专利名称：发生血栓性疾病的素质的诊断方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及发生血栓性疾病素质的诊断方法，涉及测试系统和它们用于发生血栓性疾病素质的诊断的用途，涉及P2X1启动子变体和它用于筛选抗血栓形成剂的用途，并且涉及用于鉴定可以用抗血栓形成剂预防性或治疗性治疗的个体的方法、或涉及用于使抗血栓形成剂的治疗或预防剂量适合的方法。
血栓性疾病，如周围血管疾病(PVD)、中风、和心肌梗塞可以由动脉斑块或血小板聚集引起。个体发生血栓性疾病的危险看来至少部分是受遗传素质影响。然而，潜在的遗传因素并未被完全地了解(ArteriosclerThromb Vase Biol 241-14，2004)。
目前，只有少量的诊断测试可用于确定血栓性疾病的个体素质。(Saffroy R，Lemoine A，Haas p，Tindiliere F，Marion S，Debuire B.Rapidautomated simultaneous screening of(G1691A)Factor V，(G20210A)prothrombin，and(C677T)methylenetetrahydrofolate reduetase variantsby multiplex PCR using fluorescence scanning technology.Genet Test.2002 Fall；6(3)233-6)。
然而，已知的测试都有问题，即个体的血栓性疾病的危险性不能被可靠地测定。因此，需要新的测试系统，其可用于可靠地测定个体的血栓性疾病素质，尤其是患PVD、中风、或心肌梗塞的危险。
本发明的一个目的是提供诊断个体发生血栓性疾病素质的更可靠的方法。特别地，希望提供用于方便地操作合适诊断方法的测试系统，提供用于筛选新的抗血栓形成剂的方法和测试系统，提供鉴定对具有发生血栓性疾病素质的个体进行预防性或诊断性治疗的抗血栓形成剂的方法，以及提供使抗血栓形成剂的治疗或预防剂量适合的方法。
根据本发明的第一个方面，所述目的通过提供发生血栓性疾病素质的诊断方法得以解决，其中所述方法包括(a)确定P2X1启动子的至少一个等位基因至少在一个SEQ ID NO1的位置304、764、838、或1002之一处的序列，和/或(b)在从个体得到的组织样本中确定P2X1蛋白质的量。
在本发明中，已经惊奇地发现，人的P2X1启动子是以在上述鉴定的位置处包含序列变异的P2X1启动子变体的形式出现的，这与它们的携带者发生多种形式的血栓性疾病的素质紧密相关。本发明基于对1400个病人进行的研究，由于病人的数量多，它是非常有意义的。因此，本发明第一次提供了诊断发生血栓性疾病素质的可靠方法。本发明诊断方法的优选实施方案涉及与特定P2X1启动子变体的存在相关的特定形式血栓性疾病的诊断。
如本发明所要求的，P2X1启动子的单独核苷酸的变异在特定的种群中高频率发生，特别地频率＞1％，由此可以根据通常称作的单核苷酸多态性(SNPs)对其分类。由此，它们非常适合作为发生血栓性疾病的个体素质的诊断标志。
在P2X1启动子中的单核苷酸多态性(SNPs)对单独的个体中产生的P2X1蛋白质的量具有影响。由此，根据本发明，在组织样本中P2X1蛋白质的改变量是发生血栓性疾病素质的可靠的标志。
P2X1受体是P2X受体家族的称为ATP-门控离子通道的成员。在多种的人组织和细胞中被发现，例如在神经元中、在平滑肌细胞中、和血小板中(Gene 2001，Vol 269167-175；Thromb Haemost 1998，Vol 103858-866)。P2X1受体的氨基酸序列可自NCBI蛋白质数据库中以登录号S71927获得。
在血小板中，P2X1参与钙离子的动员和血小板凝聚的起始(J BiolChem 1998，Vol 2732024-2029)。偶发地，P2X1受体的基因中的突变在它们的携带者中导致异常强烈的出血，这已经被描述过(J Biol Chem 2002，Vol 27522611-22614)。在平滑肌细胞中，P2X1受体负责血管收缩。在内皮细胞中，ATP对于P2X1的激活导致前列环素和一氧化氮(NO)的释放，它们对平滑肌细胞起到血管舒张和抗增殖的作用(TIPS 1998，Vol1999-107)。
近期，已经描述了P2X1基因启动子及其缺失突变体的序列(Gene 2001，Vol 269167-175；登录号AF177472，NCBI核苷酸数据库)。显示启动子的某些区域对P2X1mRNA的转录起到关键作用。另外，已知P2X1蛋白质参与血栓形成过程。
在本发明中，谈及在P2X1启动子的核苷酸序列中的位置是指在SEQID NO1中的位置，其中所述SEQ ID NO1对应于可在NCBI的核苷酸数据库中以登录号AF177472获得的序列。优选地，P2X1蛋白质包含根据SEQID NO2的氨基酸序列，SEQ ID NO2可自NCBI蛋白质数据库中以登录号S71927获得。
在本发明中，观察到了在P2X1启动子中以前未知的单独核苷酸的变异，这与个体发生血栓性疾病的素质有关。这些变异包含在SEQ ID NO1的位置304从C到T的变异、在位置764从G到C的变异、在位置838从T到G的变异、或在位置1002从T到C的变异。单独核苷酸的描述顺序，例如，“在位置304从C到T”指的是从在特定位置处自以较多频率存在的碱基到同样位置处以较少频率观察到的碱基的改变。
根据本发明，个体可包含P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置304、764、838或1002处的1、2、3或4个变异，可不包含在SEQ ID NO1的位置304、764、838或1002的变异，或可包含P2X1启动子的任一个或全部两个等位基因在SEQ ID NO1的位置304处为碱基C或T、位置764处为碱基G或C、位置838处为碱基T或G、或位置1002处为碱基T或C的任意组合。
在本发明中，发生血栓性疾病的素质的诊断包括个体发生血栓性疾病危险性的确定，和/或急性或慢性血栓性疾病的诊断。血栓性疾病包括任何形式的血栓形成，特别是在动脉或静脉中活体血液栓塞形成的任何形式以及人或动物机体任何部位(特别是任何器官或肢体)的任何相关的临床症状。血液栓塞特别包括血小板和/或来自动脉斑块的斑块物质的聚集。血栓性疾病优选地包括周围血管疾病(PVD)、心肌梗塞、优地的为早期心肌梗塞、和中风，尤其包括短暂性局部缺血发作(TIA)和/或长时的可逆性缺血性神经功能缺失(PRIND)。PVD特别包括普通循环问题，在此问题中运送血液到腿或臂的动脉变得狭窄或阻塞，并且其有时被叫做外周动脉疾病，或PAD。很多人也将这种病症称为“动脉硬化”。早期的心肌梗塞优选地指的是发生在老年之前的任何年龄的人或动物中的心肌梗塞的任何形式。
本发明的诊断方法优选地是指体外的诊断方法，其中使用了组织样本，它是在实施本发明的诊断方法前从个体的机体中移出的。本发明另外的优选实施方案是指体内的诊断方法，优选地其中位于个体机体中的组织样本用于原位诊断方法。
在本发明中，组织样本优选地包含细胞，如血液细胞，特别是血小板、红细胞和/或白细胞，平滑肌细胞、纹状肌细胞、任何上皮的上皮细胞、任何结缔组织的结缔组织细胞、神经元、皮肤的组织样本、黏膜组织样本、任何器官的组织样本、以及任何体液，特别是全血、或任何血液部分、液体、淋巴液、尿液、唾液和精液。
在本发明中，个体包含任何脊椎动物，优选地为任何哺乳动物，优选地为任何年龄或性别的人，特别是新生儿、儿童、年轻人、成人、或老年人，或者动物，任何人或动物的生殖细胞，人或动物的卵母细胞或精母细胞；人或动物的受精卵，出生前的任何人或动物，特别是任何人或动物的胚胎或胎儿。
