专利名称：新蛋白ddip及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个全新蛋白DDIP(Dishevelled2DEP domainInteractingProtein)及其编码基因与应用。
背景技术：
Wnt是一种糖蛋白因子，通过旁分泌的形式发挥功能。正常的Wnt信号通路在胚胎发育过程中极其重要，不但参与了胚胎背腹轴的形成，而且与细胞极性建立、细胞命运决定等多个发育事件有关；而Wnt信号通路的异常活化则往往导致肿瘤发生如结肠癌，肝癌，卵巢癌，前列腺癌，皮肤癌等。因此研究Wnt信号的传导机制具有非常重要的意义。近年来，随着Wnt下游各个效应蛋白的发现，人们对Wnt介导的下游信号传导通路的研究取得了飞速的进展。目前已经建立起来的Wnt信号传导通路包括Wnt/β-catenin经典通路，Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2+通路。
Wnt/β-catenin经典通路模型认为，在没有Wnt信号因子存在的情况下，细胞中存在着一个APC，GSK3β，Axin和β-catenin四个蛋白组成的复合物，GSK3β在Axin和APC的协助下磷酸化β-catenin，使之通过泛素化-蛋白酶体途径被降解。在Wnt信号因子存在的情况下，膜上受体Frizzled和LRP5/6与配体结合并向下游传导信号激活Dishevelled蛋白。Dishevelled蛋白抑制GSK3β对β-catenin的磷酸化作用，使其在细胞内保持稳定。游离β-catenin被转运进入细胞核并与TCF/LEF转录因子(T cell factor/lymphocyte enhancer factor)结合，参与转录激活，调控特定Wnt靶基因的表达。
Dishevelled是Wnt信号传导通路中的重要因子，在Wnt/β-catenin经典通路中，Wnt蛋白存在的条件下，Dishvelled蛋白被激活并抑制GSK3β对β-catenin的磷酸化作用，从而抑制细胞质内β-catenin的降解，使游离的β-catenin水平升高，调节下游基因的转录。已经发现有许多蛋白通过与Dishevelled之间的相互作用对Wnt信号通路进行调控，如GBP/Frat、Nkd、E-Arrestin、Dapper、Idax等。Dishevelled还是Wnt信号三条传导通路的交叉点，它在Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2+通路的传导过程中都发挥着重要的作用。Dishevelled蛋白作为Wnt信号通路中的关键调节分子之一，对于阐明Wnt信号通路的传导和功能有着重大的意义，而成为学者们研究的热点之一。利用简单有效的酵母双杂交方法寻找Dishevelled的相互作用蛋白，对它们在Wnt通路中的调控作用进行研究，便是为Wnt信号传导机理提供新线索的途径之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种全新的Dishevelled相互作用蛋白及其编码基因。
本发明所提供的蛋白名称为DDIP(Dishevelled2DEP domainInteractingProtein)，它是序列表中SEQ ID No.2的氨基酸残基序列或将SEQ ID No.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No.2相同活性的由SEQ ID No.2衍生的蛋白。
序列表中SEQ ID No.2的蛋白全长327个氨基酸，在人、小鼠、大鼠中都存在高度保守的同源序列。将DDIP同源物的各个氨基酸序列提交Predict protein网站进行比对搜索和预测，结果显示，这些序列都存在一些可被修饰的位点，其中包括高度保守的可被CKII磷酸化的三个位点以及一个双向核定位信号，上述高度保守修饰位点在图2中已被标注。此外，除小鼠BAB24285蛋白(核苷酸序列号AK005865)有可能存在跨膜区外，其他同源物都被预测为胞内蛋白。
新蛋白DDIP的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID No.1；2)编码序列表中SEQ ID No.2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白的DNA序列。
