治疗系统性红斑狼疮的肽的胃肠道外制剂的制作方法

专利名称：治疗系统性红斑狼疮的肽的胃肠道外制剂的制作方法
本申请要求提交于2003年1月14日的美国临时申请号60/439,950的优先权，特此将其全部内容并入作为参考。
在整个申请中，将各种出版物全文引用作为参考。特此，将这些出版物全部内容并入本申请作为参考从而更充分地描述在本文描述和要求的本发明的日期之前的所属本领域那些技术人员已知的技术状态。
背景技术：
系统性红斑狼疮(SLE)，或狼疮是一种使人衰弱的(debilitating)自身免疫病，其特征在于一批自身抗体的存在，所述抗体包括针对dsDNA的抗体，针对核抗原的抗体和针对核糖核蛋白的抗体。大约2000人中要有1人受到SLE的侵袭(美国，700个妇女中有1人)。该疾病主要侵袭年轻妇女，并且女性与男性的比率约为9∶1。
系统性狼疮可以侵袭几乎身体的任何器官或系统。系统性狼疮可以包括即便有，也是极少症状是明显的(“减轻”)的时期和当疾病变得更加活跃(“突发”)的其它时期。大多数时候，当人们提到“狼疮”，他们是指该疾病的系统性形式。
皮质类固醇是治疗系统性自身免疫疾病的主要依靠。用高剂量的糖皮质激素(1-2mg/kg/天)治疗威胁生命、具有严重致残表现形式的SLE。慢性糖皮质激素的不理想效应包括一批显著有害效应诸如类库欣综合征体型，中枢肥胖症，高血压，感染，毛细血管脆性，多毛症，加速的骨质疏松症，白内障，糖尿病，肌病和精神病。除了皮质类固醇的毒性外，患者对剂量方案的依赖也引起了一个严重的问题。
还将细胞毒性试剂用于控制活动的疾病，减缓疾病突发的速度和减少对类固醇的需求。后者不理想的副作用包括骨髓阻抑，增加的条件性的生物的感染，不可逆的卵巢衰竭，脱发和增加恶性肿瘤的风险。
SLE是一种炎性疾病，迄今尚没有对其确定有效的治疗或疗法。该疾病导致急性和慢性的并发症。仅有的可利用的治疗方法是姑息剂，其目标在于减轻急性症状和预防慢性并发症，经常伴随深刻的副作用。因此，在这个领域有未满足的需要，并且医师和患者都将欢迎新的治疗方法，其可以潜在消除或减少该疾病有害的表现。
已经将基于人类单克隆抗-DNA 16/6Id抗体的互补决定区的肽公开于PCT国际公开号WO 02/067848 A2，所述互补决定区能免疫调节SLE关联的反应，特此将其全部内容并入作为参考。特别地，发现CDR1区抑制SLE患者的外周血淋巴细胞(PBL)对人类抗-DNA 16/6Id mAB的增生性反应，并且改善遭受自发或实验性的SLE折磨的小鼠的疾病表现。
显示于

图1的人类CDR1，化合物1，是一种基于表示为16/6Id的人类抗-dsDNA mAb的互补决定区1(CDR1)的19个氨基酸的合成肽(Waisman，A等.“Modulation of murine systemic lupus erythematosus withpeptides based on complementarity determining regions of pathogenicanti-DNA monoclonal antibodies.”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A(1997)，94(4)4620-4625)。
在实验SLE模型中-Balb/c小鼠和倾向SLE的小鼠，即(NZBxNZW)F1小鼠-用基于mCDR的肽或化合物1处理明显减少SLE相关的观察所见，肾中的显著免疫络合物沉积(ICD)，蛋白尿和白细胞减少症。该治疗方法对16/6Id的特异性抗体应答没有影响(Waisman，A等.“Modulation ofmurine systemic lupus erythematosus with peptides based on complementaritydetermining regions of pathogenic anti-DNA monoclonal antibodies.”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A(1997)，94(4)620；Eilat，E等，“Prevention of systemiclupus erythematosus-like disease in(NZBxNZW)F1 mice by treating withCDR1-and CDR3-based peptides of pathogenic autoantibody”J.Clin.Immunol.(2000)，20268；Eilat，E等“The mechanism by which apeptide based on complementarity determining region-1 of pathogenicanti-DNA antibody ameliorates experimental SLE”(2001)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.981148)。
这些肽，象许多肽一样，是不易溶解的。因此，需要提高这些肽溶解度的制剂。
发明概述本发明提供一种药物组合物，其包括水性载体；0.1mg/ml-20mg/ml的肽的药用盐的组合物，所述肽具有如下结构式NH2-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp IleGly-COOH(SEQ ID NO1)；和在水性载体中溶解肽的有效量的取代的β-环糊精，其中所述组合物具有介于4-9之间的pH。
本发明还提供一种药物组合物，其包括水性载体；0.1mg/ml-20mg/ml的肽的乙酸盐的组合物，所述肽具有如下结构式NH2-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp IleGly-COOH(SEQ ID NO1)；和70mg/ml-170mg/ml的七-(磺基丁基醚)-β-环糊精的组合物，其中肽和七-(磺基丁基醚)-β-环糊精溶解在水性载体中；和其中溶液具有介于6.5到8.5之间的pH。
本发明还提供一种缓和人类受试者系统性红斑狼疮(SLE)症状的方法，其包括向人类受试者施用有效量的任何上述药物组合物从而缓和人类受试者SLE的症状。
本发明还提供一种制备上述药物组合物的方法，其包括如下步骤a)制备预定浓度的取代的β-环糊精在水性载体中的溶液；b)将预定量的肽NH2-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gin Pro Pro GlyLys Gly Glu Glu Trp Ile Gly-COOH(SEQ ID NO1)的药用盐加入步骤a)溶液中；c)调节步骤b)的溶液的pH直到肽溶解在溶液中；和d)如果必要，调节步骤c)的溶液的pH到4-9，由此制备药物组合物。
本发明还提供一种冷冻干燥上述药物组合物的方法，其包括如下步骤a)将药物组合物的温度降到-40℃；b)在预定时间内保持温度在-40℃；c)将溶液的温度升高到20℃；d)在预定时间内保持温度在20℃；和e)将压力减到10μbar，由此冷冻干燥所述药物组合物。
本发明还提供一种冷冻干燥上述药物组合物的方法，其包括如下步骤a)将药物组合物的温度降到-45℃；b)在预定时间内保持温度在-45℃；c)将溶液的温度升高到-20℃；d)将溶液的温度升高到25℃；和e)在预定时间内保持温度在25℃，由此冷冻干燥所述药物组合物。
附图简述图1.作为乙酸盐的人类CDR1(化合物1)-显示hCDR1的分子式和结构式、氨基酸序列和物理参数图2.取自用化合物1和Captisol溶液处理的小鼠的细胞在随后用化合物1的PBS溶液激活后的IL-2分泌。
-■-化合物1(RS)50μg/小鼠-▲-化合物1(RS)200μg/小鼠-□-DP 50μg/小鼠-△-DP 200μg/小鼠-○-12％Captisolampulized图3.取自用化合物1溶液处理的小鼠的细胞在随后用化合物1的EM-1溶液激活后的IFN-γ分泌(2.5×106细胞/孔)。
-◆-安慰剂-●-化合物1 50μg/小鼠(处理剂量)-△-化合物1 100μg/小鼠(处理剂量)-×-化合物1 200μg/小鼠(处理剂量)
图4.取自用化合物1溶液处理的小鼠的细胞在随后用化合物1的EM-1溶液激活后的IFN-γ分泌(5×106细胞/孔)。
-◇-安慰剂-□-化合物1 25μg/小鼠-△-化合物1 50μg/小鼠-×-化合物1 100μg/小鼠-*-化合物1 200μg/小鼠图5.用在Captisol中的化合物1注射10次后，在(NZBxNZW)F1小鼠中的抗-dsDNA抗体[OD＝光密度；化合物1(C)＝化合物1溶解在Captisol中]-□-安慰剂-◇-化合物1 50μg/小鼠-○-化合物1 25μg/小鼠图6.来自(NZBxNZW)F1小鼠的肾切片，其显示免疫络合物沉积物的强度。上行切片来自用Captisol处理的小鼠，中行切片来自用50μg/小鼠的化合物1处理的小鼠，下行切片来自用25μg/小鼠的化合物1处理的小鼠。
放大左100倍，右400倍。FITC免疫组织学。
发明详述本发明提供一种药物组合物，其包括水性载体；0.1mg/ml-20mg/ml肽的药用盐的组合物，所述肽具有如下结构NH2-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp IleGly-COOH(SEQ ID NO1)；和在水性载体中溶解肽的有效量的取代的β-环糊精，其中所述组合物具有介于4-9之间的pH。
在一个实施方案中，肽的乙酸盐的浓度至少是0.5mg/ml。
在一个实施方案中，肽的盐的浓度是0.5mg/ml-10mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是0.5mg/ml-2.5mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是2.5mg/ml-5mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是5mg/ml-7mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是7mg/ml-8.5mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是8.5mg/ml-10mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是9mg/ml-10mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是10mg/ml-15mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是15mg/ml-20mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是1.0mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是2.5mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是5mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是10mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是15mg/ml。
在另一个实施方案中，盐的浓度是0.1mg/ml-0.5mg/ml。
在另一个实施方案中，盐的浓度是0.1mg/ml-0.2mg/ml。
在另一个实施方案中，盐的浓度是0.2mg/ml-0.3mg/ml。
在另一个实施方案中，盐的浓度是0.3mg/ml-0.4mg/ml。
在另一个实施方案中，盐的浓度是0.4mg/ml-0.5mg/ml.