在发生血栓性疾病素质的诊断方法的一个优选实施方案中，来自个体组织样本中存在包含在SEQ ID NO1位置304处从C到T变异的P2X1启动子的至少一个等位基因表明了周围血管疾病(PVD)的增加的危险性。优选地，P2X1启动子的全部两个等位基因在位置304处从C到T的变异的存在表明了更进一步增加的PVD危险性。
在另一优选的实施方案中，组织样本中存在包含在SEQ ID NO1位置764处从G到C变异的P2X1启动子的至少一个等位基因表明了PVD增加的危险性。优选地，P2X1启动子的全部两个等位基因在位置764处从G到C的变异的存在表明了更进一步增加的PVD危险性。
在其它优选的实施方案中，P2X1启动子的全部两个等位基因上的位于SEQ ID NO1的位置304处从C到T变异的存在，或在P2X1启动子的全部两个等位基因上的位于SEQ ID NO1的位置764处从G到C的变异的存在表明了减少的中风危险性，特别是减少的短暂性局部缺血发作(TIA)或长时的可逆性缺血性神经功能缺失(PRIND)的危险性。
在另外的优选实施方案中，在P2X1启动子的至少一个等位基因上在SEQ ID NO1的位置304处C替代T的存在，或在P2X1启动子的至少一个等位基因上在SEQ ID NO1的位置764处G替代C的存在表明了中风增加的危险性。
在另一优选的实施方案中，在组织样本中，包含在SEQ ID NO1的位置838处从T到G变异的P2X1启动子的至少一个等位基因的存在表明了早期心肌梗塞(early myocardial infarction)减少的危险性。进一步地，在组织样本中在SEQ ID NO1的位置838为T的P2X1启动子的至少一个等位基因的存在表明了过早心肌梗塞(premature myocardial infarction)的增加的危险性。优选地，P2X1启动子的全部两个等位基因在位置838从T到G的变异的存在表明了早期心肌梗塞的更进一步的减少的危险性。
在本发明中，早期的心肌梗塞的危险性优选地为患有心肌梗塞的具有小于55岁的年龄的女性或具有小于60岁年龄的男性的危险性。
在另外的优选的实施方案中，在组织样本中，包含在SEQ ID NO1的位置1002的从T到C变异的P2X1启动子的至少一个等位基因的存在表明了PVD增加的危险性。优选地，在P2X1启动子的全部两个等位基因上的在位置1002的从T到C变异的存在表明了PVD更进一步的增加的危险性。
在另外的优选的实施方案中，P2X1启动子的序列在多于一个的SEQ IDNO1的位置被测定，优选地，在两个、在三个、或所有的SEQ ID NO1的位置304、764、838、1002测序。优选地，P2X1启动子的所有两个等位基因的序列在一个、两个、三个或所有的SEQ ID NO1的位置304、764、838、或1002处被测定。
优选地，包含SEQ ID NO1的至少一个位置304、764、838、1002的P2X1启动子或其片段的序列应用核酸序列分析的任何方法测定，特别是应用基于根据Sanger(Current Protocols in Molecular Biology，edited byFred M.Ausubel，Roger Brent，Robert E.Kingston，David D.Moore，J.G.Seidman，John A.Smith，Kevin Struhl；Looseleaf0-471-650338-X；CD-ROM0-471-30661-4)的DNA测序方法的任何DNA测序方法，特别地应用放射性标记的核苷酸或应用用荧光染料标记的核苷酸，特别地包括聚合酶链反应(PCR)，或应用化学测序方法(Pyrosequencingan accuratedetection platform for single nucleotide polymorphisms，Hum Mutat.2002May；19(5)479-85)，尤其是应用焦磷酸测序法(Pyrosequencing for SNPgenotyping，Methods Mol Biol.2003；212189-95；Comparison ofGenFlex Tag array and Pyrosequencing in SNP genotyping，J Mol Diagn.2003 Nov；5(4)243-9；Microarrays and genetic epidemiologyamultipurpose tool for a multifaceted field.Genet Epidemiol.2002 Jun；23(1)4-20，review)，或应用质谱用于核酸序列分析(A novel MALDI-TOFbased methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms，Nucleic Acids Res.2003 Dec 15；31(24)e155；Digital genotyping usingmolecular affinity and mass spectrometry，Nat Rev Genet.2003 Dec；4(12)1001-8)。
另外，包含SEQ ID NO1的至少一个位置304、764、838、或1002的P2X1启动子或其片段的序列可以用允许检测单核苷酸变异的任何序列特异性的核酸检测方法测定，特别是涉及互补碱基配对的任何方法。例如，本发明的P2X1启动子变体可以在聚合酶链反应(PCR)中被检测，此反应应用的寡核苷酸引物只允许在SEQ ID NO1的位置304上C或T存在时、位置764上G或C存在时、位置838上T或G存在时、和/或位置1002上T或C存在时，用于扩增P2X1启动子片段。实施PCR的方法在本领域中已知(Current Protocols in Molecular Biology；由Fred M.Ausubel等人编辑，见上文)。另外，称作的TaqMan分析可以用于本发明的P2X1启动子变体的检测(PNAS USA，887276-7280；Nucl Acid Res，213761-3766)。另外，允许检测在SEQ ID NO1的位置304上C或T存在时、位置764上G或C存在时、位置838上T或G存在时、位置1002上T或C存在时P2X1启动子检测片段的DNA-微列阵可以被应用，这是技术人员容易提供的(Microarrays and genetic epidemiologya multipurposetool for a multifaceted field，Genet Epidemiol.2002 Jun；23(1)4-20；High-density genechip oligonucleotide probe arrays，Adv Biochem EngBiotechnol.2002；7721-42)。另外，还可以应用Sounthern杂交测定法，其应用允许本发明的P2X1启动子变体的单核苷酸多态性检测的核酸探针。
优选地，用DNA测序方法或涉及聚合酶链反应(优选地为TaqManPCR分析)的方法检测P2X1启动子的序列，所述方法应用至少一个包含SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的寡核苷酸以测定P2X1启动子在SEQ IDNO1的位置304的序列，应用至少一个包含SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的寡核苷酸以测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置764的序列，应用至少一个包含SEQ ID NO7或SEQ ID NO8的寡核苷酸以测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置838的序列，和/或应用至少一个包含SEQ IDNO9或SEQ ID NO10的寡核苷酸以测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置1002的序列。