序列表中的SEQ ID No.1由1014个碱基组成，定位于小鼠的17号染色体上，CDS为13…996核苷酸，编码DDIP蛋白分子。利用核苷酸序列在NCBI网站中的UniGene对不同物种的ddip同源基因进行了cDNA的组织来源搜索。结果如表1，可以看出，在睾丸、精母细胞、肾、骨髓、良性肿瘤、神经系统中的视网膜和嗅觉中枢中心等都发现了该基因的存在。值得注意的是，这些组织与Wnt信号通路有着一定的关系，间接暗示了DDIP作为Wnt信号通路一员的可能性。由于Wnt信号分子在不同物种中一般都是高度保守的，加上目前数据库的不完整，虽然至今仍没在人与鼠类的其他物种中发现其同源基因，但其存在性仍有待进一步的确认。
表1 各物种中DDIP蛋白同源物cDNA的组织来源搜索结果。
本发明的DDIP是Wnt信号通路的一个新的抑制因子。对它的研究可能为Wnt通路相关癌症的治疗提供依据。
图1为DDIP蛋白与诱饵蛋白Dvl2-DEPC在酵母中β-半乳糖苷酶活性滤纸分析结果。
图2为DDIP蛋白在人、小鼠、大鼠中的氨基酸序列比较。图中线框区表示物种之间序列同源性为100％的保守区，灰色部分表示相似的氨基酸；各种不同颜色和图案代表可能被修饰的位点；其中mDDIP为筛选出来的克隆。
图3为DDIP不同缺失的融合蛋白示意图。
图4为Myc-DDIP在Hela细胞中的定位。
图5为在293T细胞中DDIP与Dishevelled2的相互作用情况。上面两张图分别为用anti-Myc与anti-Flag两种不同抗体免疫沉淀后，沉淀复合物的Western检测结果。下面两张图则分别表示细胞裂解液中Dvl2和DDIP蛋白的表达情况。
图6为DDIP与人源细胞293T内源性Dishevelled2的结合情况。
图7为DDIP与缺失不同结构域的Dishevelled2的结合情况。
图8为DDIP的小鼠同源物与Dishevelled2的结合情况。
图9为DDIP对Wnt和Dvl2(包括缺失DEP结构域的Dvl2)响应的下游基因转录的影响。
图10为DDIP对E-catenin和E-cateninSA响应的下游基因转录的影响。
图11为DDIP对cbfa1下游基因转录的影响。
图12为DDIP与E-catenin相互结合的情况。
图13为DDIP与293T细胞中内源性的人源E-catenin相互结合的情况。
图14为DDIP与ESA-catenin相互结合的情况。
具体实施例方式
实施例1、Dishevelled2相互作用蛋白的筛选与鉴定。
为了寻找新的可与Dishevelled相互作用又参与Wnt信号通路的蛋白，选择了目前研究较少却很重要的Dishevelled的DEP结构域和羧基端一共350个氨基酸做为诱饵蛋白，利用酵母双杂交的方法，筛选小鼠11天胚胎cDNA文库。经过一系列的鉴定和β-半乳糖苷酶活性测定，最终得到了15个结合作用较强的克隆。经过核苷酸的提取鉴定、测序与比对以后，发现β-半乳糖苷酶活性最强的阳性克隆DL-139是一个全新的蛋白。为了进一步验证筛选结果的真实性，将诱饵蛋白和筛选到的DL-139文库质粒重新转化入酵母进行β-半乳糖苷酶活性的测定，如图1所示，结果仍为阳性，表明DL-139与Dvl2-DEP在酵母中确实存在相互作用，并将其命名为DDIP(Dishevelled-DEP domainInteractingProtein)。
实施例2、DDIP蛋白相关表达载体的构建。
虽然酵母双杂交筛选中得到的蛋白DDIP就是全长，但只能在酵母中表达。为了有利于以后的研究，利用Primer5软件设计引物(各引物序列见表2)，分别将DDIP的小鼠与人的同源物，及小鼠DDIP的不同缺失(按生物信息学预测结果而选择，图3为DDIP不同缺失的融合蛋白的示意图。)克隆到真核表达载体上，得到如表3所示的一系列质粒。这些质粒可用于后续研究中转染细胞，表达融合蛋白。
表2引物序列信息
表3 DDIP相关质粒信息。
实施例3、DDIP蛋白在细胞中定位的研究。
为了研究DDIP在细胞的定位区域，先将实施例2中得到的质粒Myc-mDDIP用Tfx-20转染到293T细胞中(按照转染试剂Tfx-20所提供的实验方法进行转染)，24小时后利用Western的方法检测其表达。在确保其可以表达后(data no show)，用LipofectMINE2000将质粒Myc-mDDIP转染到Hela细胞中(按照转染试剂LipofectMINE2000所提供的实验方法进行转染)，24小时后收获细胞，用3.7％多聚甲醛室温孵育固定10分钟，10％山羊血清37℃封闭1个小时，加入一抗(Anti-Myc，稀释度为1∶100)37℃孵育1小时，PBS洗涤三次，接着加入二抗(Anti-mouse，稀释度为1∶200)37℃孵育30分钟，PBS洗涤三次后，激光共聚焦显微镜拍照观察其在细胞内的定位情况。如图4显示，DDIP可定位于细胞核与细胞质中，而且主要分布在细胞核，在细胞质中只定位在一些类似于细胞骨架的组分上。