在另一个实施方案中，所述组合物具有介于6.5-8.5之间的pH。
在另一个实施方案中，所述组合物具有介于7.5-8.5之间的pH。
在另一个实施方案中，所述组合物具有介于4-5之间的pH。
在另一个实施方案中，所述组合物具有介于5-6之间的pH。
在另一个实施方案中，所述组合物具有介于6-7之间的pH。
在另一个实施方案中，所述组合物具有介于7-8之间的pH。
在另一个实施方案中，所述组合物具有介于8-9之间的pH。
在另一个实施方案中，所述药用盐是乙酸盐。
在另一个实施方案中，所述取代的β-环糊精是羟丙基、磺基丁基醚或磺基丙基醚取代的β-环糊精。
在另一个实施方案中，所述取代的β-环糊精是磺基丁基醚取代的β-环糊精。
在另一个实施方案中，药用盐是乙酸盐，并且取代的β-环糊精是七-(磺基丁基醚)-β-环糊精。
在另一个实施方案中，所述组合物还包括药用缓冲剂，所述缓冲剂的量和类型适合于使药物组合物的pH在4-9的范围内。所述缓冲剂可以是乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂或碳酸钠。
本发明还提供一种药物组合物，其包括水性载体；0.1mg/ml-20mg/ml的肽的乙酸盐的组合物，所述肽具有如下结构式NH2-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp IleGly-COOH(SEQ ID NO1)；和70mg/ml-170mg/ml的七-(磺基丁基醚)-β-环糊精的组合物，其中肽和七-(磺基丁基醚)-β-环糊精溶解在水性载体中；和其中所述组合物具有介于6.5到8.5之间的pH。
在一个实施方案中，肽的乙酸盐的浓度是至少0.5mg/ml。
在一个实施方案中，肽的乙酸盐的浓度是0.5mg/ml-10mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的乙酸盐的浓度是0.5mg/ml-2.5mg/ml。
另一个实施方案中，盐的浓度是0.1mg/ml-0.5mg/ml。
在另一个实施方案中，盐的浓度是0.1mg/ml-0.2mg/ml。
在另一个实施方案中，盐的浓度是0.2mg/ml-0.3mg/ml。
在另一个实施方案中，盐的浓度是0.3mg/ml-0.4mg/ml。
在另一个实施方案中，盐的浓度是0.4mg/ml-0.5mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是5mg/ml-7mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是7mg/ml-8.5mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是8.5mg/ml-10mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是9mg/ml-10mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是10mg/ml-15mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是15mg/ml-20mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的乙酸盐的浓度是1.0mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的乙酸盐的浓度是2.5mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是5mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是10mg/ml。
在另一个实施方案中，肽的盐的浓度是15mg/ml。
在另一个实施方案中，七-(磺基丁基醚)-β-环糊精的浓度是120mg/ml并且所述组合物的pH介于7.5和8.5之间。
本发明还提供一种缓和人类受试者系统性红斑狼疮(SLE)症状的方法，其包括向人类受试者施用任何有效量的上述药物组合物从而缓和人类受试者SLE的症状。
本发明还提供将上述药物组合物用于治疗人类受试者的SLE。
本发明还提供一种制备任何上述药物组合物的方法，其包括如下步骤a)制备预定浓度的取代的β-环糊精在水性载体中的溶液；b)将预定量的肽NH2-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro GlyLys Gly Glu Glu Trp Ile Gly-COOH(SEQ ID NO1)的药用盐加入步骤a)溶液中；c)调节步骤b)的溶液的pH直到肽溶解在溶液中；和d)如果必要，调节步骤c)的溶液的pH到4-9，由此制备药物组合物。
在该方法的一个实施方案中，得到的取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度70mg/ml-170mg/ml。
在该方法的一个实施方案中，取代的β-环糊精的预定的浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是80mg/ml-170mg/ml的浓度。
在该方法的一个实施方案中，取代的β-环糊精的预定的浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是90mg/ml-170mg/ml的浓度。
在该方法的一个实施方案中，取代的β-环糊精的预定的浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是100mg/ml-170mg/ml的浓度。
在该方法的一个实施方案中，取代的β-环糊精的预定的浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是110mg/ml-170mg/ml的浓度。
在该方法的一个实施方案中，取代的β-环糊精的预定的浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是120mg/ml-170mg/ml的浓度。
在该方法的一个实施方案中，取代的β-环糊精的预定的浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是130mg/ml-170mg/ml的浓度。
在该方法的一个实施方案中，取代的β-环糊精的预定的浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是140mg/ml-170mg/ml的浓度。
在该方法的一个实施方案中，取代的β-环糊精的预定的浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是150mg/ml-170mg/ml的浓度。
在该方法的一个实施方案中，取代的β-环糊精的预定的浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是160mg/ml-170mg/ml的浓度。
在该方法的一个实施方案中，取代的β-环糊精的预定的浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是120mg/ml的浓度。
在另一个实施方案中，肽的预定量是导致肽在药物组合物中的最终浓度至少是0.1mg/ml的量。
在另一个实施方案中，肽的预定量是导致肽在药物组合物中的最终浓度至少是0.5mg/ml的量。