SEQ ID NO3对应于NCBI序列AC005940.3的位置62490-62507。
SEQ ID NO4为SEQ ID NO1的位置472-289的反义链。
SEQ ID NO5对应于在SEQ ID NO1中的位置618-635。
SEQ ID NO6是SEQ ID NO1的位置775-784的反义链。
SEQ ID NO7对应于在SEQ ID NO1中的位置818-837。
SEQ ID NO8为SEQ ID NO1的位置1003-1022的反义链。
SEQ ID NO9对应于在SEQ ID NO1中的位置818-837。
SEQ ID NO10为在SEQ ID NO1中的位置1003-1022的反义链。
在发生血栓性疾病素质诊断的本发明方法的另外的优选实施方案中，在组织样本中P2X1蛋白质的改变的量用来指示发生血栓性疾病的素质。
在本发明中，在组织样本中测定P2X1蛋白质的量优选地包括测定在组织样本中它的量或它的存在。优选地，在组织样本中测定P2X1蛋白质的量包括检测单个蛋白质的任何方法，例如应用抗P2X1抗血清或抗P2X1抗体的Western分析或ELISA测定，特别是应用单克隆抗P2X1抗体或抗P2X1抗体片段，特别地在组织样本中的P2X1蛋白质应用单链抗体或酶促或重组产生的抗体片段(Current Protocols in Immunology；编辑John E.Coligan，Ada M.Kruisbeek，David H.Margulies，Ethan M.Shevach，Waren Strober；Looseleaf0-471-52276-7；CD-ROM0371-30660-6)。本发明包括任何抗-P2X1抗血清或抗-P2X1抗体的用途，特别是任何单克隆抗-P2X1抗体或抗-P2X1抗体片段，特别是在本发明的方法和测试系统中的单链抗体或酶促或重组产生的抗体片段。
在优选的实施方案中，P2X1mRNA的量指示了P2X1蛋白质的量。优选地，P2X1蛋白质的量通过测量P2X1mRNA的量来确定。优选地，P2X1mRNA的存在指示了P2X1蛋白质的存在。优选地，在本文中用到的P2X1mRNA意思上包含至少部分的P2X1启动子的互补序列和/或包含P2X1基因的编码区的至少一部分。优选地，测定前体mRNA或成熟mRNA或其片段的量。优选地，应用Northern分析(Current Protocols in MolecularBiology；由Fred M.Ausubel等人编辑，见上文)，应用包括逆转录RNA分子的起始步骤的PCR分析，应用差异显示分析(Comparativegene-expression analysis；Trends Biotechnol.1999 Feb；17(2)73-8)，或者应用代表性差异分析(representational difference analysis)(Comparative gene-expression analysis；Trends Biotechnol.1999，见上文)测定mRNA的量或存在。
在另外优选的实施方案中，在组织样本中的P2X1蛋白质的活性指示了它的量。优选地，P2X1蛋白质的活性用P2X1活性测定法(Journal Biol.Chemistry，published Dec 29，2003 ahead of publishing as Manuscript NoM308964200)来测定。优选地，在人或动物细胞中测定P2X1蛋白质的活性。
根据本发明另外的方面，本发明的P2X1启动子上的变异为发生血栓性疾病素质的便利测定提供了测试系统。由此，本发明的另外方面涉及包含至少一个核酸探针或寡核苷酸的测试系统，它在获自个体的组织样本中，用来测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置304的序列，优选地用来检测在SEQ ID NO1的位置304的C或T；用来测定P2X1启动子在SEQ IDNO1的位置764的序列，优选地用来检测在SEQ ID NO1的位置764的G或C；用来测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置838的序列，优选地用来检测在SEQ ID NO1的位置838的T或G；用来测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置1002的序列，优选地用来检测在SEQ ID NO1的位置1002的T或C。
优选地，寡核苷酸为至少一个PCR引物，优选地提供了一系列PCR引物，只有在C或T在SEQ ID NO1的位置304存在时，G或C在SEQID NO1的位置764存在时，T或G在SEQ ID NO1的位置838存在时，和/或T或C在SEQ ID NO1的位置1002存在时，所述引物允许扩增P2X1启动子片段。技术人员可以容易地提供这种寡核苷酸或这一系列PCR引物(Current Protocols in Molecular Biology；由Fred M.Ausubel等人编辑，见上文)。
在优选的实施方案中，测试系统包含至少一个含有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的寡核苷酸用来测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置304的序列，至少一个含有SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的寡核苷酸用来测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置764的序列，至少一个含有SEQ IDNO7或SEQ ID NO8的寡核苷酸用来测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置838的序列，和/或至少一个含有SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的寡核苷酸用来测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置1002的序列。
在另外的优选的实施方案中，测试系统包含DNA-微列阵，只有如果C存在于SEQ ID NO1的位置304时，只有如果T存在于SEQ ID NO1的位置304时，只有如果G存在于SEQ ID NO1的位置764时，只有如果C存在于SEQ ID NO1的位置764时，只有如果T存在于SEQ ID NO1的位置838时，只有如果G存在于SEQ ID NO1的位置838时，只有如果T存在于SEQ ID NO1的位置1002时和/或只有如果C存在于SEQ IDNO1的位置1002时，它优选地允许P2X1启动子片段的检测，这是技术人员容易提供的(Microarrays and genetic epidemiologya multipurpose toolfor a multifaceted field，Genet Epidemiol.2002 Jun；23(1)4-20；High-density genechip oligonucleotide probe arrays，Adv Biochem EngBiotechnol.2002；7721-24)。