实施例4、DDIP与Dishevelled2之间相互作用的验证。
由于酵母与高等真核生物存在差异性，所以两个蛋白在酵母中有相互作用并不意味着这两个蛋白在其他真核细胞或在真核生物机体生长发育过程中也会有真实的相互作用。所以，采用免疫共沉淀方法在哺乳动物细胞中进行蛋白质结合实验，对DDIP与Dishevelled2之间的相互作用进行验证。
首先，验证所筛选得到的mDDIP与mDvl2相互作用的真实性。将质粒pCS2/Flag-Dvl2以及实施例2中得到的Myc-mDDIP质粒按实验需要用钙转染试剂(Promega公司)转染到293T细胞中表达，表达48小时后将细胞收集裂解。再将细胞裂解液中加入抗Myc抗体或抗Flag抗体和Protein G Plus Agarose beads进行免疫共沉淀试验，最后结果用Western检测。如图5显示，只有同时过量表达Flag-mDvl2和Myc-mDDIP的实验组，免疫沉淀混合物中才能检测到Flag-mDvl2或Myc-mDDIP，而单独过量表达Flag-mDvl2或者Myc-mDDIP的对照组则检测不到。经过多次的重复试验证实了其可信度并验证了酵母双杂交的结果，暗示了mDvl2和mDDIP在细胞内可能因存在相互作用而处在同一蛋白复合物上。
由于过量表达Dishevelled蛋白或是Wnt的信号存在下，Dishevelled蛋白处于活化状态。一般蛋白的活化将造成其蛋白构象发生变化，进而改变了它与其他蛋白之间的结合能力。为了探讨DDIP蛋白和Dishevelled蛋白之间的相互作用是否与Dishevelled蛋白的活性有关，可否被Wnt调控，在293T细胞中单独转染了实施例2中得到的Myc-mDDIP质粒，裂解细胞前4-24hr加Wnt3a条件培养基或对照培养基刺激细胞，裂解收取细胞后进行免疫共沉淀试验，结果用Western检测。图6结果显示，只有mDDIP可被Dvl2特异性抗体免疫沉淀下来，且与Wnt3a的刺激无关。无论细胞是否被Wnt3a刺激，mDDIP皆可与293T细胞中的人源Dvl2相互作用。这是证实mDDIP与Dvl2蛋白之间相互作用的更有利的证据。
图5、6结果表明，mDDIP和其同源物与mDvl2之间确实存在相互作用。由于是以mDvl2的羧基端为诱饵蛋白通过酵母双杂交系统筛选得到的mDDIP蛋白，所以mDDIP与Dvl2之间的相互作用可能是通过Dvl2的DEP结构域或羧基端，当DEP结构域或羧基端发生缺失时，很有可能会影响mDDIP与Dvl2之间的结合。已知Dishevelled蛋白中含有分别为氨基端的DIX、中间的PDZ和羧基端的DEP结构域三个保守的结构域，为了探讨这三个结构域是否为Dvl2与DDIP结合所必须的，构建了分别缺失这三个结构域的真核表达载体pCS2/Flag-Dvl2ΔDIX，pCS2/Flag-Dvl2ΔPDZ和pCS2/Flag-Dvl2ΔDEP，将它们分别与实施例2中得到的Myc-mDDIP质粒共同转染293T细胞，最后利用免疫沉淀方法验证。结果如图7所示，mDDIP能与这三个Dvl2突变体结合，说明这三个保守结构域对于mDDIP与Dvl2的结合不是必须的。
一般来讲，当同一物种中同一蛋白天然存在多个同源物时，这些同源物都之间存在互相调节的作用。它们可能行使类似的功能，当其中一个发生缺失或突变时可以减少对机体所带来的影响，但它们也可能彼此成为竞争结合到同一蛋白的对象，起到负调节的功能。因此，在确认mDDIP可与Dvl2相互作用后，探讨了mDDIP两个存在于小鼠中的同源物是否也可与Dishevelled2蛋白结合。如果它们也能够和mDDIP和Dvl2结合，则有可能对mDDIP与Dvl2共同行使的功能进行调节。于是，将实施例2中得到的HA-mDDIP、HA-mDDIPh1、HA-mDDIPh2质粒分别与pCS2/Flag-Dvl2共同转染293T细胞，结合免疫沉淀和Western进行检测。图8的结果显示，DDIP在小鼠中的三个同源物都可以与mDvl2特异性结合。
实施例5、DDIP对Wnt/E-catenin下游靶基因转录调节作用的验证。