在另一个实施方案中，肽的预定量是导致肽在药物组合物中的最终浓度是2.5mg/ml、2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml或0.1mg/ml的量。
在另一个实施方案中，肽的预定量是导致肽在药物组合物中的最终浓度是5mg/ml、10mg/ml或15mg/ml的量。
在该方法的另一个实施方案中，步骤b)还包括混合溶液1小时。
在另一个实施方案中，在步骤c)中使用HCl或NaOH 1.0N调节pH。
在另一个实施方案中，该方法还包括经过乙酸纤维素滤器来过滤步骤d)的溶液。
在上述方法的另一个实施方案中，取代的β-环糊精的预定的浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是120mg/ml的浓度；肽预定的量是导致肽在药物组合物中的最终浓度是2.5mg/ml、2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml或0.1mg/ml的量；步骤b)还包括混合所述溶液1小时；和在步骤c)中使用HCl或NaOH 1.0N来调节pH，和该方法还包括经过乙酸纤维素滤器来过滤步骤d)的溶液。
本发明还提供用上述方法制备的组合物。
本发明还提供一种冷冻干燥上述药物组合物的方法，其包括如下步骤a)将药物组合物的温度降到-40℃；b)在预定时间内保持温度在-40℃；c)将溶液的温度升高到20℃；d)在预定时间内保持温度在20℃；和e)在预定时间内保持温度在25℃，由此冷冻干燥所述药物组合物。
在该方法一个实施方案中，步骤a)在2个小时内进行。
在另一个实施方案中，步骤b)在3小时内进行。
在另一个实施方案中，步骤c)进行13个小时。
在另一个实施方案中，步骤c)在110μbar的压力下进行。
在另一个实施方案中，步骤d)进行13个小时。
在另一个实施方案中，步骤d)是在110μbar的压力下进行。
在另一个实施方案中，在步骤e)中，压力被减到10μbar。
在另一个实施方案中，步骤e)进行5个小时。
在该方法另一个实施方案中，步骤a)在2个小时内进行；步骤b)在3个小时内进行；步骤c)进行13个小时，并且在110μbar压力下；步骤d)进行13个小时，并且在110μbar压力；和步骤e)进行5个小时，并且压力被减到10μbar。
本发明还提供通过上述方法制备的冷冻干燥的药物组合物。
本发明还提供一种冷冻干燥上述药物组合物的方法，其包括如下步骤
a)将药物组合物的温度降到-45℃；b)在预定时间内保持温度在-45℃；c)将溶液的温度升高到-20℃；d)将溶液的温度升高到25℃；和e)在预定时间内保持温度在25℃，由此冷冻干燥所述药物组合物。
在一个实施方案中，步骤a)在6个小时内进行。
在另一个实施方案中，步骤b)在3个小时内进行。
在另一个实施方案中，步骤c)进行19个小时。
在另一个实施方案中，步骤c)在150μbar的压力下进行。
在另一个实施方案中，步骤d)进行13个小时。
在另一个实施方案中，步骤d)在150μbar的压力下进行。
在另一个实施方案中，步骤e)进行8个小时。
在另一个实施方案中，步骤e)在150μbar的压力下进行。
在该方法另一个实施方案中，步骤a)在6个小时内进行；步骤b)在3个小时内进行；步骤c)进行19个小时并且在150μbar压力下；步骤d)进行13个小时并且在150μbar压力下；步骤e)进行8个小时并且在150μbar压力下。
本发明还提供通过任何上述方法制备的冷冻干燥的药物组合物。
在上述冷冻干燥的药物组合物的一个实施方案中，所述组合物的水含量少于5％。
在另一个实施方案中，所述组合物的水含量少于4.0％。
在另一个实施方案中，所述组合物的水含量少于3.5％。
本发明还提供冷冻干燥的药物组合物，其包括肽的药用盐，所述肽具有如下结构式NH2-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp IleArg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp Ile Gly-COOH(SEQ ID NO1)；和取代的β-环糊精。
本发明还提供包装的药物组合物，其包括包装材料；和预定量的上述冷冻干燥的药物组合物。
本发明的制剂可以通过胃肠道外地，局部地或直肠地给药。当然，它们以适合于每种给药途径的形式施用。例如，它们可以通过注射剂，吸入剂，软膏，栓剂等进行施用。通过注射剂，浸剂或吸入剂投药；通过洗剂或软膏局部给药；和通过栓剂直肠给药。
在用于本文时，短语“肠胃外的施用”和“经肠胃外施用”表示除肠内的和局部施用以外的通常通过注射的施用模式，包括但不局限于，静脉内的、肌内的、动脉内的、鞘内的、囊内的、眶内的、心内的、皮内的、腹膜内的、经气管的、皮下的、表皮下的、关节内的、囊下的、蛛网膜下的、脊柱内的、胸骨内的注射和灌输。
在用于本文时，短语“全身给药，”“通过全身给药，”“外周给药”和“通过外周给药”表示化合物、药物和其它物质除直接向中枢神经系统给药之外的给药，从而上述物质进入患者身体系统，并由此经历代谢，以及其它类似方法，例如皮下给药。
关于一般制剂方法和另外的赋形剂的信息的细节可以见于RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第20版。
从随后的实验细节将更好地理解本发明。但是，本领域技术人员将容易地理解具体方法和讨论的结果仅是对本发明的举例说明，所述发明在随后的权利要求更充分的描述。
实验详述实施例1开发化合物1的制剂人类hCDR1肽(化合物1)在2002年9月6日公开的PCT国际公开号WO 02/067848中进行了描述，并且可以通过本领域熟知的方法进行制备。(见，例如，PeptidesSynthesis，Structure and Applications，B.Gutte编辑，Academic Press，1995；Peptide Synthesis Protocols，M.Pennington和B.Dunn编辑，Humana Press，1994；Schnolzer，M等，“In situ neutralization inBoc-chemistry solid phase synthesis.Rapid，High yield assembly of difficultsequences.”Int.J.Pept.Protein Res.(1992)40180-193)。
化合物1是由19个氨基酸组成的合成的多肽。其作为乙酸盐提供。已经确定了该肽的水溶解度少于0.5mg/ml。图1显示作为乙酸盐的化合物1。
为了开发具有超过2mg/ml，优选地高达10mg/ml的肽浓度的制剂，进行了关于一些溶解度增强剂的实验。初步实验显示不容易获得2mg/ml的浓度。为了开发进行皮下注射的制剂，还需要pH在4-9的范围内和所述溶液是等渗的。
基于广泛的文献调查，采取了一些主要方法从而产生具有最大溶解度的制剂。考虑的因素是°pH调节和缓冲剂°溶剂°共-溶剂·溶解剂方法将化合物1单独或与其它赋形剂组合溶解在选定的溶解度增强剂的溶液中，并且将所述溶液搅拌至少一小时。如果需要，调节pH。肉眼观察该溶液以估计溶解度并进行分析试验测定。对于一些选定的制剂，还测试了其生物学活性。
结果表1表示了用于制剂开发的溶解度增强剂的类型。表2和表3总结了用各种溶解度增强剂进行的实验。表2总结了用在5-10mg/ml范围内的肽浓度进行的最初筛选。然后以较低剂量重复用较高肽浓度进行的实验工作(见表3)。
最初的实验显示化合物1在理想的pH水平，酸性和碱性，限定下，是更易溶解的，但是在碱性pH范围内稳定性较低。因此，测试了一些缓冲剂和pH调节剂，包括乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂和碳酸钠。最初测试的缓冲剂都没有获得理想的肽溶解度水平。只有在超过pH9.2和低于pH3.0时，观察到了2mg/ml的溶解度水平。但是，在起始阶段，选择了具有乙酸盐缓冲剂和柠檬酸盐缓冲剂(以甘露醇作为张力试剂)的制剂进行最初的毒性研究。对这些制剂进行了生物学活性测试并且证明它们是有活性的。