在另外的优选的实施方案中，测试系统包含用于DNA杂交测定的标记的核酸探针，只有如果C存在于SEQ ID NO1的位置304时，只有如果T存在于SEQ ID NO1的位置304时，只有如果G存在于SEQ ID NO1的位置764时，只有如果C存在于SEQ ID NO1的位置764时，只有如果T存在于SEQ ID NO1的位置838时，只有如果G存在于SEQ ID NO1的位置838时，只有如果T存在于SEQ ID NO1的位置1002时和/或只有如果C存在于SEQ ID NO1的位置1002时，它允许P2X1启动子片段的检测。技术人员能够进行这些实验(Current Protocols in Molecular Biology；由Fred M.Ausubel等人编辑，见上文)。
优选地，核酸探针为放射性标记的、荧光标记的、或为免疫可检测的，特别地为洋地黄毒苷标记的(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim)。
本发明的另外的方面涉及包含至少一个核酸探针或寡核苷酸的上述测试系统的用途，用于发生血栓性疾病的素质的诊断。关于测试系统的用途，也应用在上文对发生血栓性疾病素质诊断的本发明方法进行描述的实施方案中。
本发明的另外的方面涉及的测试系统包含至少一种抗P2X1抗血清、抗P2X1抗体、或抗P2X1抗体片段，以用于测定获自个体的组织样本中的P2X1蛋白质的存在、优选地测定P2X1蛋白质的量。
优选地，测试系统包含至少一种单克隆抗P2X1抗体或抗P2X1抗体片段，特别是单链抗体或抗体片段，优选地为酶促或重组产生的单链抗体或抗体片段(参考)。优选地，本发明的测试系统包含任何的抗P2X1抗血清或抗P2X1抗体，特别是任何的单克隆抗P2X1抗体或任何抗P2X1抗体片段，优选地为任何酶促或重组产生的单链抗体或抗体片段。
在本发明中，P2X1蛋白质优选地包含根据SEQ ID NO2的氨基酸序列，此序列可自NCBI蛋白质数据库以登录号S71927获得。
优选地，在组织样本中P2X1蛋白质的量测定用检测单个蛋白质的存在或测量单个蛋白质的量的任何方法测定，例如用蛋白质分析或ELISA测定。
本发明另外的方面涉及测试系统的用途，此系统包含至少一个抗P2X1抗血清、抗P2X1抗体、或抗P2X1片段，用于发生血栓性疾病素质的诊断。
本发明的另外方面涉及在本发明的P2X1启动子变体的帮助下，对血栓性疾病的新的预防性和治疗性化合物的检测。
本发明另外的方面涉及包含DNA片段的P2X1启动子变体，所述DNA片段包含SEQ ID NO1的至少一个位置304、764、838、和/或1002。优选地，P2X1启动子变体包含在SEQ ID NO1的位置304为T或C、在SEQID NO1的位置764为C或G、在SEQ ID NO1的位置838为T、和/或在SEQ ID NO1的位置1002为C。优选地，P2X1启动子变体包含已经证明有助于P2X1mRNA转录的P2X1启动子的区域(Gene 2001，Vol269167-175)。
本发明另外的方面涉及包含本发明的P2X1启动子变体的测试系统，其中启动子变体指导可检测产物的合成。
本发明另外的方面涉及测试系统的用途，测试系统包含本发明的P2X1启动子变体，用于筛选抗血栓形成剂。优选地，通过抗血栓形成剂抵消与野生型P2X1启动子相比给定的P2X1启动子变体作用的能力来鉴定抗血栓形成剂。
根据本发明的涉及血栓性疾病的新的预防性和治疗性化合物检测的另外方面，其中本发明的P2X1启动子变体被有利地应用，提供了筛选抗血栓形成剂的方法。
本发明另外的方面涉及筛选抗血栓形成剂的方法，其中方法包括的步骤有(a)提供本发明的P2X1启动子变体，优选地提供包含在SEQ ID NO1的位置304为T或C、在SEQ ID NO1的位置764为C或G、在SEQ IDNO1的位置838为T、或在SEQ ID NO1的位置1002为C的P2X1启动子变体，(b)使P2X1启动子变体与测试的化合物接触，以及(c)确定P2X1启动子变体的活性。
优选地，抗血栓形成剂是血栓性疾病预防或治疗的活性剂，血栓性疾病优选地为PVD、中风，优选地为TIA、PRIND，和/或心肌梗塞，优选地为早期心肌梗塞。
在另外优选的实施方案中，使筛选方法适合测试化合物的高通量筛选。
优选地，方法包括在测试化合物存在时测定P2X1启动子变体的活性，以及对比它与测试化合物不存在时P2X1启动子变体的活性。优选地，如本文所述，方法包括使用本发明的测试系统来筛选抗血栓形成剂。
测试化合物优选地为小分子，它是增强或抑制细胞转录装置的成分活性的效应分子的候选物，并且特别地是与基础转录装置的成分相互作用(尤其是与参与DNA结合和起始转录的机制中的普遍性转录因子或基础转录因子相互作用)的小分子效应子的候选物。优选地，测试化合物为任何化学化合物，如天然存在的化合物或与天然存在化合物一样或相似的化学合成的化合物，或非天然存在的任何化学合成的化合物。
天然存在的化合物优选地为可以在多细胞或单细胞生物体中检测的或从其中分离的化合物，特别是在动物、植物、真菌、酵母、细菌、或任何其他含有细胞的生物体中，或在病毒中。非天然存在的化学合成的化合物优选地通过组合化学合成。优选地，它包含来自天然存在化合物的主导结构(lead structure)，优选地来自可以结合到细胞的基础转录装置的转录因子或成分的效应分子的候选物。
优选地，测试化合物为生物化学或化学的测试化合物，例如，以化学化合物库的形式。根据本发明，术语“化学化合物库”指的是来自任何多样的来源中被组装起来的多种化学化合物，包括化学合成的分子和天然产物，或由组合化学技术生成的化合物。优选地，测试化合物为任何低分子量的化合物。
有利地，化学化合物库尤其适合高通量筛选。它可以包含特定结构的化合物或特定生物如植物的化合物。
在优选的实施方案中，在SEQ ID NO1的位置304包含有T的P2X1启动子的活性，特别是在P2X1启动子的一个或两个等位基因中包含T的细胞中，被测定并与在位置304包含C的P2X1启动子的活性进行比较，并且抗血栓形成剂作为逆转位置304的T对P2X1启动子的活性所起作用的测试化合物被鉴定。优选地，由此鉴定的抗血栓形成剂可以用于周围血管疾病(PVD)的预防或治疗。
在另外的优选的实施方案中，在SEQ ID NO1的位置304包含有C的P2X1启动子的活性，特别是在P2X1启动子的一个或两个等位基因中包含C的细胞中，被测定并与在位置304包含T的P2X1启动子的活性进行比较，并且抗血栓形成剂作为逆转位置304的C对P2X1启动子的活性所起作用的测试化合物被鉴定。优选地，由此鉴定的抗血栓形成剂可以用于中风的预防或治疗，优选地用于TIA或PRIND的预防或治疗。
在另外的优选的实施方案中，在SEQ ID NO1的位置764包含有C的P2X1启动子的活性，特别是在P2X1启动子的一个或两个等位基因中包含C的细胞中，被测定并与在位置764包含G的P2X1启动子的活性进行比较，并且抗血栓形成剂作为逆转位置764的C对P2X1启动子的活性所起作用的测试化合物被鉴定。优选地，由此鉴定的抗血栓形成剂可以用于PVD的预防或治疗。
在另外的优选的实施方案中，在SEQ ID NO1的位置764包含有G的P2X1启动子的活性，特别是在P2X1启动子的一个或两个等位基因中包含G的细胞中，被测定并与在位置764包含C的P2X1启动子的活性进行比较，并且抗血栓形成剂作为逆转位置764的G对P2X1启动子的活性所起作用的测试化合物被鉴定。优选地，由此鉴定的抗血栓形成剂可以用于中风的预防或治疗，优选地用于TIA或PRIND的预防或治疗。
