，流速1.0ml/min，进样量10μl
波长243nm3.样品制备对照品溶液取蜕皮甾酮对照品适量，加甲醇制成每1ml中含50μg的溶液。
供试品溶液精密量取样品溶液25ml，置分液漏斗中，加氯化钠2.5g，振摇使溶解，用水饱和的正丁醇提取六次，每次25ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水20ml洗涤，洗涤液用水饱和的正丁醇20ml萃取，合并正丁醇液，置水浴上蒸干，残渣加60％甲醇使溶解，转移至25ml量瓶中，加60％的甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。
缺牛膝的阴性对照溶液称取玄参、石斛、金银花各50g，照工艺制成缺牛膝的脉络宁注射液，照供试品溶液的制备方法制得缺牛膝的阴性对照溶液。
4.阴性对照试验在前述色谱条件下，精密吸取上述缺牛膝的阴性对照溶液10μl，注入液相色谱仪，记录HPLC色谱图，结果表明阴性样品在蜕皮甾酮峰保留时间处(约30.3分钟)无色谱峰出现，说明阴性样品对样品中蜕皮甾酮的测定无干扰。
5.样品测定与结果按前述方法对本发明的五批样品进行了测定，测定结果见下表
按照中国专利CN92107848.X制得的样品测定结果见下表
6.结论本发明工艺生产的样品蜕皮甾酮含量平均值为47.7μg/ml，远远高于中国专利CN92107848.X制得样品的蜕皮甾酮含量。
实验例9本实验例为本发明产品急性毒性试验脉络宁提取物注射液静脉注射给小白鼠LD50大于1600g/kg，按体重计算，相当于成人用量的480倍；腹腔注射给小白鼠LD50大于2000g/kg，按体重计算，相当于成人用量的606倍。
试验目的观察受试物在一日内给予小白鼠最大给药量后(静脉注射和腹腔注射)所产生的毒性反应和死亡情况，以考查其临床用药的安全性。
试验材料1.受试物名称脉络宁提取物注射液规格与含量100mL中含提取物17g，相当于原生药2000g。
批号030211提供单位哈尔滨天工科学院2.受试动物名称小白鼠品系昆明种性别雌雄兼用体重18-22g每组动物数20只合格证号SCXK(辽)2003-008提供单位沈阳药科大学实验动物中心试验方法与结果1、静脉注射给药将40只小鼠按体重、性别均衡分成2组，每组20只，雌雄各半，给药组小鼠静脉注射脉络宁提取物注射液，给药容积为0.4ml/10g，注射速度为0.06mL/s，剂量为800g/kg；对照组给等容积的1％泊洛沙姆0.9％氯化钠注射液，8小时后分别再给药1次。给药后观察一周，发现除小鼠活动减少、心跳加快、尿液颜色变深(接近药物颜色)，20分钟后恢复正常外，余未发现受试小鼠有明显中毒反应，20只小鼠全部存活。七天后对照组小鼠体重与给药组小鼠体重无显著性差异，尸检肉眼下未发现受试小鼠主要脏器有明显病变。小鼠体重变化如下表所示。
脉络宁提取物注射液静脉注射给药对小白鼠体重的影响(X±SD)见下表
2、腹腔注射给药小鼠分组同上。给药组小鼠腹腔注射脉络宁提取物注射液，给药容积为0.5ml/10g，剂量为1000g/kg；对照组给等容积的0.9％氯化钠注射液，8小时后分别再给药1次。给药后观察一周，中毒反应同上。20只小鼠全部存活，七天后对照组小鼠体重与给药组小鼠体重无显著性差异，尸检肉眼下未发现受试小鼠主要脏器有明显病变。小鼠体重变化如下表所示。
脉络宁提取物注射液腹腔注射给药对小白鼠体重的影响(X±SD)见下表
结论脉络宁提取物注射液静脉注射给小白鼠LD50大于1600g/kg，按体重计算相当于成人用量480倍；腹腔注射给小白鼠LD50大于2000g/kg，按体重计算，相当于成人用量的606倍。
权利要求
1.脉络宁注射剂，其特征在于，所述的脉络宁注射剂滨蒿内酯含量为2.0-5.5μg/mL、总黄酮含量以芦丁计2.0-3.5mg/mL。
2.根据权利要求1所述的脉络宁注射剂，其特征在于，所述的脉络宁注射剂中肉桂酸含量为40-51μg/mL，绿原酸含量为140-205μg/mL。
3.根据权利要求2所述的脉络宁注射剂，其特征在于，所述的脉络宁注射剂中甾酮含量为45-50μg/mL。
4.根据权利要求3所述的脉络宁注射剂，其特征在于，所述的脉络宁注射剂中，重金属含量≤10ppm，砷盐≤1ppm，炽灼残渣≤0.8％(g/mL)，总固体≥16.3mg/mL。