测试了非水性溶剂(见表1)诸如乙醇、丙三醇、丙二醇、Chremophore和它们的组合，但是它们没有增加化合物1的溶解度。30％的DMA(二甲基-乙酰胺)溶液产生了在理想范围内的溶解度(5-9mg/ml)，但是由于它的毒性特征而不适合于药物制剂。使用30％的(w/w)PEG 400也观察到了提高的溶解度(5-9mg/ml)。选择后种制剂进行毒性研究，但是已经证明了两者在生物学实验中都是没有活性的，并且可能已经是小鼠毒性研究中的一些不利效果的原因。因此，决定不继续进行这种制剂的研究。考虑到最初的实验，没有将非水性溶剂用在本制剂中。
测试了一些氨基酸(见表1)，包括L-精氨酸，L-谷氨酸，L-甘氨酸和L-赖氨酸以提高所述蛋白质的溶解度。L-精氨酸中的肽的溶解度在理想的水平上，但是得到的pH超过9。减少pH或使用精氨酸HCl盐的尝试导致了该肽的沉淀。还测试了人血清白蛋白并且其在低肽浓度上(1mg/ml)提高了该肽的溶解度(见表3)。但是，由于其潜在的免疫原性和较低的肽溶解度，没有将其使用在另外的实验中。
单独和与其它赋形剂组合一起测试了包括甘露糖醇，山梨糖醇和葡聚糖的填充剂(见表1)，但是它们没有提高肽在溶液中的溶解度。
单独和与其它赋形剂一起测试了包括聚山梨酯(Polysorbate)20和聚山梨酯80的共溶剂(见表1)。然而聚山梨酯的较低浓度(高达6％)没有提高肽的溶解度，而更高的浓度(高达10％-见表2)提高了肽的溶解度到2mg/ml。但是，认为这些高浓度的聚山梨酯不适合于药物制剂。
还测试了两种类型的环糊精羟丙基-β-环糊精和磺基丁基醚-β-环糊精(Captisol)，它们都被认可用在出售的胃肠道外产品中。两者都显著增加了肽的溶解度(对于羟丙基-β-环糊精，浓度在10mg/ml水平，对于Captisol为2.5)。测试了两种环糊精制剂的生物学活性并且发现其与单独肽的活性相等。
CAPTISOL是可以商购的聚阴离子β-环糊精衍生物，所述衍生物具有被丁基醚间隔基团从疏水空腔隔离的磺酸钠盐，或磺基丁基醚(SBE)。CAPTISOL是CyDex Inc.的七-取代的磺基丁基醚β-环糊精(SBE7-β-CD)制剂的商品名(www.captisol.com)。CAPTISOL的结构容许药物分子适合在疏水空腔中，由此从水性溶剂中分离该药物分子。因为CAPTISOL的外部表面是亲水的，因此增加了络合的药物分子的溶解度。环糊精提高药物分子的溶解度的应用公开于美国专利号5,134,127和5,376,645中，特此将其全部内容并入作为参考。
按照CyDex Inc.的文献，当通过胃肠道外进行施用时，CAPTISOL是安全的并且没有显示与β-环糊精关联的肾中毒性。与β-环糊精比较，CAPTISOL提供可比较的或更高的络合物特性以及超过90g/100ml的优越的水溶解度-50-倍的提高。
结论发现几种溶解度增强剂适合理想的溶解度范围DMA，PEG-400，二甲基-乙酰胺，聚乙二醇，聚氧化的(polyoxylated)蓖麻油，N-甲基-2-吡咯烷酮，1-乙烯基-2-吡咯烷酮，聚山梨酯20，聚山梨酯80，羟丙基-β-环糊精和磺基丁基醚-β-环糊精(Captisol)。在这些溶解度增强剂中，已经证明了两种环糊精就溶解度、生物学活性和稳定性来说都是优越的。因此，决定选择Captisol作为溶解度增强剂使用在实施例5的制剂中，和进一步研究两种环糊精制剂。实施例5临床研究的最终制剂由下列组成具有所需量的肽(0.5，1.0或2.5mg/ml)的120mg/ml的CAPTISOL水溶液，以及调节pH的HCl和NaOH。
表1使用在化合物1制剂开发中的溶解度增强剂
表2在化合物1肽制剂中评价的共溶剂和稳定剂的列表
表3在低肽浓度上的化合物1制剂
实施例2化合物1在Captisol中的溶液的制备方案标准溶解方法，诸如将干燥化合物1和干燥Captisol混合到水中或将化合物1添加到Captisol和水的制备溶液中，没有获得在所需浓度的彻底溶解。在各种pH水平上测试了一些不同浓度的化合物1和Captisol。但是，随后的产生化合物1在Captisol中的溶液的方法达到了在所需浓度的彻底溶解。
物质Captisol，化合物1和水方法1.称取适当量的Captisol从而得到120mg/ml的终浓度。
2.加入80％的最终量的水并且使用电磁搅拌器混合10分钟。
3.称取化合物1从而得到2.5mg/ml，2.0mg/ml，1.0mg/ml，0.5mg/ml或0.1mg/ml的最终浓度。
4.将肽加入Captisol溶液。混合1小时。
5.升高pH从而获得清液(在2.0mg/ml制剂中，pH可能需要升高到略高于9)。pH应该使用HCl 1.0N和NaOH 1.0N进行调节。混合10分钟。
6.如果需要，将pH校正在7.5-8.5的范围内(使用HCl或NaOH 1.0N)。
7.加水到最终体积。
8.通过0.2μ乙酸纤维素滤器过滤该溶液。
9.记录最终pH。
10.分配成等分试样并且在适当温度贮存。
实施例3化合物1和Captisol溶液的冷冻干燥本发明的冷冻干燥方法不同于其它冷冻干燥方法的地方在于在制剂中的固体百分比较高(12％)，而冷冻干燥的产品一般包含介于5％和10％之间的固体。
设备使用的冷冻干燥器是Edwards lyophilizer Lyoflex 0.6。在方法开发前，操作设备IQ/OQ并且通过质量保证进行适应性的检查。
制备0.5mg/ml、1.0mg/ml和2.5mg/ml的浓度的化合物1的化合物1和Captisol溶液。将最终体积调节到1ml(1.05gr)。
主要方法步骤1.冷冻2.保持(在低温)3.分两个阶段在真空下进行干燥3.1初级干燥-将盘架加热到最高保持温度，控制盘架的温度在最高保持水平。
3.2次级干燥-在最高保持盘架温度上，将压力减到最小值。
批次1-3冷冻-在2小时内从室温冷冻到-40℃。将盘架保持在-40℃ 3小时。
干燥-在110μbar压力下进行干燥。在13小时内将盘架温度升高到20℃，并且在此温度再保持13小时。
整个过程时间是31小时。
结果水含量结果是批次13.8％批次24.0％和批次34.9％批次4和5由于产生批次1，2和3的方法的水含量结果比理想值要更高，决定在相同的温度上和低压下加入次级干燥步骤。
干燥-在110μbar压力下进行干燥。在13小时期间将盘架温度增加到20℃，并且在此温度再保持13小时(批次4)或8小时(批次5)。将压力减到10μbar，保持另外的5小时。
整个过程时间是36小时。
结果水含量结果是批次4安慰剂3.0％1mg/ml3.9％。
批次5安慰剂4.1％结论如所示，开发了令人满意的化合物1和Captisol的冷冻干燥方法。由于固体的高百分比和因而产生的凝缩块，开发的方法比目前可获得的肽的冷冻干燥方法的周期要长，并且其显示了附加的次级干燥阶段。
表4总结了开发的方法。
表4
实施例4检查冷冻干燥的化合物溶液(DP，1mg/瓶，12％Captisol)的体内生物学活性通过在两个浓度上用冷冻干燥的化合物溶液，即药物产品(DP)进行皮下(s.c.)给药后，化合物1参比标准(RS)特异性T-细胞的IL-2的分泌抑制来监测生物学活性。处理的结果与用磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的化合物1(RS)处理小鼠的那些结果进行比较。这些结果显示于下面的表和图2中。