在另外的优选的实施方案中，在SEQ ID NO1的位置838包含有T的P2X1启动子的活性，特别是在P2X1启动子的一个或两个等位基因中包含T的细胞中，被测定并与在位置838包含G的P2X1启动子的活性进行比较，并且抗血栓形成剂作为逆转位置838的T对P2X1启动子的活性所起作用的测试化合物被鉴定。优选地，由此鉴定的抗血栓形成剂可以用于心肌梗塞的预防或治疗，优选地用于早期心肌梗塞的预防或治疗。
在一个优选的实施方案中，在SEQ ID NO1的位置1002包含有C的P2X1启动子的活性，特别是在P2X1启动子的一个或两个等位基因中包含C的细胞中，被测定并与在位置1002包含T的P2X1启动子的活性进行比较，并且抗血栓形成剂作为逆转位置1002的C对P2X1启动子的活性所起作用的测试化合物被鉴定。优选地，由此鉴定的抗血栓形成剂可以用于PVD的预防或治疗。
本发明另外的方面涉及包含有用于血栓性疾病的预防或治疗的至少一个抗血栓形成剂的药物的制造方法，其中血栓性疾病优选地为PVD、中风，特别是TIA或PRIND，和或心肌梗塞，特别是早期心肌梗塞，其中抗血栓形成剂用本发明的P2X1启动子变体检测，优选地其中抗血栓形成剂用本发明的筛选抗血栓形成剂的方法检测。
本发明另外的方面涉及鉴定抗血栓形成剂的方法，此抗血栓形成剂可用于对具有发生血栓性疾病素质的个体的预防性或治疗性治疗，包括的步骤有(a)应用本发明的鉴定具有发生血栓性疾病素质个体的方法鉴定具有发生血栓性疾病素质的个体，和(b)应用本发明的筛选抗血栓形成剂的方法鉴定用于所述个体治疗的抗血栓形成剂。
本发明另一个方面涉及使抗血栓形成剂的治疗或预防剂量适合的方法，包括的步骤有(a)应用本发明的鉴定具有发生血栓性疾病素质个体的方法鉴定具有发生血栓性疾病素质的个体，(b)应用本发明的筛选抗血栓形成剂的方法鉴定用于所述个体治疗的抗血栓形成剂，和(c)为所述个体选择所述抗血栓形成剂的治疗性或预防性有效剂量。
另外，本发明涉及本发明的P2X1启动子变体的任何其他的用途，其中血栓性疾病或血栓性疾病素质被诊断、或提供了治疗。
本发明另外的方面涉及P2X1启动子变体的用途，用于发生血栓性疾病素质的诊断方法或测试系统的开发，用于筛选抗血栓形成剂的方法或测试系统的开发，用于鉴定可以用抗血栓形成剂治疗的个体的方法或测试系统的开发，或用于使抗血栓形成剂的治疗或预防剂量适合的方法或测试系统的开发。
在下文中，参考氨基酸序列、核酸序列和实施例，详细描述本发明。但是，实施例的细节并不用于限制本发明。更确切地，本发明涉及包括本发明实施例中没有明确提及、但是技术人员可以不用过度努力就可以发现的细节的任何实施方案。
序列描述SEQ ID NO1包含可自NCBI核苷酸数据库中以登录号AF177472获得的P2X1启动子的DNA序列。
SEQ ID NO2包含可自NCBI蛋白质数据库中以登录号S71927获得的P2X1蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO3包含用于测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置304处序列的第一寡核苷酸序列。SEQ ID NO3对应于NCBI序列AC005940.3的位置62490-62507。
SEQ ID NO4包含用于测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置304处序列的第二寡核苷酸序列，位于SEQ ID NO3的3’-方向互补链上。SEQID NO4是SEQ ID NO1的位置472-289的反义链。
SEQ ID NO5包含用于测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置764处序列的第一寡核苷酸序列。SEQ ID NO5对应于SEQ ID NO1的位置618-635。
SEQ ID NO6包含用于测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置764处序列的第二寡核苷酸序列，位于SEQ ID NO5的3’-方向互补链上。SEQID NO6是SEQ ID NO1的位置775-784的反义链。
SEQ ID NO7包含用于测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置838处序列的第一寡核苷酸序列。SEQ ID NO7对应于SEQ ID NO1的位置818-837。
SEQ ID NO8包含用于测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置838处序列的第二寡核苷酸序列，位于SEQ ID NO7的3’-方向互补链上。SEQID NO8是SEQ ID NO1的位置1003-1022的反义链。
SEQ ID NO9包含用于测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置1002处序列的第一寡核苷酸序列。SEQ ID NO9对应于SEQ ID NO1的位置818-837。
SEQ ID NO10包含用于测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置1002处序列的第二寡核苷酸序列，位于SEQ ID NO9的3’-方向互补链上。SEQID NO10是SEQ ID NO1的位置1003-1022的反义链。
实施例描述用于P2X1启动子变体的缩写应用了下列缩写，其中所指的位置指的是在SEQ ID NO1中核苷酸的位置。
-P2X1C304C指的是在P2X1基因的两个等位基因上的位置304都携带有胞苷(C)的人组。这些人对于此P2X1变体为纯合的。
-P2X1C304T指的是在P2X1基因的一个等位基因上的位置304携带胞苷(C)并且在P2X1基因的另一个等位基因的位置304携带胸腺嘧啶核苷(T)的人组。这些人对于此P2X1变体为杂合的。
-P2X1T304T指的是在P2X1基因的两个等位基因上的位置304都携带有胸苷(T)的人组。这些人对于此P2X1变体为纯合的。
-P2X1G764G指的是在P2X1基因的两个等位基因上的位置764都携带有鸟苷(G)的人组。这些人对于此P2X1变体为纯合的。
-P2X1C764G指的是在P2X1基因的一个等位基因上的位置764携带胞苷(C)并且在P2X1基因的另一个等位基因的位置764携带鸟苷(G)的人组。这些人对于此P2X1变体为杂合的。
-P2X1C764C指的是在P2X1基因的两个等位基因上的位置764都携带胞苷(C)的人组。这些人对于此P2X1变体为纯合的。
-P2X1T838T指的是在P2X1基因的两个等位基因上的位置838都携带有胸苷(T)的人组。这些人对于此P2X1变体为纯合的。
-P2X1T838G指的是在P2X1基因的一个等位基因上的位置838携带胸苷(T)并且在P2X1基因的另一个等位基因的位置838携带鸟苷(G)的人组。这些人对于此P2X1变体为杂合的。
-P2X1G838G指的是在P2X1基因的两个等位基因上的位置838都携带有鸟苷(G)的人组。这些人对于此P2X1变体为纯合的。
-P2X1T1002T指的是在P2X1基因的两个等位基因上的位置1002都携带有胸苷(T)的人组。这些人对于此P2X1变体为纯合的。
-P2X1T1002C指的是在P2X1基因的一个等位基因上的位置1002携带胸苷(T)并且在P2X1基因的另一个等位基因的位置1002携带胞苷(C)的人组。这些人对于此P2X1变体为杂合的。
-P2X1C1002C指的是在P2X1基因的两个等位基因上的位置1002都携带有胞苷(C)的人组。这些人对于此P2X1变体为纯合的。
在P2X1启动子区域鉴定的四个单核苷酸多态性(SNPs)在1404个病人的组中进行了研究，以确定这些基因变异与这些病人的临床症状之间的关系。