5.根据权利要求4所述的脉络宁注射剂，其特征在于，所述的脉络宁注射剂的蛋白质、鞣质、树脂、草酸盐、钾离子符合中国药典2000版一部注射剂项下的有关规定。
6.一种脉络宁注射剂的制备方法，其特征在于，药物有效成分的提取通过如下步骤实现1)将如下重量份的原料组分牛膝 100-1000玄参 100-1000石斛 100-1000金银花100-1000冲洗干净，切成片或段或粉，与金银花一并投入提取罐内，加1-10倍量的0％-99.5％乙醇水溶液浸泡1小时后，40-85℃下加热回流提取1-5次，每次提取1-2小时，滤过，滤液备用；合并滤液，浓缩至相对密度为1.10-1.20(80℃)；2)加入95％乙醇，搅拌，使上清液乙醇含量在75-85％，0-10℃静置12-24小时，滤取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10-1.20(80℃)；3)加入1-3倍浓缩液体积的乙酸乙酯，萃取3-7次，每次萃取5-15分钟，合并上清液，回收乙酸乙酯，并除去乙酸乙酯，浓缩至稠膏(80℃)，为药物有效成分。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤3)为使用大孔树脂进行纯化。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤1)和2)之间增加一步骤为向浓缩液中加入1/10体积的浓度为0.5％-10％明胶水溶液，搅拌，0-10℃放置12-24小时，离心，得上清液。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的有效成分的提取过程为1)将上述组分中的牛膝、玄参、石斛冲洗干净，切成片或段或粉，与金银花一并投入提取罐内，加1-10倍量的0％-99.5％乙醇水溶液浸泡1小时后，40-85℃下加热回流提取1-5次，每次提取1-2小时，滤过，滤液备用；合并滤液，浓缩至相对密度为1.10-1.20(80℃)；2)向浓缩液中加入1/10体积的浓度为0.5％-10％明胶水溶液，搅拌，0-10℃放置12-24小时，离心，得上清液；3)将上清液通过大孔树脂进行纯化，得到药物有效成分，配以辅料制备粉针剂或注射液。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的有效成分的提取过程为1)将上述组分中的牛膝、玄参、石斛冲洗干净，切成片或段或粉，与金银花一并投入提取罐内，加1-10倍量的水浸泡1小时后，40-85℃下加热回流提取1-5次，每次提取1-2小时，滤过，滤液备用；合并滤液，浓缩至相对密度为1.10-1.20(80℃)；2)向浓缩液中加入ZTC预处理剂A组分，煮沸15-20分钟后，静置4-5小时，离心分离得上层清液；再加入ZTC预处理剂A组分，煮沸15-20分钟后，静置3小时，过滤，滤液中加入ZTC澄清剂B组分，加热至沸，放置4-6小时，离心后过滤，滤液经多层滤纸板框压滤后，浓缩至比重1.10-1.20(80℃)；3)加入95％乙醇，搅拌，使上清液乙醇含量在75-85％，0-10℃静置12-24小时，滤取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10-1.20(80℃)；4)通过大孔树脂进行纯化，得到药物有效成分，配以辅料制备粉针剂或注射液。
全文摘要
本发明涉及一种中药注射液“脉络宁”注射剂及其制备方法，属于中药制剂领域。本发明所述的脉络宁注射剂，由牛膝、玄参、石斛与金银花经一级醇提取、明胶沉淀、二级醇沉得到药物有效成分，再经乙酸乙酯萃取分离，通过冷冻干燥制得；其中，一级醇提取使用的溶液为0.5％－99.5％乙醇水溶液，明胶沉淀使用0.5％－10％明胶水溶液，二级醇沉时应使上清液含醇量为75－85％；本发明产品在纯度上有了很大的提高，有效的去除了鞣质、多糖、蛋白质、粘液质等杂质；粉针剂较之传统的液态针剂，有效的延长了药物的有效期，使其具有很好的稳定性，方法工艺简单，鞣质等杂质去除彻底，得到的产品产率和纯度较高。
文档编号A61P7/00GK1660314SQ200410102948
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月30日 优先权日2003年12月30日
发明者崔国强 申请人:崔国强