实验设计1.免疫 第0天(在所有四个脚垫，被CFA乳化的化合物1RS)2.处理(s.c.在颈背，在200μl溶液中)第0天3.体外活化，使用如下 第10天a.在0；0.5；1；2.5；5；10；25；50和100g/ml浓度上的化合物1RSb.化合物1的具有反向顺序的氨基酸的肽(阴性对照)。
c.Con A(阳性对照)。
4.培养物于37℃在加湿的5％CO2恒温箱中温育20小时。
5.通过ELISA测量IL-2。
实验组的表
体外用化合物1RS(pg/ml)激活后来自化合物1(DP)处理的小鼠中的IL-2的分泌
平均抑制45.6 60.4 46.8 63.7(％)(在5-100μg/ml范围内)BQL＝低于定量限制 NA＝没有可应用的1-4行没有包括在曲线内实施例5评价治疗的最佳剂量将下面的缩写词使用在随后的描述中CFA 完全弗氏佐剂ConA伴刀豆凝集素ADP 药物产品DS 药物物质(drug substance)EM-1富集的DCCM-1培养基EM-3富集的RPMI-1640+胎牛血清培养基FCS 胎牛血清IFN-γ γ-干扰素LN 淋巴结PBS 磷酸缓冲盐溶液RS 参比标准s.c.皮下的TB 锥虫蓝TGF-β 转化生长因子-βWFI 注射用水介绍用50μg/小鼠的化合物1RS免疫一组20只鼠。将免疫过的小鼠如下分成5个处理组安慰剂，25，50，100和200μg/小鼠的化合物1DP(皮下施用)。免疫和处理10天后，抽提LN并且制备单细胞混悬液。然后测量由于响应用几种浓度的化合物1RS进行的活化，由培养细胞体外分泌的IFN-γ和TGF-β。
实验设计1.免疫-第0天2.用化合物1DP处理 -第0天3.来自处理的小鼠的LN细胞的体外活化-第10天4.收集培养基
(进行IFN-γ测定) -第12天5.收集培养基(进行TGF-β测定) -第13天6.进行IFN-γ的ELISA7.进行TGF-β的ELISA表7实验组
材料和试剂动物小鼠20只雌性BALB/c小鼠，由Harlan动物饲养中心，Rehovot提供。免疫的年龄(星期十天)10包括在本实验中的小鼠的平均重量19.01gr。
材料一般试剂通过用纯化的水稀释96％的乙醇来制备70％的乙醇。
制备用于免疫的化合物1溶液如下制备CFA-化合物1RS乳剂(500μg/ml，50μg/小鼠)1.将1.874mg的化合物1溶解在1.87ml的WFI中从而产生1mg/ml的溶液。
2.用pH指示条测试溶液，发现其pH为5。
3.用1.5ml CFA乳化1.5ml的溶液，得到的最终浓度为500μg/ml。
制备用于处理的溶液通过皮下注射200μl的溶液来进行处理。
制备12％captisol溶液将1.2gr的captisol溶解在10ml的WFI中从而产生12％captisol溶液。
实验程序对小鼠进行称重免疫前对小鼠进行称重。平均小鼠重19.01±0.97gr。
免疫通过注射100微升的乳剂(每个后脚垫50微升)进行免疫。
处理免疫步骤后，通过在小鼠的颈背皮下注射200μl的设计的化合物1DP或12％captisol的处理溶液对小鼠进行处理。
体外培养通过颈脱位处死小鼠。从后腿中抽提LN并且将其转移到含约5mLRPMI灭菌培养皿中。通过对着200测微计网眼不锈钢网状物轻柔挤压组织来抽提细胞。收集细胞并且于室温在300G离心10分钟。
从每个实验组中的合并的LN中制备单细胞混悬液。
用在EM-1中的化合物1RS(0-100μg/ml)来培养2.5和5.0百万细胞/ml/孔的混悬液。
如细胞反应所指示，通过培养基的ELISA(IFN-γ，48小时和TGF-β，72小时)测定IFN-γ和TGF-β的分泌。
表8体外实验组
制备细胞混悬液表9细胞计算的结果和细胞混悬液(10×106/ml)的制备
细胞混悬液的制备(5×106/ml)通过将5ml的EM-1加入5ml的细胞混悬液中来1∶2的稀释10×106/ml的混悬液。
在48孔板中温育LN细胞培养物制备3个组织培养板。将随后的加入每个板中。
背景对照(用培养基培养细胞)0.5ml的细胞混悬液0.5ml的培养基(EM-1)系统阳性对照(用Con A刺激细胞)0.5ml的细胞混悬液0.5ml Con A(5ug/ml)的EM-1溶液(最终浓度2.5μg/孔)用化合物1活化溶液培养细胞(样品)0.5ml的细胞混悬液0.5ml化合物1RS 6.25-200μg/ml(最终浓度3.125-100μg/ml/孔)在96孔板中温育LN细胞培养物在制备48孔板后，通过从细胞混悬液中应用100μl和从活化溶液中应用100μl来制备96孔板。
将培养板在加湿的5％CO2恒温箱中在37℃温育48或72小时。
收集上清液将培养板于室温在300g离心10分钟。将上清(每孔850μl)转移到镜像板(mirror plates)或导管中。然后，将上清液分成工作等分试样(其中两个等分试样是200μl，一个等分试样是450μl)，以避免样品的反复冻融。每个导管标记以如下细节1)实验编码和温育后的时间。
2)组和样品编号。
3)激活剂和浓度。
4)小量(sup)收集的日期。
将上清液贮存在-20℃直到用于ELISA。
结果表10组的总结
表11-A最终细胞因子浓度最终细胞因子(pg/ml)(2.5百万个细胞/孔)
表11-B最终细胞因子浓度最终细胞因子(pg/ml)(5百万个细胞/孔)
这些结果还显示于图3-4中。
观察IFN-γ分泌1.在安慰剂组中，显示了化合物1体外激活后的线性剂量反应。该图表类似于由使用相同免疫剂量(50μg/小鼠)和培养基(EM-1)在来自体内的模型获得的图表。
2.在所有的测试组中，有化合物1体外激活后的剂量反应。
3.对于所有用于处理的剂量，显示了对IFN-γ的分泌的明显抑制(对于25μg/小鼠的处理剂量，平均95％的抑制)。可以发现在用于处理的剂量和抑制百分比之间的反向相关，主要地当使用5×106细胞/孔时。当使用2.5×106细胞/孔时，用50μg/小鼠对动物进行的处理显示了比100或200μg更好的抑制。25μg的点丢失(缺乏细胞)。
4.当使用5×106细胞/孔代替2.5×106细胞/孔时，观察到了更好的抑制。
5.在该图表的线性范围内，抑制百分比的SD较低。
6.当使用2.5×106细胞/孔时，关于Con A的技术性问题是显而易见的。
TGF-β分泌1.在安慰剂组中，用化合物1进行体外活化后，没有观察到剂量反应。在所有的其它处理组中，TGF-β的分泌水平低于ELISA的检测限度。
实施例6对用于注射的化合物1和Captisol(0，0.5，1.0和2.5mg/瓶)的冷冻干燥循环进行最优化目标本研究的目标是对用于注射的Captisol和化合物1的冷冻干燥循环进行最优化从而改进冷冻干燥块的形状和避免皱缩及裂解。因此决定对该冷冻干燥循环进行改进和最优化。将该循环转移到产品冷冻干燥器上进行I期的分批物的制备。
方法最优化制备在0.5mg/ml 1.0mg/ml，2.5mg/ml浓度上的肽的分批物和安慰剂，并且进行几个冷冻干燥循环。使用的冷冻干燥器是Edwards lyophilizerLyoflex 0.6。
测试了溶解度，水含量和块的外观。
按照获得的结果，选择了对化合物1的新的冷冻干燥循环。由于固体的高百分比(12％)和因而产生的浓缩块，新方法比实施例3中的冷冻干燥循环要长并且显示了附加的初级干燥阶段。表12总结了这些方法之间的差异。
表12
实施例7化合物1(在Captisol中施用的)对倾向SLE(NZBxNZW)F1雌性小鼠的狼疮症状的影响使用Captisols(磺基丁基醚β-环糊精钠)作为赋形剂，用化合物1对参与临床试验的受试者进行治疗。因为这个原因，重要的是确定在Captisols中给出的化合物1的制剂对(NZBxNZW)F1小鼠的处理与观察到的在用PBS中的化合物1对该品系小鼠的处理对狼疮症状是否将有着相同的有利影响。