实施例4的结果验证了DDIP与Dishevelled2的相互作用，这表明DDIP有可能通过与Dishevelled蛋白的相互作用而进一步调节Wnt信号通路的传导。从目前对可与Dishevelled相互作用的蛋白的研究成果看来，这些蛋白如果可以通过Dishevelled对Wnt信号通路进行调节，其对Wnt经典通路都有激活或抑制的作用。因此，利用简便快速而又有效的荧光素酶报告系统检测DDIP对Wnt信号通路的调节作用。通过转染，在细胞内过量表达DDIP基因来观察其对Wnt信号通路的调节。所使用的LEF-1荧光素酶报告质粒，其启动子序列上带有六个重复的LEF-1结合位点，只有在Wnt因子的刺激作用下，LEF-1蛋白才可与这些位点结合并激活下游荧光素酶报告基因的转录，表达的荧光素酶可催化底物释放荧光，通过荧光素酶报告分析仪(Top Count)即可检测到荧光的强度，反映出报告基因转录水平的变化，从而显示了Wnt-1下游基因转录表达的情况。
如图9所示，转染Wnt1、Dishevelled2或缺失DEP结构域的Dishevelled2都能够激活荧光素酶报告系统，而当单独表达DDIP时，报告基因不被激活。DDIP与Wnt1、Dishevelled2还有Dvl2ΔDEP共表达之后荧光素酶活性明显降低，提示mDDIP能在Dishevelled的作用水平上抑制Wnt1下游报告基因的表达。继续检测DDIP对下游的E-catenin的影响时，发现DDIP不但可以抑制E-catenin所激活的基因转录，对E-catenin持续活化的突变体E-cateninSA(磷酸化位点苏氨酸突变为丙氨酸)的基因转录也有着同样的作用，而且对两者的抑制比Wnt1或Dvl2更加显著(结果如图10所示)。同时，为了确保DDIP对Wnt经典途径下游基因转录的抑制现象是特异的，在COS7细胞中检测其对CBFA1下游基因转录的影响。结果如图11所示，DDIP对CBFA1下游基因的转录没有任何影响，这说明其在293T细胞中对Wnt经典途径的抑制现象是特异性和真实的。
实施例6、DDIP与E-catenin、E-catenin SA结合情况的验证。
实施例5结果显示，mDDIP不仅能够抑制Wnt和Dvl2响应的基因转录，对于Dvl2下游蛋白E-catenin和ESA-catenin响应的基因转录也有同样的抑制作用，而且比前两者抑制得更显著。结合蛋白序列预测结果，DDIP蛋白具有一个保守的双向核定位信号，所以DDIP可能参与了E-catenin活化后进核与转录过程的调控。为了对此假设进行验证，再次利用了免疫共沉淀的方法，证实了mDDIP与E-catenin之间确实存在相互作用，为DDIP对E-catenin下游转录活性的影响的真实性提供了一个有力的证据。如图12所示，DDIP与E-catenin之间确实存在相互作用，而且两者的相互作用与E-catenin的磷酸化状态无关。无论是否存在Wnt3a的刺激(图13)，或是因磷酸化位点已被突变的E-catenin持续活化突变体ESA-catenin(图14)都可与mDDIP相互结合，有力地证明了荧光素酶报告系统所得实验结果的真实性，并暗示mDDIP可能参与了Wnt经典途径中下游基因转录过程的调控。
序列表<160>2<210>1<211>1014<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<400>11GCCACATCCT CCATGGAGTC TTCCAAGGAT ACCCAGCACG GTGATGCTCT51 AGAATCTAAA AGTTGCTTGG CTAACAGGAC GTCCTCTCGT CAGAACAAAA101 GGACCAGCCT CTCGTCTTCT GACGGAACAG GTCCGAGAGT CACTGAGTCC151 CTAGGCCTTC CCAGGGTGTT GACTCCCTCT GACACGGCTG CGGAGCTGGG201 TCAGAAGACC TCCTCCTCTT CGTCTTCCTC CTCTTCCTCT GCTCAGTCTA251 ATCGTTCCTC AAAAGTTTCG CTGCCTGAAA TCCCAAAGGA AAAATATCCC301 GAGGAATTCA GCCTGCTCAA TTCACAGACA GAAGATGGGC AGCGTCCTGA351 GTGGACATTT TATCCAAGGT TCAGCAGCAA CATCCACACC TACCACATTG401 GAAAGCAGTG CTTCTTCAAT GGGGTCTTCC GGGGCAACAG GAGGTCTGTG451 GCAGAGAGGA CAGTGGACAA CAGCCTCGGG AAGAAGAAAT ACGATATTGA501 TCCCAGAAAT GGAATCCCCA AATTGACACC AGGGGATAAT CCGTACATGT551 TCCCAGAACA GAGTAAAGAG TTCTTCAAAG CGGGAGCAAC TTTGCCTCCG601 GTGAACTTCT CACTGGGACC TTACGAGAAA