用DNA序列分析进行单核苷酸多态性(SNPs)的检测在P2X1基因的启动子中的基因组区域用下列寡核苷酸引物扩增。
1.对于在P2X1启动子序列中位置304的从C到T的核苷酸变异的检测，应用下列引物，引物来自序列AC005940.3AC005940.3是包含P2X1启动子上游的序列的一个基因组克隆在NCBI数据库中登录的序列编号。基于此序列，可设计出用于这样的区域扩增的寡核苷酸，所述区域允许在位置304的P2X1启动子变体的鉴定。相反地，AF177472.1是在NCBI数据库中登录的且包含启动子区和部分编码区的P2X1基因序列的序列编号。
5’-GAAAAGCCCATGACACCC-3’5’-CAACACGGGACAGAGAAC-3’2.对于在P2X1启动子序列中位置764的从G到C的核苷酸变异的检测，应用下列引物，引物来自SEQ ID NO15’-GATGTGGTGCTGGTCTTG-3’5’-GCTGGCATCTCTATCCCCCA-3’3.对于在P2X1启动子序列中位置838的从T到G的核苷酸变异的检测，应用下列引物，引物来自SEQ ID NO15’-GGAACTCAGAGCCTCCTTCC-3’5’-GGCAAGATGGAGCTCTGGCC-3’4.对于在P2X1启动子序列中位置1002的从T到C的核苷酸变异的检测，应用下列引物，引物来自SEQ ID NO15’-GGAACTCAGAGCCTCCTTCC-3’5’-GGCAAGATGGAGCTCTGGCC-3’用上述确定的寡核苷酸引物，根据下文说明的PCR方法，扩增基因组区域。
应用的试剂来自Applied Biosystems(Foster City，USA)20ng基因组DNA；1单位TaqGold DNA聚合酶；1xTaq聚合酶缓冲液；500μM dNTPs；2.5mM MgCl2；每一扩增引物对200nM(在1和2下的序列)；H2O加5μl。
用于基因分型的PCR扩增程序1个循环包括 95℃ 10分钟；接着为2个循环，每个包括95℃ 30秒，接着为70℃ 30秒；接着为2个循环，每个包括95℃ 30秒，接着为65℃ 30秒；接着为2个循环，每个包括95℃ 30秒，接着为60℃ 30秒；接着为40个循环，每个包括 95℃ 30秒，接着为56℃ 30秒，接着为72℃ 30秒；接着为1个循环，包括 72℃ 10分钟，接着为4℃ 30秒测序的PCR扩增程序1个循环，包括 96℃ 2分钟；接着为30个循环，每个包括96℃ 10秒，接着为55℃ 10秒，接着为65℃ 4分钟；接着为1个循环，包括 72℃ 7分钟，接着为4℃ 30秒。
测序产物的分析首先用序列分析软件(Sequence Aanlysis Software)(AppliedBiosystems，Foster City，USA)分析序列以得到粗略数据。用Phred，Phrap，Polyphred and Consed加工粗略数据。Phred，Phrap，Polyphred andConsed是由华盛顿大学的Phil Green编写的软件(http://www.genome.washington.edu)。
实施例在1404个病人的组中得到的结果表1表明了这组病人的特点，其中分析了在P2X1的启动子区域中SEQID NO1的位置304、764、838和1002的基因变异。
表1
*中位值和四分位数(Q1-Q3)
表2表明了在分析的病人组中P2X1变体的分布，参考在P2X1启动子区域根据SEQ ID NO1指出的位置。
表2
表3表明了根据SEQ ID NO1的所示P2X1变体与在所分析的病人组中的临床终点(clinical endpoints)间的关系。其中观察到的所述临床终点的病人数量以百分数给出。
表3
在分析的病人组中，观察到了PVD增加的危险性，它取决于P2X1基因的启动子在位置304包含有T的等位基因的存在和数量或者分别地，取决于P2X1基因的启动子在位置764包含有C的等位基因的存在和数量。另外，在携带P2X1T304T或P2X1C764C的病人中观察到了中风/PRIND/TIA减少的危险性。早期心肌梗塞发生的增加的危险性(定义为在女性＜55岁和男性＜60岁的心肌梗塞)取决于P2X1基因的启动子中在位置838包含T的等位基因的存在和数量。另外，PVD发生的增加的危险性取决于P2X1基因的启动子中在位置1002包含C的等位基因的存在和数量。基于这些相关性分析，得出结论为在P2X1基因的启动子区域的基因变异对心血管和血栓性疾病的发生和频率有重要的影响。
序列表<110>塞诺菲-安万特德国有限公司<120>发生血栓性疾病的素质的诊断方法及其用途<130>DEAV 2004/0018<160>10<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>1506<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1ggattgatta attgacaagg agagactgac ctgggtgctg gaaggggcca tgggcagcct60tctgtgggtg acccccattc agacaggctg ccgggattcc cagccccagg gcctggctcc120tgcccagagc acttccagct catggctcgc cagcaagaag actccttatc agccttaagg180gtggggcggc tccgacgaca gggccgtggg ggctcgccag ggaggcccct gcttccagct240tgaacctcca gtaccacccc gggtgagctt gggcaactca tttctcttct ctgagcttgg300tttcctcatc ttcaaaacga ggggtggggc tggggaggcc tccagctctg aggagccaac360gtgggaccct ctgcccaccc caaacccctg tgttcagggc ccgagctggg ggtgggaagg420gaaggcaggg actgcagagg tgctgtgccc ccgactcatt gggggcctcc agttctctgt480cccgagttgc tgagacccat cccctgtgag cctcgaccta gaaggaacag cccttattac540cccaatttac agatgaggca acaggctcgg agaggcaagg tgacacccag cccccacagc600caagaagtgg cagagccagg gatctccgag gtcaggctct ctcggctggt cttgggcccc660ccatggcacc ggtgacggat gtggtgctgg tcttggctgg gcacctgcca cctctctccc720tctgatggtg gcccccggca ggacagacag tgggagagga gaggtggggg atagagatgc780cagctcagca ccgaggttga ccgggcacgg ccaggctgga actcagagcc tccttcctct840ctgccttgct cgctgcagac ccccagggac gaagcagcca accctggtgg gggagggtgg900agggtggtgg atggggctgg ggatggaggt ctcattttgg cagtggaggg gagtcgcggg960