为了这个目标，将(NZBxNZW)F1雌性小鼠(约8月龄)分成3组，单独用Captisol(n＝8)或用25μg/小鼠或50μg/小鼠在Captisols中的化合物1(分别地，n＝9和n＝10)对其进行皮下处理，1星期1次，共10星期。对这些剂量进行选择，因为以前的研究显示这个范围内的剂量在改善SLE症状上比测试的更高剂量(100和200μg/小鼠)更有效。将相同批次的药物物质使用在本研究和使用化合物1的初次I期临床研究中。
跟踪小鼠进行抗-dsDNA抗体和蛋白尿的观察。当将小鼠处死后，检测肾中的ICD强度。
如在图5可见的，进行10次注射处理后，在组之间没有观察到dsDNA-特异性抗体水平的明显不同。
表13还显示从第5次注射开始，可以观察到用化合物1处理的有利效果，并且其持续直到第10次注射。在Captisol对照组中的蛋白尿的平均水平持续高于化合物1-处理组。表13还显示在两个化合物1剂量组中的肾中都观察到ICD强度的减少。有一个整体趋势显示在减少这些小鼠中的SLE的临床症状上较低剂量(25μg/小鼠)比较高剂量(50μg/小鼠)更加有效。
表13.使用25或50μg/小鼠的化合物1(在Captisol中)处理的(NZBxNZW)F1小鼠的SLE临床症状
aICD＝免疫络合物沉积物。ICD强度等级0＝无；1＝中等；2＝重度；3＝重度/非常强。
b具有高水平蛋白尿的一只动物的死亡导致了较低的组平均值。
cp＜0.05(与Captisol处理的对照小鼠比较；Mann-Whitey)。
图6显示来自每个处理组的一个肾的代表性切片。上行切片来自Captisol处理小鼠，中行切片来自用50μg/小鼠的化合物1处理的小鼠，下行切片来自用25μg/小鼠的化合物1处理的小鼠。可见在使用任一剂量水平的化合物1(溶解在Captisol中)处理的小鼠的肾中观察到的免疫络合物沉积物的强度比在对照组中观察到的要低得多。
实施例8I期临床研究进行I期的、多中心的、随机的、双盲的、安慰剂控制的、单剂量的、四臂(four arm)的研究从而评估在SLE受试者中皮下注射在Captisol中的化合物1的耐受性和安全性。
这是在法国进行的，关于在Captisol中的化合物1在人类中的首次临床研究。其主要目标是评价在Captisol中的化合物1作为单一皮下注射施用到SLE受试者中的耐受性和安全性。其次要目标是在向这些受试者施用单一皮下剂量的在Captisol中的化合物1后，对免疫反应进行评价。
三十六(36)个受试者参与了该研究。要符合参与本研究的条件，SLE患者必须满足至少四个由美国Rheumatology大学使用的诊断狼疮的标准。患者必须还已经具有稳定的、轻微的/中等的疾病和在SLE疾病活性指数，SLEDAI上少于或等于10的得分。
按照如下组的分配，每个患者接受注射用重构的化合物1或其匹配的安慰剂(Captisol)的单一皮下注射·A组安慰剂(Captisol)·B组在Captisol中的0.5mg化合物1·C组在Captisol中的1mg化合物1·D组在Captisol中的2.5mg化合物1在筛选时，在给药日，在给药24小时后和在给药后2，4和8星期后，进行一组标准的安全测试，其包括收集血液和尿液进行实验室测试。在给药之前，和在预定的随访时，抽取血液样品进行SLE-相关的免疫学测试，抗-化合物1抗体和PBL增殖分析。进行如下的免疫学测试°库姆斯试验(直接和间接)°C3，C4和CH 50°总IgG，IgM和IgA°ANA，抗-dsDNA(Farr分析)，抗-ssDNA
°抗-ENA(包括抗-La，抗-Ro，抗-RNP，抗-Sm)°抗-心磷脂抗体°VDRL·FTA抗体·类风湿因子在如下标准的基础上评价受试者群体中在Captisol中的化合物1的耐受性和安全性·AEs的发生，包括SLE的突发·生命体征·12-前导ECG·身体检查中的变化·常规临床实验室测试·SLEDAI评分·免疫学测试结果Ia期临床实验详情主要研究者和各自研究地点法国的六(6)个研究中心Jean Charles Piette教授(La Pitie Salpetriere医院，巴黎)，Oliver Meyer教授(Bichat医院，巴黎)，Jean Revuz教授(HenriMondor医院，Creteil)，Loic Guillevin教授(Avicenne医院，Bobigny)，EricHachulla教授(Claude Huriez医院，Lille Cedex)，Xavier Mariette教授(Bicetre医院，Kremlin Bicetre)。
化合物1(在Captisol中)、安慰剂、注射安瓿用的水，施用剂量和方式将瓶装的在Captisol中的化合物1(120mg/瓶)作为单一剂量以如下剂量皮下注射到每个受试者中0.5mg在Captisol中的化合物1/瓶，1mg在Captisol中的化合物1/瓶和2.5mg在Captisol中的化合物1/瓶。
化合物1的安慰剂120mg的Captisol/瓶(外观上与在Captisol中的化合物1的小瓶相同)
方法学这是一个使用化合物1或安慰剂的单一皮下注射，多-中心、随机；双盲，安慰剂控制、四-臂(four-arm)的研究。在基准方法开始之前，对SLE患者的筛选多至21天。将每个合格的受试者随机分到4个处理组之一皮下注射0.5，1或2.5mg的化合物1或其匹配的安慰剂。容许所有的受试者在给药日前进入临床。每个受试者接受上面列出的处理方法之一的单剂量。受试者在给药后24小时出院。在给药后的第2，4和8周对受试者进行进一步监测。在筛选时，在服药日(给药前)，在第2天(给药后)，在2，4和8周(终局访问)，抽取血液样品(血清和全血)进行安全性实验室测试。在筛选时，在服药日(给药前)，在第4和8周时，抽取血液样品进行免疫学测试。在服药日(服药前)和第2，4和8周评价外周血淋巴细胞(PBL)增殖。
受试者数量(总共的和每个处理组的)将三十六(36)个受试者如下随机分配在本研究中；9个受试者在0.5mg处理组中，9个受试者在1mg处理组中，10个受试者在2.5mg处理组中，以及8个受试者在安慰剂处理组中。
对参与的诊断和主要标准这项研究的合格的受试者是符合美国Rheumatology大学(ACR)的至少四个诊断标准的SLE患者。他们的疾病状况必需是稳定的，轻微到中度并且在2000年更新的SLE疾病活性指数(SLEDAI 2K)上的得分等于或少于10。
被排除在外的SLE患者是据报道在研究筛选之前的6个月中病情是不稳定的或有严重哮喘，中风，急性心肌梗塞，不稳定的咽痛，脑出血和肺栓塞。将具有任何临床上明显或不稳定医学或外科状况，糖尿病，肝病(肝硬化、活动性肝炎、门静脉高血压，和/或腹水)，临床上显著的高血压，任何恶性肿瘤的医疗史，组织断离(dialysis)，或慢性阻碍性肺疾病(COPD)的SLE患者也排除在参与研究之外。
还将在筛选前的3个月中经历血浆取出或使用下列药物之一进行过治疗的SLE患者排除在外泼尼松30mg/天或更多(或相等剂量的另一种皮质类固醇)，静脉内的皮质类固醇，静脉内的免疫球蛋白G(IgG)，口服抗凝药和任何细胞毒性试剂(例如，硫唑嘌呤，苯丁酸氮芥，环磷酰胺，麦考酚酸吗乙酯，甲氨蝶呤(methothrexate)，他克莫司)。
此外，还将在筛选前最近3个月中，用皮质类固醇(超过±10mg/天的泼尼松或相等剂量的另一种皮质类固醇)和/或抗疟疾药开始治疗的SLE患者排除在外。
尽管努力在整个研究过程中保持基准SLE医学处理，但是研究者可以在研究中的任何时间改变参与者的医学处理从而维持患者的利益和对其进行最佳化。
评价标准安全性在筛选中，住院治疗中和在包括终局访问的跟踪随访中评定如下的安全性参数生命体征(收缩血压，舒张血压，脉搏，氧饱和，温度和体重)，12-导程ECG(12-lead ECG)，身体检查中的变化和临床常规实验室安全性测试。在服药日和以后的每次访问中记录不利的事件。
免疫在筛选中，住院治疗中和在包括随后的访问中进行SLE-相关的免疫学测试。
随后使用PBL增殖分析和抗-化合物1抗体分析在给药日和包括终局慰问的随后访问中进行药物-关联的免疫学反应。