AAATTCGACA CATTTATCCC651 GCTTGAGCCA CTTCCAAAAA TTCCCAATCT GCCTTTCTGG GAGAAGGAAA701 AAGCCAACAA TTTGAAGAAC GAGATAAAAG AAGTCGAGGA GCTTGACAAC751 TGGCAGGTGC CGATGCCCTT CCTACATGGT TTCTTCTCCA CTGGGACTGG801 GGAGATGGCT CCACGGTTAA AGGTGCTCGC TGCTCTTCCA GAAGGAACAA851 GTTCAGTTCT CAGCACCCAA GGGAGGCTCA CAACCCCCTG TAGTTCCAGC901 ATCAGAGGGT CTCAAACCCT CTTCCTGCCT CACCGGACAT CCTCTCATGT951 GTTGCGTACA TATACACGAA CGTTACATAT AAATAAAAAG CCTTAAAAAA1001 AAAAAAAAAA AAAA
<210>序列号<211>327<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>21 MESSKDTQHG DALESKSCLA NRTSSRQNKR TSLSSSDGTG PRVTESLGLP51 RVLTPSDTAA ELGQKTSSSS SSSSSSAQSN RSSKVSLPEI PKEKYPEEFS101 LLNSQTEDGQ RPEWTFYPRF SSNIHTYHIG KQCFFNGVFR GNRRSVAERT151 VDNSLGKKKY DIDPRNGIPK LTPGDNPYMF PEQSKEFFKA GATLPPVNFS201 LGPYEKKFDT FIPLEPLPKI PNLPFWEKEK ANNLKNEIKE VEELDNWQVP251 MPFLHGFFST GTGEMAPRLK VLAALPEGTS SVLSTQGRLT TPCSSSIRGS301 QTLFLPHRTS SHVLRTYTRT LHINKKP
权利要求
1.新蛋白DDIP(Dishevelled2DEP domainInteractingProtein)，它是序列表中SEQ IDNo.2的氨基酸残基序列或将SEQ ID No.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No.2相同活性的由SEQ ID No.2衍生的蛋白。
2.根据权利要求1所述的新蛋白DDIP(Dishevelled2DEP domainInteractingProtein)，其特征在于它具有序列表中SEQ ID No.2的氨基酸残基序列。
3.新蛋白DDIP的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID No.1；2)编码序列表中SEQ ID No.2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述DDIP的编码基因是序列表中的SEQID No.1。
5.含有权利要求4所述基因的表达载体。
6.含有权利要求4所述基因的细胞系。
7.权利要求4所述基因在构建抗肿瘤药物筛选模型中的应用。
8.权利要求4所述基因在制备治疗癌症的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了新蛋白DDIP及其编码基因与应用，本发明所提供的新蛋白名称为DDIP(Dishevelled2 DEP domain Interacting Protein)，它是序列表中SEQ ID No.2的氨基酸残基序列或将SEQ ID No.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No.2相同活性的由SEQ ID No.2衍生的蛋白。新蛋白DDIP的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID No.1；2)编码序列表中SEQ ID No.2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白的DNA序列。DDIP是Wnt信号通路的一个新的抑制因子。
文档编号A61K49/00GK1796411SQ20041010287
公开日2006年7月5日 申请日期2004年12月29日 优先权日2004年12月29日
发明者黄世思, 韩亮, 张新军, 王芳, 张慧, 翟永功, 常智杰 申请人:北京师范大学, 清华大学