gagtccccta atctgaggag actccagctt cccccaggcc ctggccagag ctccatcttg1020ccaggttttg gggggaggat aacttgagga gtcgactgag agctttatct ttgcccctgt1080gacgggtggc ctgtggtttc ctgccaacaa ctcctgtttc cggaggccca acaaggccca1140cgcagagcca ggaggggcag tggggctggg cctgggtggc cccaccagcc ccgccccatc1200tatctttggg aatttatttg tccatgggcg aggctggcct gcagtctgtt gccttccagg1260ggccaagagc tgctctgatc acccagggat tctctctcca acccaagtgc ctccagctga1320cctctggctc ctgtcctctg gctccacctg caccgccctg ctcttcctaa ggggccagga1380agcccccaga agctctacca tcgacgtggg tggtggcacc cggctcaccc tgagagcaga1440ggccgtgcag ggggctcagt tctgagcccc agccggccca ccatggcacg gcggttccag1500gaggag 1506<210>2<211>399<212>PRT<213>人<400>2Met Ala Arg Arg Phe Gln Glu Glu Leu Ala Ala Phe Leu Phe Glu Tyr1 5 10 15Asp Thr Pro Arg Met Val Leu Val Arg Asn Lys Lys Val Gly Val Ile20 25 30Phe Arg Leu Ile Gln Leu Val Val Leu Val Tyr Val Ile Gly Trp Val35 40 45Phe Leu Tyr Glu Lys Gly Tyr Gln Thr Ser Ser Gly Leu Ile Ser Ser50 55 60Val Ser Val Lys Leu Lys Gly Leu Ala Val Thr Gln Leu Pro Gly Leu65 70 75 80Gly Pro Gln Val Trp Asp Val Ala Asp Tyr Val Phe Pro Ala Gln Gly85 90 95
Asp Asn Ser Phe Val Val Met Thr Asn Phe Ile Val Thr Pro Lys Gln100 105 110Thr Gln Gly Tyr Cys Ala Glu His Pro Glu Gly Gly Ile Cys Lys Glu115 120 125Asp Ser Gly Cys Thr Pro Gly Lys Ala Lys Arg Lys Ala Gln Gly Ile130 135 140Arg Thr Gly Lys Cys Val Ala Phe Asn Asp Thr Val Lys Thr Cys Glu145 150 155 160Ile Phe Gly Trp Cys Pro Val Glu Val Asp Asp Asp Ile Pro Arg Pro165 170 175Ala Leu Leu Arg Glu Ala Glu Asn Phe Thr Leu Phe Ile Lys Asn Ser180 185 190Ile Ser Phe Pro Arg Phe Lys Val Asn Arg Arg Asn Leu Val Glu Glu195 200 205Val Asn Ala Ala His Met Lys Thr Cys Leu Phe His Lys Thr Leu His210 215 220Pro Leu Cys Pro Val Phe Gln Leu Gly Tyr Val Val Gln Glu Ser Gly225 230 235 240Gln Asn Phe Ser Thr Leu Ala Glu Lys Gly Gly Val Val Gly Ile Thr245 250 255Ile Asp Trp His Cys Asp Leu Asp Trp His Val Arg His Cys Arg Pro260 265 270Ile Tyr Glu Phe His Gly Leu Tyr Glu Glu Lys Asn Leu Ser Pro Gly275 280 285
Phe Asn Phe Arg Phe Ala Arg His Phe Val Glu Asn Gly Thr Asn Tyr290 295 300Arg His Leu Phe Lys Val Phe Gly Ile Arg Phe Asp Ile Leu Val Asp305 310 315 320Gly Lys Ala Gly Lys Phe Asp Ile Ile Pro Thr Met Thr Thr Ile Gly325 330 335Ser Gly Ile Gly Ile Phe Gly Val Ala Thr Val Leu Cys Asp Leu Leu340 345 350Leu Leu His Ile Leu Pro Lys Arg His Tyr Tyr Lys Gln Lys Lys Phe355 360 365Lys Tyr Ala Glu Asp Met Gly Pro Gly Ala Ala Glu Arg Asp Leu Ala370 375 380Ala Thr Ser Ser Thr Leu Gly Leu Gln Glu Asn Met Arg Thr Ser385 390 395<210>3<211>18<212>DNA<213>人<400>3gaaaagccca tgacaccc18<210>4<211>18<212>DNA<213>人<400>4caacacggga cagagaac18<210>5<211>18<212>DNA<213>人
<400>5gatgtggtgc tggtcttg18<210>6<211>20<212>DNA<213>人<400>6gctggcatct ctatccccca20<210>7<211>20<212>DNA<213>人<400>7ggaactcaga gcctccttcc20<210>8<211>20<212>DNA<213>人<400>8ggcaagatgg agctctggcc20<210>9<211>20<212>DNA<213>人<400>9ggaactcaga gcctccttcc20<210>10<211>20<212>DNA<213>人<400>10ggcaagatgg agctctggcc20
权利要求
1.诊断发生血栓性疾病的素质的方法，其包括(a)在来自个体的组织样本中确定P2X1启动子的至少一个等位基因在SEQ ID NO1的位置304、764、838或1002的至少之一处的序列，和/或(b)在来自个体的组织样本中确定P2X1蛋白质的量。
2.根据权利要求1的方法，其中在至少一个等位基因上，优选地在两个等位基因上，位置304为T表明了周围血管疾病(PVD)增加的危险性。
3.根据权利要求1的方法，其中在至少一个等位基因上，优选地在两个等位基因上，位置764为C表明了周围血管疾病(PVD)增加的危险性。
4.根据权利要求1的方法，其中在两个等位基因上的位置304为T，或在两个等位基因上的位置764为C表明了中风的减少的危险性，特别是短暂性局部缺血发作(TIA)或长时的可逆性缺血性神经功能缺失(PRIND)的减少的危险性。
5.根据权利要求1的方法，其中在位置304为C，或在位置764为G表明了中风的增加的危险性。