疾病活动度在筛选中，住院治疗中和包括终局访问的随后访问中使用2000年更新的SLE疾病活性指数(SLEDAI 2K)评分，来评定疾病活动度。
统计方法将SAS9.0版软件用于分析和表示在本研究中收集的数据。对于该Ia期的研究，没有进行能力计算(power calculation)和公式假说检验。
不利的体验不利体验的发生率和频率由系统器官分类(System Organ Class)和按照MedDRA字典5.0版优选的术语学表示。按照处理组，将数据制成表格。
临床实验室数据确定筛选、第一天(服药前)、第二天、第2周，第4周和第8周由处理组给出的实验室数值的描述统计，其包括观察的数量，平均值，标准偏差，最小值和最大值。每次访问的从基线到每个时间点/访问的变化也按照处理的指派给出。异常结果的百分比(在可应用处，低和高)由处理组和访问/时间点在参数基础上给出。进行从基线到给药后24小时和从基线到终局访问的变化分析。
生命体征确定筛选、第一天(服药前和服药后，并且在每个时间点)、第二天，第2周，第4周和第8周的生命体征的描述统计，其包括观察的数量，平均值，标准偏差，中值，最小值和最大值，并按照指派的处理组制成表格。从基线到每个时间点/访问的变化由访问和处理的指派给出。
体重由处理组给出在基线，终局和从基线的变化上的重量(kg)的描述统计。
ECG给出了在基线，终局和从基线变化上的ECG参数的描述统计。将变化分析表示为在正常/异常或存在/缺乏ECG参数之间从基线到终止的变化表。按照以前阐述的标准来确定潜在地临床上地显著性(PCS)QTc(Bazett)测量。给出了在PCS和非-PCS绝对QTc(Bazett)之间的变化分析表以及在从基线到任何访问的QTc(Bazett)中的PCS变化的发生率表。
身体检查通过在基线和终局访问上每个身体系统具有正常或异常发现的受试者的发生率来分析身体检查结果。还应用了在正常到异常或异常到正常之间的变化分析。当从基线开始没有发生变化时，将其定义为“其它”。
与化合物1相关的免疫学测试对于免疫学参数，由处理组和访问计算和给出了描述统计，其包括观察的数量，平均值，标准偏差，中值，最小值和最大值。从基线到每次随访的变化也由处理组给出。在可应用处，具有阴性/阳性结果的受试者的数量和百分比由处理组和访问给出。
SLEDAI 2K给出SLEDAI 2K的描述统计，其包括平均值，标准偏差，中值，最小值和最大值。
Ia期临床研究的结果受试者素质和SLE特性三十六(36)个研究受试者参加并且依照协议完成该项研究。在所有处理组中的大部分受试者(34)是女性(94.4％)，和高加索人(30，83.3％)。所有处理组的平均年龄是35.6岁(平均的范围从32岁-39岁)。大部分受试者(91.7％)具有在4-6之间的美国Rheumatology大学(ACR)的诊断标准和在2.1-4.1范围内的平均组SLEDAI 2K评分。
安全性结果在AEs的发生率中，在研究药物处理组和安慰剂组之间没有显著的差异。在所有组中，大部分常见的AEs是头痛，在性质上将其分成轻微或中度，以及注射部位反应，从性质上将其分成轻微的。没有观察到剂量反应。在研究过程中，没有发生严重的不利事件(SAE)或划分为严重的AE。
对于血液学、生物化学或尿液分析的评价，未见可归因于研究药物的临床上的显著影响。
对于生命体征参数(收缩血压，舒张血压，脉搏，氧饱和)而言，未见可归因于研究药物的临床上的显著影响。
对于温度和重量而言，未见可归因于研究药物的临床上的显著影响。
对于绝对ECG测量法和数字化的ECG参数而言，在化合物1处理组和安慰剂组之间，未见临床显著性的差异。没有来自基准＞60msec的PCSQTc绝对值和QTc的变化被记录。在化合物1处理组和安慰剂组中相似数目的受试者具有来自介于30和60msec之间基准的QTcB变化。
身体检查后，没有化合物1的临床上的显著效果被指出。
免疫学结果对来自所有受试者的血清样品的评价显示以0.5，1和2.5mg/患者的剂量进行的化合物1的单一皮下施用没有诱导抗-化合物1的特异性抗体的发展。7个受试者具有超出截止的对化合物1的反应。这些提高水平的抗体在服药前已经存在。在本研究随后的阶段(2个月)，没有观察到抗体水平的增加。对这些受试者的血清进行反应性抗体的同种型分析。其中两个受试者的反应与IgM同种型相关联和两个其他受试者与IgG同种型相关联。这7个受试者都没有特异性IgE抗体。
外周血淋巴细胞(PBL)分析显示50％的受试者(18)被划分为在所有处理组中具有相似分布的反应者(SI＞2)。考虑仅施用了单一SC剂量的本研究药物，T细胞的应答相当低并且不能检测到用于分析的化合物1处理剂量或浓度与反应者/非反应者状况之间的关联。同样，随时间过去，没有观察到反应者状况的提高的发生率的迹象。用作安全性对照的破伤风类毒素(TTX)分析显示在所有的处理组中，在整个研究阶段中，对TTX的反应一直保持，这说明在captisol中的化合物1没有改变针对TTX记忆抗原的免疫学反应。
免疫学观察所见是仅施用单一剂量的本研究药物化合物1的结果。
疾病活动性结果在研究过程中，除了在0.5mg处理组中的一个受试者被记录了其在显示脓尿的尿液分析基础上在基准和第4周之间2-10分的SLEDAI评分中的变化外，没有记录到化合物1在SLEDAI评分上的临床上显著影响(≥3，≤12分的变化)。按照方案定义，研究者没有证实将这种尿液分析观察所见结果作为狼疮突发，并且将其决定为不具有处理的变化。
结论这种Ia期研究显示在120mg Captisol中的0.5，1或2.5mg的化合物1的单一皮下注射剂量是安全的并且可被较好的耐受，并且容许其延续到Ib期多剂量研究中。
实施例9Ib期临床研究进行I期的、多中心的、两个国家的、随机的、双盲的、四臂的、安慰剂控制的、多剂量的研究从而评估在SLE受试者中皮下注射在Captisol中的化合物1的耐受性和安全性。
进行该项研究是为了评价向SLE患者重复进行化合物1的皮下施用的安全性和耐受性。本研究的次要目标是在重复向SLE受试者进行在Captisol中的化合物1的皮下施用后评价免疫学反应。
以在Captisol中的0.5、1.0或2.5mg的剂量进行化合物1的给药。将研究产品每隔一天(排除周末)进行施用，总共12次皮下注射，即每星期3次剂量，总共4星期。开始给药后，在第2，4，8和12周按计划访问对受试者进行监控。使用与上述Ia期的临床研究中所述的那些相似的测试来评价安全性和耐受性。
结果该Ib期研究显示多次皮下注射在120mg Captisol中的0.5、1或2.5mg剂量的化合物1是安全的，并且被较好的耐受。
权利要求
1.一种药物组合物，其包括水性载体；0.1mg/ml-20mg/ml的肽的药用盐的组合物，所述肽具有如下结构式NH2-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp IleGly-COOH(SEQ ID NO1)；和在水性载体中溶解肽的有效量的取代的β-环糊精，其中所述组合物具有介于4-9之间的pH。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述肽的盐的浓度至少是0.5mg/ml。
3.权利要求2的药物组合物，其中所述肽的盐的浓度至少是0.5mg/ml-10mg/ml。
4.权利要求3的药物组合物，其中所述肽的盐的浓度至少是0.5mg/ml-2.5mg/ml。
5.权利要求1-4任何一项的药物组合物，其中所述组合物具有介于6.5-8.5之间的pH。
6.权利要求5的药物组合物，其中所述组合物具有介于7.5-8.5之间的pH。
7.权利要求1-6任何一项的药物组合物，其中所述药用盐是乙酸盐。
8.权利要求1-7任何一项的药物组合物，其中取代的β-环糊精是羟丙基、磺基丁基醚、或磺基丙基醚取代的β-环糊精。
9.权利要求8的药物组合物，其中取代的β-环糊精是磺基丁基醚取代的β-环糊精。
10.权利要求7的药物组合物，其中取代的β-环糊精是七-(磺基丁基醚)-β-环糊精。
11.权利要求1-10的任何一项的药物组合物，其还包括药用缓冲剂，所述缓冲剂的数量和类型适合于使所述药物组合物的pH在4-9的范围内。
12.一种药物组合物，其包括水性载体；0.1mg/ml-20mg/ml的肽的乙酸盐的组合物，所述肽具有如下结构式NH2-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp IleGly-COOH(SEQ ID NO1)；和70mg/ml-170mg/ml的七-(磺基丁基醚)-β-环糊精的组合物，其中所述肽和七-(磺基丁基醚)-β-环糊精溶解在水性载体中；和其中所述组合物具有介于6.5到8.5之间的pH。
13.权利要求12的药物组合物，其中所述肽的乙酸盐浓度至少是0.5mg/ml。
14.权利要求13的药物组合物，其中所述肽的乙酸盐浓度为0.5mg/ml-10mg/ml。
15.权利要求13的药物组合物，其中所述肽的乙酸盐浓度为0.5mg/ml-2.5mg/ml。
16.权利要求13的药物组合物，其中七-(磺基丁基醚)-β-环糊精的浓度是120mg/ml，并且其中所述组合物的pH介于7.5和8.5之间。
17.权利要求16的药物组合物，其中所述肽的乙酸盐浓度是1.0mg/ml。
18.权利要求16的药物组合物，其中所述肽的乙酸盐浓度是2.5mg/ml。
19.一种缓和人类受试者系统性红斑狼疮(SLE)症状的方法，其包括向人类受试者施用有效量的权利要求1-18任何一项的药物组合物从而缓和人类受试者SLE的症状。
20.权利要求1-18任何一项的药物组合物在治疗人类受试者的SLE中的应用。
21.一种制备权利要求1-18任何一项的药物组合物的方法，其包含下述步骤a)制备预定浓度的取代的β-环糊精在水性载体中的溶液；b)将预定量的肽NH2-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro GlyLys Gly Glu Glu Trp Ile Gly-COOH(SEQ ID NO1)的药用盐加入步骤a)溶液中；c)调节步骤b)的溶液的pH直到所述肽溶解在溶液中；和d)如果必要，调节步骤c)的溶液的pH到4-9，由此制备药物组合物。
22.权利要求21的方法，其中取代的β-环糊精的预定浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是70mg/ml-170mg/ml的浓度。
23.权利要求22的方法，其中取代的β-环糊精的预定浓度是导致取代的β-环糊精在药物组合物中的最终浓度是120mg/ml的浓度。
24.权利要求2 1的方法，其中肽的预定量是导致所述肽在药物组合物中的最终浓度至少是0.1mg/ml的量。
25.权利要求21的方法，其中肽的预定量是导致所述肽在药物组合物中的最终浓度至少是0.5mg/ml的量。
26.权利要求21的方法，其中肽的预定量是导致所述肽在药物组合物中的最终浓度是2.5mg/ml，2.0mg/ml，1.0mg/ml，0.5mg/ml或0.1mg/ml的量。
27.权利要求21的方法，其中步骤b)还包括混合所述溶液1小时。
28.权利要求21的方法，其中在步骤c)中使用HCl或NaOH 1.0N调节pH。
29.权利要求21的方法，其还包括通过乙酸纤维素滤器过滤步骤d)的溶液。
30.权利要求21的方法，其中取代的β-环糊精的预定浓度是导致所述取代的β-环糊精在所述药物组合物中的最终浓度是120mg/ml的浓度；肽的预定量是导致肽在所述药物组合物中的最终浓度是2.5mg/ml，2.0mg/ml，1.0mg/ml，0.5mg/ml或0.1mg/ml的量；步骤b)还包括混合溶液1小时；和在步骤c)中使用HCl或NaOH 1.0N调节pH，其还包括通过乙酸纤维素滤器过滤步骤d)的溶液。
31.通过权利要求21-30任何一项的方法制备的药物组合物。
32.一种冷冻干燥权利要求2的药物组合物的方法，其包括如下步骤a)将所述药物组合物的温度降到-40℃；b)在预定时间内保持温度在-40℃；c)将溶液的温度升高到20℃；d)在预定时间内保持温度在20℃；和e)降低压力和在预定时间内保持温度在20℃，由此冷冻干燥所述药物组合物。
33.权利要求32的方法，其中步骤a)在2小时内进行。
34.权利要求32的方法，其中步骤b)在3小时内进行。
35.权利要求32的方法，其中步骤c)进行13小时。
36.权利要求32的方法，其中步骤c)在110μbar压力下进行。
37.权利要求32的方法，其中步骤d)进行13小时。
38.权利要求32的方法，其中步骤d)在110μbar压力下进行。
39.权利要求32的方法，其中在步骤e)中，将压力减到10μbar。
40.权利要求32的方法，其中步骤e)进行5小时。
41.权利要求32的方法，其中步骤a)在2个小时内进行；步骤b)在3个小时内进行；步骤c)进行13个小时并且在110μbar压力下进行；步骤d)进行13个小时并且在110μbar压力下进行；和步骤e)进行5个小时并且压力被减到10μbar。
42.通过权利要求32-41任何一项的方法制备的冷冻干燥的药物组合物。
43.一种冷冻干燥权利要求2的药物组合物的方法，其包括如下步骤a)将所述药物组合物的温度降到-45℃；b)在预定时间内保持温度在-45℃；c)将溶液的温度升高到-20℃；d)将溶液的温度升高到25℃；和e)在预定时间内保持温度在25℃，由此冷冻干燥所述药物组合物。
44.权利要求43的方法，其中步骤a)在6小时内进行。
45.权利要求43的方法，其中步骤b)在3小时内进行。
46.权利要求43的方法，其中步骤c)进行19小时。
47.权利要求43的方法，其中步骤c)在150μbar压力下进行。
48.权利要求43的方法，其中步骤d)进行13小时。
49.权利要求43的方法，其中步骤d)在150μbar压力下进行。
50.权利要求43的方法，其中步骤e)进行8小时。
51.权利要求43的方法，其中步骤e)在150μbar压力下进行。
52.权利要求43的方法，其中步骤a)在6小时内进行；步骤b)在3小时内进行；步骤c)在150μbar压力下进行19小时；步骤d)进行13小时并且在150μbar压力下进行；和步骤e)进行8小时并且在150μbar压力下进行。
53.通过权利要求43-52任何一项的方法制备的冷冻干燥的药物组合物。
54.权利要求53的冷冻干燥的药物组合物，其中所述组合物的水含量少于5％。
55.权利要求54的冷冻干燥的药物组合物，其中所述组合物的水含量少于4.0％。
56.权利要求55的冷冻干燥的药物组合物，其中所述组合物的水含量少于3.5％。
57.一种冷冻干燥的药物组合物，其包括肽的药用盐，所述肽具有如下结构式NH2-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu GluTrp Ile Gly-COOH(SEQ ID NO1)；和取代的β-环糊精。
58.一种包装的药物组合物，其包括包装材料；和预定量的权利要求57的冷冻干燥的药物组合物。
全文摘要
本发明提供一种药物组合物，其包括水性载体；0.1mg/ml－20mg/ml的肽的药用盐的组合物，所述肽具有如下结构式NH
文档编号A61K39/38GK1761477SQ200480006991
公开日2006年4月19日 申请日期2004年1月14日 优先权日2003年1月14日
发明者S·科恩-韦雷德, E·纳夫塔利, V·魏因施泰因, A·吉尔贝特, E·克林格尔 申请人:特瓦制药工业有限公司