6.根据权利要求1的方法，其中在至少一个等位基因上，优选地在两个等位基因上，位置838为T表明了过早心肌梗塞增加的危险性。
7.根据权利要求1的方法，其中在至少一个等位基因上，优选地在两个等位基因上，位置1002为C表明了周围血管疾病(PVD)增加的危险性。
8.根据权利要求1到7的至少一项所述的方法，其中在位置304、764、838、或1002处的两处、三处或全部位置处测定P2X1启动子的序列。
9.根据权利要求1-8的至少一项所述的方法，其中对包含至少一个位置304、764、838、或1002的P2X1启动子片段通过用根据Sanger的DNA测序和/或通过PCR扩增测定序列，特别是在TaqMan PCR分析中测定序列。
10.根据权利要求9的方法，其中应用包含有SEQ ID NO3或SEQ IDNO4的至少一条寡核苷酸以测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置304的序列，应用包含有SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的至少一条寡核苷酸以测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置764的序列，应用包含有SEQID NO7或SEQ ID NO8的至少一条寡核苷酸以测定P2X1启动子在SEQID NO1的位置838的序列，和/或应用包含有SEQ ID NO9或SEQ IDNO10的至少一条寡核苷酸以测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置1002的序列。
11.根据权利要求1到8中至少一项所述的方法，其包括焦磷酸测序、质谱辅助的DNA测序、DNA微列阵杂交或Southern分析。
12.根据权利要求1到11中至少一项所述的方法，其中P2X1蛋白质改变的量指示发生血栓性疾病的素质。
13.根据权利要求1或12的方法，其中抗P2X1抗血清、抗P2X1抗体或抗P2X1抗体片段用于测定P2X1蛋白质的量，特别是在Western分析或ELISA测定法中。
14.根据权利要求1或12的方法，其中测定P2X1mRNA的量并用来指示P2X1蛋白质的量。
15.根据权利要求14的方法，其中mRNA分子的量通过Northern分析、通过包括逆转录mRNA分子的起始步骤的PCR分析、通过差异显示分析、或通过代表性差异分析测定。
16.根据权利要求1或12的方法，其中P2X1蛋白质的活性被测定并用来指示P2X1蛋白质的量。
17.根据权利要求16的方法，其中在人或动物细胞中测定P2X1蛋白质的活性。
18.测试系统，其包含至少一条核酸探针或寡核苷酸，允许测定在获自个体的组织样本中的P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置304的序列、在SEQ ID NO1的位置764的序列、在SEQ ID NO1的位置838的序列、或在SEQ ID NO1的位置1002的序列。
19.根据权利要求18的测试系统，其包含至少一条含有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的寡核苷酸以测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置304的序列，包含至少一条含有SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的寡核苷酸以测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置764的序列，包含至少一条含有SEQ ID NO7或SEQ ID NO8的寡核苷酸以测定P2X1启动子在SEQID NO1的位置838的序列，和/或包含至少一条含有SEQ ID NO9或SEQID NO10的寡核苷酸以测定P2X1启动子在SEQ ID NO1的位置1002的序列。
20.根据权利要求18或19的测试系统的用途，用于发生血栓性疾病的素质的诊断。
21.根据权利要求20的用途，其中在至少一个等位基因上，优选地在两个等位基因上，位置304为T表明了周围血管疾病(PVD)增加的危险性。
22.根据权利要求20的用途，其中在至少一个等位基因上，优选地在两个等位基因上，位置764为C表明了周围血管疾病(PVD)增加的危险性。
23.根据权利要求20的用途，其中在两个等位基因上的位置304为T，或在两个等位基因上的位置764为C表明了中风的减少的危险性，特别是短暂性局部缺血发作(TIA)或长时的可逆性缺血性神经功能缺失(PRIND)的减少的危险性。
24.根据权利要求20的用途，其中在位置304为C，或在位置764为G表明了中风的增加的危险性。
25.根据权利要求20的用途，其中在至少一个等位基因上，优选地在两个等位基因上，位置838为T表明了过早心肌梗塞增加的危险性。
26.根据权利要求20的用途，其中在至少一个等位基因上，优选地在两个等位基因上，位置1002为C表明了周围血管疾病(PVD)增加的危险性。
27.测试系统，其包含至少一种抗P2X1抗血清、抗P2X1抗体或抗P2X1抗体片段，用于测定在获自个体的组织样本中P2X1蛋白质的量。
28.根据权利要求27的测试系统的用途，用于发生血栓性疾病的素质的诊断。
29.根据权利要求28的用途，其中P2X1蛋白质的改变的量表明了可以用抗血栓形成剂预防性或治疗性治疗的个体。
30.P2X1启动子变体，其包含在SEQ ID NO1的位置304为T或C、在SEQ ID NO1的位置764为C或G、在SEQ ID NO1的位置838为T、和/或在SEQ ID NO1的位置1002为C的至少之一。
31.测试系统，其包含根据权利要求30的P2X1启动子变体，其中启动子变体指导可检测产物的合成。
32.根据权利要求31的测试系统的用途，用于筛选抗血栓形成剂。
33.筛选抗血栓形成剂的方法，其中所述方法包括下述步骤(a)提供根据权利要求30的P2X1启动子变体，(b)使P2X1启动子变体与测试化合物接触，以及(c)确定P2X1启动子变体的活性。
34.根据权利要求33或34的方法，其适合于测试化合物的高通量筛选。
35.鉴定可用于预防性或治疗性治疗具有发生血栓性疾病素质的个体的抗血栓形成剂的方法，其包括下述步骤(a)应用根据权利要求1到17中至少一项所述的方法鉴定具有发生血栓性疾病素质的个体，以及(b)应用根据权利要求33或34的方法鉴定用于所述个体治疗的抗血栓形成剂。
36.使抗血栓形成剂的治疗或预防剂量适合的方法，其包括下述步骤(a)应用根据权利要求1到17中至少一项所述的方法鉴定具有发生血栓性疾病素质的个体，(b)应用根据权利要求33或34的方法鉴定用于所述个体治疗的抗血栓形成剂，和(c)为所述个体选择所述抗血栓形成剂的治疗或预防有效量。
37.根据权利要求30的P2X1启动子变体的用途，用于发生血栓性疾病素质的诊断方法或测试系统的开发，用于筛选抗血栓形成剂的方法或测试系统的开发，用于鉴定可以用抗血栓形成剂治疗的个体的方法或测试系统的开发，或用于使抗血栓形成剂的治疗或预防剂量适合的方法或测试系统的开发。
全文摘要
本发明涉及发生血栓性疾病素质的诊断方法，涉及测试系统和它们用于发生血栓性疾病素质的诊断的用途，涉及P
文档编号C12N15/11GK1938431SQ200580010607
公开日2007年3月28日 申请日期2005年3月16日 优先权日2004年3月29日
发明者D·科齐安, M·赫尔曼, J-F·德勒兹, S·里卡德, S·马赛 申请人:塞诺菲-安万特德国有限公司